甜菊品種DUS測試指南的研制

王顯生，王仲偉，李華勇，黃蘇珍*，王艷萍，張繼紅，吳燕，沈奇*

甜菊品種DUS測試指南的研制

王顯生1，王仲偉2，李華勇1，黃蘇珍2*，王艷萍1，張繼紅1，吳燕1，沈奇1*

（1.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院糧食作物研究所/農(nóng)業(yè)部植物新品種測試（南京）分中心，南京210014；2.江蘇省中國科學(xué)院植物研究所（南京中山植物園），南京210014）

植物新品種特異性（Distinctness）、一致性（Uniformity）和穩(wěn)定性（Stability）（簡稱為DUS）測試指南，是進行植物品種DUS測試的技術(shù)文件。通過連續(xù)兩個生長周期的試驗觀測，編制了甜菊品種DUS測試指南。主要闡述了甜菊測試指南的研制原則、編制過程和主要內(nèi)容。

甜菊；新品種保護；DUS測試；指南；研制

甜菊（Stevia rebaudiana Bertoni.）又名甜葉菊、甜草，為菊科多年生草本植物，原產(chǎn)于南美洲巴拉圭、巴西。1975年的廣交會上甜菊首次進入我國，但成功引種是1976年江蘇省中國科學(xué)院植物研究所從日本引種成功[1-2]。現(xiàn)在我國北緯20～46°范圍內(nèi)都有種植。甜菊葉片中的甜菊糖具有高甜度和低熱性，特別適用于食品工業(yè)和醫(yī)藥上。20世紀80年代初甜菊糖提取加工業(yè)逐漸興起，經(jīng)過30多年的發(fā)展，目前我國已是世界上最大的甜菊栽培和甜菊糖生產(chǎn)與出口國，并形成了相對成熟、穩(wěn)定和完整的甜菊糖產(chǎn)業(yè)鏈，且已在國際競爭中占據(jù)著相對的優(yōu)勢。為了保護我國國內(nèi)甜菊品種資源和知識產(chǎn)權(quán)，研制甜菊DUS測試指南成為當(dāng)務(wù)之急。

我國于1999年4月24日加入國際植物新品種保護聯(lián)盟（簡稱UPOV），成為第39個成員國，同年頒布實施《中華人民共和國植物新品種保護條例實施細則（農(nóng)業(yè)部分）》，開始接受國內(nèi)外植物新品種權(quán)申請。1997年頒布的《中華人民共和國植物新品種保護條例》規(guī)定，授權(quán)品種必須是在我國植物新品種保護目錄范圍內(nèi)，且具有新穎性、特異性（Distinctness）、一致性（Uniformity）和穩(wěn)定性（Stability），并有適當(dāng)命名的植物新品種。國家審查機構(gòu)根據(jù)相關(guān)植物新品種DUS測試指南對該品種進行特異性、一致性和穩(wěn)定性測試（簡稱DUS測試）[3]。DUS測試指南既是測試機構(gòu)開展DUS測試工作的技術(shù)手冊，同時還是審批機關(guān)審查新品種特異性、一致性和穩(wěn)定性的技術(shù)標準。自我國開展植物新品種保護工作以來，截止2014年，已研制完成了適合我國使用的水稻、玉米和小麥等200多個農(nóng)業(yè)植物新品種DUS測試指南。2014年本單位承擔(dān)了農(nóng)業(yè)部品種資源保護項目“甜菊新品種DUS測試指南的研制”，依據(jù)國家標準《植物新品種特異性、一致性和穩(wěn)定性測試指南總則》［4］，并遵循UPOV對DUS測試規(guī)定的總原則（TG/1/3）及配套規(guī)定的DUS測試指南編制的系列文件（TGP系列文件）［5-9］，開展該指南的研制工作。

1　研制原則和過程

1.1研制目標和原則

以《植物新品種特異性、一致性和穩(wěn)定性測試指南總則》（GB/T 19557.1-2004）[4]、《植物新品種特異性、一致性和穩(wěn)定性審查和性狀統(tǒng)一描述總則》[10]和《植物新品種測試指南的研制》（UPOV TGP/7/2）[7]等文件為指導(dǎo)，根據(jù)我國甜菊育種水平和生產(chǎn)現(xiàn)狀，研制出符合我國國情和國際慣例的科學(xué)、準確、可操作性強的甜菊DUS測試指南，通過審定后作為我國開展甜菊品種DUS測試的技術(shù)標準。

指南研制過程中遵循以下7條原則：①以科學(xué)、準確、權(quán)威為編寫指南的指導(dǎo)思想；②盡量收集鑒定技術(shù)較為成熟的甜菊性狀，以使本指南有較好的適應(yīng)能力；③用國際上通用的鑒定方法，與國際接軌；④以主要的植物形態(tài)特征為主，其他性狀為輔。在主要植物形態(tài)特征不能區(qū)分新品種與近似品種時，方采用其他性狀；⑤方法規(guī)范，條件統(tǒng)一，有較好的可操作性；⑥性狀排列的順序遵循植物學(xué)順序；⑦標準品種的選擇，盡量采用性狀表達穩(wěn)定，易獲得的品種。

1.2研制過程

1.2.1收集整理種質(zhì)資源上世紀80—90年代末期，我國從事甜菊育種研究的單位有江蘇省中國科學(xué)院植物研究所、中國農(nóng)科院、山東淄博市農(nóng)科所、浙江亞熱帶作物所等單位，先后育出云日、云賓、186、187、中山1號等甜菊品種。其中，江蘇省中國科學(xué)院植物研究所在種質(zhì)資源收集、保存、育種、評價等方面是國內(nèi)領(lǐng)先的單位，現(xiàn)已保存有甜菊種質(zhì)資源100余份，品種資源15個，包括兩個日本守田系列品種和國內(nèi)其它一些栽培品種資源。自2013年起，我們在原有基礎(chǔ)上收集甜葉菊品種資源，通過引種及市場購買等方式又搜集到20余份種質(zhì)資源。經(jīng)過比較、篩選，最終確定了有代表性的36份種質(zhì)作為指南研制材料，進行田間試驗。

1.2.2確定測試性狀及其表達狀態(tài)DUS測試指南的核心內(nèi)容是測試性狀及其表達狀態(tài)。測試性狀的觀測結(jié)果是品種特異性、一致性和穩(wěn)定性審查的主要依據(jù)。因此測試性狀的選擇極為重要。根據(jù)國家標準《植物新品種特異性、一致性和穩(wěn)定性測試指南總則》中的規(guī)定，DUS測試性狀應(yīng)滿足以下6條基本要求：a）是特定的基因型或基因型組合的作用結(jié)果；b）在特定環(huán)境下，具有足夠的一貫性和可重復(fù)性；c）為確定特異性，品種間表現(xiàn)出足夠的差異；d）能夠被準確定義和識別；e）滿足一致性要求；f）滿足穩(wěn)定性要求，即反復(fù)繁殖或每個繁殖周期結(jié)束后，其結(jié)果具一貫性和可重復(fù)性。同時，對性狀固有的商業(yè)價值或優(yōu)勢不做要求，但如果某些經(jīng)濟性狀能達到上述規(guī)定的標準，也可以考慮作為DUS測試補充性狀。

為全面、準確地選擇甜菊DUS測試性狀，查閱了國內(nèi)外相關(guān)植物的DUS測試指南、品種描述等文獻資料。在充分參考借鑒日本《甜菊DUS測試指南》的基礎(chǔ)上[11]，結(jié)合我國甜菊育種、生產(chǎn)和科研等實際情況初步構(gòu)建了要調(diào)查的包括42個性狀的DUS測試性狀表，并且通過對性狀進行分級描述，確定了性狀的測試方法和實驗設(shè)計方案。

1.2.3田間測試和標準品種篩選根據(jù)試驗設(shè)計方案，在2013年的田間預(yù)備試驗中，采用目測和測量的方式采集參試品種的DUS測試性狀數(shù)據(jù)，同時拍攝相關(guān)照片。經(jīng)過分析整理后，刪除了“植株：分枝習(xí)性”、“植株：生長勢”和“花：大小”3個性狀，保留了39個觀測性狀，并初步篩選出一批性狀表達狀態(tài)一致、穩(wěn)定的品種作為候選標準品種留待第二年田間試驗。

2014年繼續(xù)開展田間種植試驗，對上年篩選出的性狀和候選標準品種繼續(xù)田間測試性狀數(shù)據(jù)采集，和照片拍攝。確定了甜菊DUS測試的種植方式和觀測數(shù)量。對兩年的數(shù)量性狀測試數(shù)據(jù)進行分析，初步確定我國甜菊DUS測試中各數(shù)量性狀的分級標準。

1.2.4測試指南的編制完善綜合兩年田間試驗觀測結(jié)果及實驗室甜菊糖苷檢測結(jié)果，編制了《植物新品種特異性、一致性和穩(wěn)定性測試指南甜菊》初稿。初稿包含24個基本性狀和15個選測性狀，共39個性狀。初步確定了分組性狀和技術(shù)問卷性狀，確定了不同性狀的最佳觀測時期和方法，初步確定代表性狀不同表達狀態(tài)的標準品種。

2014年9月組織了專家咨詢會。來自DUS測試、育種、栽培等領(lǐng)域的5位專家針對甜菊DUS測試指南初稿提出了32條修改意見。經(jīng)討論后決定采納32條，最后形成甜菊DUS測試指南的函審稿，包含19個基本性狀和16個選測性狀，共35個性狀。

2015年3月向中國農(nóng)科院、上海市農(nóng)科院、山東省農(nóng)科院、安徽大學(xué)、南京農(nóng)業(yè)大學(xué)、青島農(nóng)業(yè)大學(xué)、安徽科技學(xué)院等11家單位的12位專家發(fā)出了函審邀請。在收回的12份意見表中共有修改意見120條，我們經(jīng)過慎重考慮后全部采納了55條，部分采納了1條。最后形成了甜葉菊DUS測試指南的送審稿，包含19個基本性狀和16個選測性狀，共35個性狀。

2015年5月18日，甜菊DUS測試指南在北京通過了全國植物新品種測試標準化技術(shù)委員會組織的專家組審定，最終確立性狀25個，標準品種6個。

2　甜菊DUS測試指南的主要內(nèi)容

甜菊DUS測試指南包含以下幾個主要部分：前言、范圍、規(guī)范性引用文件、術(shù)語與定義、符號、繁殖材料的要求、測試方法、特異性、一致性和穩(wěn)定性結(jié)果的判定、性狀表、分組性狀、技術(shù)問卷以及附錄A（規(guī)范性附錄）、附錄B（資料性附錄）和附錄C（規(guī)范性附錄）。其中特異性、一致性和穩(wěn)定性結(jié)果的判定、性狀表及其解釋是測試指南的核心。

2.1適用范圍

甜菊DUS測試指南適用于甜菊（Stevia rebaudiana Bertoni）品種特異性、一致性和穩(wěn)定性測試和結(jié)果判定。

2.2繁殖材料的要求

繁殖材料的要求包括提供繁殖材料的形式、數(shù)量、質(zhì)量和植物檢疫方面的要求。雖然生產(chǎn)實踐中甜菊主要以扦插苗進行繁殖，但考慮到部分育種家是以種子繁殖材料的情況，最終確定繁殖材料以扦插苗、種子形式提供。提交的扦插苗數(shù)量不少于300株，提交的種子不少于5 g。提交的扦插苗或種子應(yīng)外觀健康，活力高，無病蟲侵害。苗的具體質(zhì)量要求：高度8 cm～10 cm，5～6對葉，肉質(zhì)根系3 cm～4 cm長的一年生莖尖苗。種子的具體質(zhì)量要求：凈度≧90%、發(fā)芽率≧50%、含水量≦15%。提交的扦插苗或種子應(yīng)符合中國植物檢疫的有關(guān)規(guī)定。

表1　甜菊品種DUS測試指南的測試性

2.3測試性狀

由于UPOV并未制訂甜菊DUS測試指南，所以在確定甜菊測試性狀之初，主要參考借鑒了日本甜菊DUS測試指南等的性狀描述方法和要求。并在此基礎(chǔ)上，結(jié)合育種、生產(chǎn)和科研等實際情況，通過對甜菊形態(tài)學(xué)和生理學(xué)性狀以及經(jīng)濟性狀的穩(wěn)定性和一致性進行充分地分析研究，最終選用了植株、莖、葉、花等性狀25個（表1）。

2.3.1測試性狀分析根據(jù)《植物新品種特性、一致性和穩(wěn)定性審查及性狀統(tǒng)一描述總則》（TG1/3）的性狀選擇要求，從最初觀測的42個表型性狀中，將不便觀測、受環(huán)境影響較大、難以準確描述、相關(guān)性強的性狀刪除，最終保留25個性狀，其中必測性狀20個，選測性狀5個。性狀的排列順序根據(jù)植物學(xué)順序排列：植株、莖、葉、花。

甜菊測試性狀按性狀類別區(qū)分，質(zhì)量性狀（QL）有兩個、假質(zhì)量性狀（PQ）有3個、數(shù)量性狀（QN）20個。其中，質(zhì)量性狀是指植株表現(xiàn)不連續(xù)變狀態(tài)的性狀，如莖的花青甙顯色有無；假質(zhì)量性狀是指其表達至少有部分是連續(xù)的，但其變化范圍是多維的性狀，如植株株型；數(shù)量性狀是能以一維的、線性等級進行描述的性狀，它顯示性狀從一個極端到另一個極端的連續(xù)變化。為了便于某一性狀的描述，將描述范圍分成幾個表達狀態(tài)，如植株高度：極矮（1）、矮（3）、中（5）、高（7）、極高（9）。

2.3.2分組性狀為便于在甜菊DUS測試中科學(xué)、準確地選擇近似品種，根據(jù)我國育種情況，參考日本測試指南，本指南確定了4個分組性狀，植株：株型；莖：花青苷顯色；葉：葉形；副花冠：內(nèi)壁顏色。

2.4DUS測試判定標準

2.4.1特性判定申請品種應(yīng)明顯區(qū)別于所有已知品種。在測試中，當(dāng)申請品種至少在一個性狀上與近似品種具有明顯且可重現(xiàn)的差時，即可判定申請品種具備特性。

2.4.2一致性判定對無性繁殖的品種，采用1%的群體標準和95%的接受概率。當(dāng)樣本大小為83～137株時，最多可以允許有3個型株。對種子繁殖的品種，采用10%的群體標準和95%的接受概率。當(dāng)樣本大小為103～110株時，最多可以允許有16個異型株。

2.4.3穩(wěn)定性判定如果一個品種具備一致性，則可認為該品種具備穩(wěn)定性。一般不對穩(wěn)定性進行測試。必要時，可以種植該品種的下一批繁殖材料，與以前提供的繁殖材料相比，若性狀表達無明顯變化，則可判定該品種具備穩(wěn)定性。

3　結(jié)語

甜菊DUS測試指南研制工作是根據(jù)國內(nèi)外相關(guān)技術(shù)文件和中國植物新品種保護工作與國際接軌的需要，緊密結(jié)合我國甜菊科研實際，征求了各方面的意見和建議開展完成的。1999年至今，我國已經(jīng)陸續(xù)公布了9批植物新品種保護目錄，總計93個種屬，涉及大田作物、果樹、花卉和蔬菜等。隨著我國《種子法》的修改，植物新品種保護力度得到加強，保護目錄范圍將逐步擴大。農(nóng)業(yè)部目前向社會公開征求意見的“第十批農(nóng)業(yè)植物品種保護目錄”就包含了甜菊。因此，甜菊品種DUS測試指南的成功研制對保護甜菊育種者權(quán)利，開展甜菊新品種選育都將起到積極的促進作用。

[1]舒世珍，陳睦傳，李欽，等.中國甜葉菊栽培及應(yīng)用技術(shù)[M].北京：農(nóng)業(yè)出版社，1994.

[2]何毓娟，李元彬.發(fā)展甜菊生產(chǎn)大有可為[J].中國糖料，1997（1）：52-56.

[3]農(nóng)業(yè)部植物新品種保護辦公室.中華人民共和國植物新品種保護條例實施細則（農(nóng)業(yè)部分）[M].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，1997.

[4]GB/T 19557.1-2004.植物新品種特異性、一致性和穩(wěn)定性測試指南總則[S].

[5]TG/1/3.General introduction to the examination of distinctness，uniformity and stability and the development of harmonized descriptions of new varieties of plant[S].Geneva，Switzerland：UPOV，2002.

[6]TGP/14/1.Glossary of technical，botanical and statistical terms used in UPOV documents[S].Geneva，Switzerland：UPOV，2002.

[7]TGP/7/2.Developmentof the test guidelines[S].Geneva，Switzerland：UPOV，2010.

[8]TGP/9.Examining distinctness[S].Geneva，Switzerland：UPOV，2004.

[9]TGP/7/2.Examining uniform ity[S].Geneva，Switzerland：UPOV，2004.

[10]農(nóng)業(yè)部植物新品種測試中心，全國植物新品種測試標準化技術(shù)委員會.植物新品種特異性、一致性和穩(wěn)定性審查及性狀統(tǒng)一描述總則（TG/1/3）[M].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2007.

[11]日本甜菊測試指南[S].http：//www.hinsyu.maff.go.jp/info/sinsakijun/botanical_taxon_e.htm l

Development of DUS Test Guideline for Stevia Variety

WANG Xian-sheng1,WANG Zhong-wei2,LIHua-yong1,HUANG Su-zhen2,WANG Yan-ping1, ZHANG Ji-hong1,WU-Yan1,SHEN Qi1
(1.Institute of Food Crops,Jiangsu Academy of Agricultural Sciences,Nanjing Station for DUSTesting Center of New Plant Varieties, Ministry of Agriculture,Nanjing 210014;2.Institute of Botany,Jiangsu Province and Chinese Academy of Sciences(Nanjing Botanical Garden Mem.Sun Yat-Sen),Nanjing 210014)

The distinctness,uniformity and stability(DUS)test guideline of plant varieties was the technical standards for the DUS test.The test guideline of stevia(Stevia rebaudiana Bertoni)was developed based on the result of measurements and observations for two growing cycles of stevia.This paper gave detail description of compilation principle,the development process and themain content of stevia testguideline.

stevia;protection of new varieties;DUS test;guideline;development

S566.9

A

1007－2624（2016）03－0046－04

10.13570/j.cnki.scc.2016.03.015

2015-12-31

農(nóng)業(yè)部品種資源保護項目（G488）；江蘇省農(nóng)業(yè)科技支撐項目（BE2014402）；江蘇省農(nóng)業(yè)自主創(chuàng)新項目CX（13）2020；江蘇省中國科學(xué)院植物研究所青年基金項目（SQ201303）。

王顯生（1977-），男，湖南永興人，副研究員，從事植物新品種測試工作，E-mail：wangxiansheng80@126.com。

沈奇，女，研究員，從事植物新品種測試工作，E-mail:wangxiansheng80@126.com。

通信作者：黃蘇珍，女，研究員，從事甜菊種質(zhì)開發(fā)與創(chuàng)新研究，E-mail:hsz1959@163.com。