基于液相色譜-質譜的代謝組學方法研究卷柏治療高尿酸血癥大鼠的作用機制

徐　晨，陳維佳，于江洪，劉　舒，劉志強，宋鳳瑞

(1.中國科學院長春應用化學研究所，吉林 長春　130022；2.吉林大學藥學院，吉林 長春　130021；3.吉林省東北亞藥業(yè)股份有限公司，吉林 敦化　133700)

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基于液相色譜-質譜的代謝組學方法研究卷柏治療高尿酸血癥大鼠的作用機制

徐晨1，陳維佳2，于江洪3，劉舒1，劉志強1，宋鳳瑞1

(1.中國科學院長春應用化學研究所，吉林 長春130022；2.吉林大學藥學院，吉林 長春130021；3.吉林省東北亞藥業(yè)股份有限公司，吉林 敦化133700)

采用基于超高效液相色譜-電噴霧-四極桿飛行時間質譜(UPLC-ESI-QTOF/MS)的代謝組學方法研究卷柏治療高尿酸血癥大鼠的作用機制，運用主成分分析(PCA)和正交偏最小二乘法判別分析(OPLS-DA)方法對健康對照組、高尿酸血癥模型組和卷柏組的大鼠尿液中內源性代謝物進行分析，尋找卷柏治療高尿酸血癥大鼠的潛在生物標記物。結果表明，經PCA和OPLS-DA分析后，健康對照組、高尿酸血癥模型組和卷柏組的大鼠尿液代謝物譜能得到有效地區(qū)分；發(fā)現并鑒定了9個潛在生物標記物，分別為尿酸、尿囊素、黃尿酸、犬尿酸、硫酸吲哚酚、馬尿酸、肌酐、富馬酸和檸檬酸。卷柏對高尿酸血癥大鼠的治療主要體現為對嘌呤代謝、色氨酸代謝、三羧酸循環(huán)、精氨酸和脯氨酸代謝以及苯丙氨酸代謝的調節(jié)作用。同時，通過檢測血清生化指標，表明卷柏能降低高尿酸血癥大鼠的血尿酸水平，并起到保護腎臟的作用。

代謝組學；卷柏；高尿酸血癥；液相色譜-質譜

高尿酸血癥是由于嘌呤代謝紊亂導致血尿酸升高的一種疾病，其診斷標準為血尿酸濃度男性高于7.0 mg/dL，女性高于6.0 mg/dL[1]。高尿酸血癥與內皮功能紊亂、心血管疾病及腎臟疾病等密切相關[2-5]。該病多發(fā)于中年男性，但是近年來，隨著人們生活方式和飲食結構的改變，年輕人和絕經女性的患病率逐漸增高[6]。

目前，從天然資源中尋找治療高尿酸血癥的藥物已成為藥學研究的熱點。其中，以黃嘌呤氧化酶為靶點，篩選抗痛風中藥是現行的主流方法，并且取得了很好的研究進展。有研究表明，卷柏(Selaginellatamariscina(P. Beauv.)Spring)雙黃酮提取物能夠明顯的抑制黃嘌呤氧化酶的活性[7-8]，但關于卷柏治療高尿酸血癥的整體作用機制尚無報道。

代謝組學是通過考察生物體系受刺激或擾動后，以其代謝產物的變化或其隨時間的變化來研究生物體系代謝途徑的一門科學[9]。該學科發(fā)展迅速，現已廣泛應用于疾病診斷、藥物研發(fā)、藥物治療、毒性評價等領域[10-13]。液相色譜-質譜(LC/MS)聯用技術，特別是超高效液相色譜-質譜(UPLC/MS)聯用技術，因具有較高的靈敏度和分辨率，以及較寬的動態(tài)范圍，而被廣泛用于代謝組學研究。

本研究擬采用超高效液相色譜-電噴霧-四極桿飛行時間質譜法(UPLC-ESI-QTOF/MS)檢測經卷柏治療的高尿酸血癥大鼠尿液中代謝物的變化，通過主成分分析(PCA)和正交偏最小二乘法判別分析(OPLS-DA)尋找潛在的生物標記物，并由此探索卷柏的作用機制。

1　實驗部分

1.1主要儀器

Waters Synapt G2四極桿飛行時間質譜儀：美國Waters公司產品，配有Acquity UPLC系統、ESI電噴霧離子源；Centrifuge 5810R超速冷凍離心機：德國Eppendorf公司產品。

1.2主要試劑

黃嘌呤：美國Sigma公司產品；氧嗪酸鉀：成都西亞試劑有限公司產品；HE染色(蘇木精-伊紅染色法)相關試劑：北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司產品；Masson染色(馬松三色染色法)試劑盒：南京建成生物研究所產品；卷柏：北京同仁堂制藥有限公司產品；尿酸、尿囊素、黃尿酸、犬尿酸、硫酸吲哚酚、馬尿酸、肌酐、富馬酸和檸檬酸標準品：均為美國Sigma公司產品。

1.3卷柏提取物的制備

卷柏粉碎，過60目篩后，加入10倍質量的水，浸潤40 min，然后回流提取40 min；過濾出濾液后，再加入10倍質量的水，回流提取40 min；合并2次濾液，于50 ℃旋轉蒸發(fā)濃縮后，凍干；凍干粉加水溶解后使用。

1.4動物實驗

18只Wistar大鼠(體重200～250 g)，購于吉林大學實驗動物中心，適應環(huán)境7天后，隨機分成3組：1) 健康對照組(HCG)：連續(xù)13天按照0.5 mL/100 g體重腹腔注射生理鹽水，每日2次；2) 高尿酸血癥模型組(MG)：連續(xù)13天按照0.5 mL/100 g體重腹腔注射造模藥(黃嘌呤和氧嗪酸鉀均為60 g/L的混合液)，每日2次；3) 卷柏組(STG)：連續(xù)13天按照0.5 mL/100 g體重腹腔注射造模藥(黃嘌呤和氧嗪酸鉀均為60 g/L的混合液)，每日2次，從第4天開始，按照320 mg/100 g體重灌胃給藥卷柏提取物，一日1次，連續(xù)10天。

1.5樣品收集與制備

在實驗第13天收集大鼠的18 h尿液，以10 000 r/min離心10 min，取上清液，冷凍貯藏于-80 ℃冰箱中。樣品檢測前，在4 ℃冰箱中解凍尿液樣品，經0.22 μm濾膜過濾，取上清液，用超純水以1∶10(V/V)稀釋，供UPLC-ESI-QTOF/MS測定。

在實驗第3天，取大鼠眼眶血，備用；第14天，處死大鼠，取血液；2次所得的血液均以4 000 r/min離心10 min，取上清液作為血清儲備液，冷凍貯藏于-80 ℃冰箱中。

1.6實驗條件

1.6.1色譜條件Waters Acquity UPLC BEH C18色譜柱(1.7 μm×2.1 mm×50 mm)；流動相：A為0.1%甲酸-水溶液，B為乙腈；梯度洗脫：0～5 min、5%B～20%B，5～8 min、20%B～50%B，8～10.5 min、50%B～100%B；流速0.4 mL/min；進樣室溫度4 ℃；柱溫35 ℃；進樣量5 μL。

1.6.2質譜條件Waters Synapt G2四極桿飛行時間質譜儀，正離子模式毛細管電壓2.5 kV，負離子模式毛細管電壓2.0 kV，錐孔電壓40 V，萃取錐電壓2.0 V，離子源溫度120 ℃，脫溶劑氣溫度400 ℃，錐孔氣流速50 L/h，脫溶劑氣流速800 L/h，質量掃描范圍m/z100～1 000，碰撞能量10～40 eV。測樣前，使用甲酸鈉進行校正，采用分辨率模式；測樣時，采用2 μg/L亮氨酸腦啡肽實時校正，15 s校正1次，每次采集亮氨酸腦啡肽信號0.5 s，亮氨酸腦啡肽進樣流速5 μL/min。

1.7數據處理

樣品經UPLC-ESI-QTOF/MS檢測獲得原始數據，采用Markerlynx XS v4.1軟件進行峰檢測、峰對齊以及歸一化。以精確分子質量-保留時間和歸一化后的峰面積建立數據矩陣，數據矩陣導入多變量統計軟件SIMCA-P(Umetrics, Ume?, Sweden)中進行PCA和OPLS-DA多元變量分析。使用生物學數據庫，如HMDB(http:∥www.hmdb.ca/)、METLIN (http:∥metlin.scripps.edu/)、Massbank(http:∥www.massbank.jp/)和KEGG(http:∥www.kegg.com/)進行生物標記物的鑒定和代謝通路的分析。

1.8血清生化指標及腎組織切片檢測

大鼠血清中尿酸及肌酐的含量測定采用超高效液相色譜-三重四極桿質譜法(UPLC-TQ-MS)，具體實驗步驟參見文獻[14]。

2　結果與討論

2.1血清生化指標檢測

血清生化指標檢測結果列于表1。可以看出：在實驗第3天，模型組和卷柏組的血尿酸含量顯著升高，表明高尿酸血癥模型成功建立；在第14天，即經過10天的卷柏給藥，卷柏組的血尿酸含量相對模型組降低，表明卷柏具有降低高尿酸血癥大鼠血尿酸的作用。通常，血清肌酐含量可作為衡量腎臟功能的指標，在第14天，模型組血清肌酐含量與健康組相比升高，表明模型組大鼠的腎臟功能受損，而卷柏組大鼠的血清肌酐含量相對模型組降低，說明卷柏具有保護腎臟的作用。

2.2尿液代謝物譜分析和潛在生物標記物鑒定

采用UPLC-ESI-QTOF/MS法進行尿液樣品的分離和數據采集，并對數據進行PCA和OPLS-DA分析，PCA在正離子模式和負離子模式下的得分圖示于圖1?？梢钥闯?，健康對照組、模型組和卷柏組能完全分開，表明這3組大鼠的尿液代謝物譜發(fā)生了明顯變化。為了更好的區(qū)分并找到影響分組的代謝物，采用OPLS-DA法研究模型組和卷柏組大鼠的代謝物譜差異。

表1　血清尿酸和血清肌酐的濃度(平均值±SD,n=6)

注：*表示與模型組相比P<0.01；**表示與模型組相比P<0.05

圖1　健康對照組、模型組和卷柏組在正離子模式(a)和負離子模式(b)下的PCA得分圖Fig.1　PCA score plots of HCG, MG and STG in positive ion mode (a) and negative ion mode (b)

OPLS-DA在正離子模式和負離子模式下的得分圖分別示于圖2，可以看出，模型組和卷柏組有明顯區(qū)別，經卷柏給藥后大鼠的代謝狀況發(fā)生了明顯改變。模型組和卷柏組在正離子模式和負離子模式下的S-plot示于圖3，每個點表示1個化合物，離原點距離越遠表示這個化合物對模型組和卷柏組大鼠分組的貢獻越大。選擇VIP值大于1的代謝物為潛在生物標記物，共找出了對模型組和卷柏組分類貢獻較大的9個化合物，即卷柏治療高尿酸血癥大鼠的潛在生物標記物。根據質荷比和串聯質譜數據，并與標準品和數據庫進行比較，鑒定出9個潛在生物標志物，結果列于表2。以負譜m/z212.002 7代謝物為例說明鑒定過程：首先，準分子離子峰的質荷比為212.002 7，經計算其化學式為C8H7NO4S，此代謝物初步鑒定為硫酸吲哚酚；由串聯質譜圖可知，此代謝物有2個碎片離子m/z132.05和m/z79.96，經計算，這2個碎片離子分別為[M—H—SO3]-和[SO3]-；綜上，鑒定此代謝物為硫酸吲哚酚。

圖2　模型組和卷柏組在正離子模式(a)和負離子模式(b)下的OPLS-DA得分圖Fig.2　OPLS-DA score plots of MG and STG in positive ion mode (a) and negative ion mode (b)

Fig.3　模型組和卷柏組在正離子模式(a)和負離子模式(b)下的S-plotFig.3　S-plots of OPLS-DA for MG and STG in positive ion mode (a) and negative ion mode (b)

模式VIP值化合物分子式測定質荷比m/z理論質荷比m/z誤差/10-6串聯質譜變化趨勢*變化趨勢**變化倍數*變化倍數**正離子1.34肌酐C4H7N3O114.0663114.0662+0.8844.10上調下調2.061.942.52黃尿酸C10H7NO4206.0443206.0448-2.43160.04上調下調1.741.842.04馬尿酸C9H9NO3180.0658180.0655+1.67105.05,上調下調1.791.6777.022.21犬尿酸C10H7NO3190.0500190.0499+0.53144.05,上調下調1.931.71116.061.16尿囊素C4H6N4O3159.0511159.0513-1.2661.04,上調下調2.482.0399.03負離子5.17硫酸吲C8H7NO4S212.0027212.0023-1.89132.05,上調下調4.942.69哚酚79.962.27檸檬酸C6H8O7191.0200191.0197+1.57111.01下調上調1.511.285.57尿酸C5H4N4O3167.0214167.0211+1.80124.02,上調下調3.011.8996.02,69.011.12富馬酸C4H4O4115.0036115.0037-0.8771.10下調上調1.471.68

注：*為模型組vs健康對照組，P<0.05；**為卷柏組vs模型組，P<0.05

2.3卷柏治療高尿酸血癥大鼠作用機制分析

實驗表明，卷柏給藥組大鼠尿液中的尿酸含量明顯降低，說明卷柏有降低尿酸的作用。尿酸是人類嘌呤代謝的終產物，但大鼠體內存在將尿酸氧化為尿囊素的尿酸酶。本研究采用氧嗪酸鉀抑制尿酸酶活性來造模，但是尿酸能夠通過非酶途徑被氧化為尿囊素，因此尿囊素含量的變化也代表了尿酸含量的變化。

黃尿酸、犬尿酸以及硫酸吲哚酚是色氨酸代謝通路的重要代謝物。已有研究[15-16]表明，在腎功能不全的大鼠體內，黃尿酸和犬尿酸的含量會升高。硫酸吲哚酚是吲哚酚的二相代謝產物，其在慢性腎病大鼠血清中明顯升高[17]。在本研究中，黃尿酸、犬尿酸以及硫酸吲哚酚在模型組中含量升高，除此以外，與腎損傷有關的標記物，包括精氨酸和脯氨酸代謝通路的肌酐和苯丙氨酸代謝通路的馬尿酸也都在模型組中上調。這些代謝物含量的變化都表明，模型組大鼠具有腎臟損傷。在卷柏組，這些與腎臟功能相關的代謝物含量都下調，表明卷柏能夠起到保護腎臟的作用。

富馬酸和檸檬酸是三羧酸循環(huán)的重要中間物。三羧酸循環(huán)是能量代謝的重要組成部分，是能量物質(如糖、脂肪酸和氨基酸)氧化的途徑。在模型組中，富馬酸和檸檬酸含量降低，說明高尿酸血癥大鼠體內能量代謝異常；在卷柏組中，富馬酸和檸檬酸含量相比模型組均有上調，表明卷柏能夠調節(jié)高尿酸血癥大鼠的能量代謝。

3　結論

本研究采用基于UPLC-ESI-QTOF/MS的代謝組學方法研究了卷柏治療高尿酸血癥大鼠的尿液代謝譜變化，并檢測了大鼠的血清生化指標。結果表明，卷柏調節(jié)了高尿酸血癥大鼠的9個代謝物，包括尿酸、尿囊素、黃尿酸、犬尿酸、硫酸吲哚酚、馬尿酸、肌酐、富馬酸和檸檬酸，這些潛在生物標志物的變化趨勢反映了卷柏在嘌呤代謝、色氨酸代謝、三羧酸循環(huán)、精氨酸和脯氨酸代謝以及苯丙氨酸代謝的調節(jié)作用。

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Metabonomics Study ofSelaginellatamariscinafor Hyperuricemia in Rats Using UPLC-ESI-QTOF/MS

XU Chen1, CHEN Wei-jia2, YU Jiang-hong3, LIU Shu1, LIU Zhi-qiang1, SONG Feng-rui1

(1.ChangchunInstituteofAppliedChemistry,ChineseAcademyofSciences,Changchun130022,China;2.SchoolofPharmaceuticalScience,JilinUniversity,Changchun130021,China;3.JilinNortheastAsiaPharmaceuticalCo.,Ltd.,Changchun133700,China)

A urinary metabonomics method based on ultra-performance liquid chromatography-electrospray ionization quadruple time-of-flight/mass spectrometry (UPLC-ESI-QTOF/MS) was developed to study the effects ofSelaginellatamariscinaon hyperuricemic rats. Principal components analysis (PCA) and orthogonal partial least-squares discriminant analysis (OPLS-DA) were applied to analyze the metabolites in healthy control group (HCG), model group (MG) andSelaginellatamariscina-treated group (STG). The results show that significant differences in urinary metabolic profiles are observed from HCG, MG and STG by using PCA and OPLS-DA. And nine potential biomarkers including uric acid, allantoin, xanthurenic acid, kynurenic acid, indoxyl sulfate, hippuric acid, creatinine, fumaric acid and citric acid are found. Pathways of purine metabolism, tryptophan metabolism, tricarboxylic acid cycle, arginine and proline metabolism and phenylalanine metabolism are in response to the therapeutic effects ofSelaginellatamariscina. Besides, the serum biochemical analysis demonstrated thatSelaginellatamariscinacan not only reduce the amount of uric acid but also protect the kidney of hyperuricemic rat.

metabonomics;Selaginellatamariscina; hyperuricemia; LC/MS

2015-09-28;

2015-11-09

國家自然科學基金項目(21175128，81303280)資助

徐晨(1988—)，女(漢族)，河南焦作人，博士研究生，藥物分析專業(yè)。E-mail: xuchen214@126.com

劉舒(1985—)，女(漢族)，山東菏澤人，副研究員，從事質譜分析研究。E-mail: mslab20@ciac.ac.cn

O657.63

A

1004-2997(2016)05-0440-06

10.7538/zpxb.youxian.2016.0018

網絡出版時間：2016-03-28；網絡出版地址：http:∥www.cnki.net/kcms/detail/11.2979.TH.20160328.1443.020.html