龔磊　王艦　楊永智

摘要：利用大田統(tǒng)計方法，結(jié)合分子生物學(xué)手段和生物信息學(xué)手段對轉(zhuǎn)化的23個轉(zhuǎn)基因馬鈴薯突變株進行抗病性鑒定，分析轉(zhuǎn)化群體中外源基因的插入信息，并利用雙夾心抗體酶聯(lián)免疫法技術(shù)研究受侵染后馬鈴薯卷葉病毒基因在這些轉(zhuǎn)化體中的表達情況。結(jié)果表明，一些株系出現(xiàn)了性狀突變，通過分子生物手段檢測發(fā)現(xiàn)大部分株系都有一定的馬鈴薯卷葉病毒抗性，但是抗性水平差異很大。試驗驗證了RNA干涉技術(shù)策略的可行性。

關(guān)鍵詞：馬鈴薯卷葉病毒； RNA干涉（RNAi）； 酶聯(lián)免疫檢測

中圖分類號：S432.4+1；S532 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2016）08-1994-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.08.020

Abstract： The field statistical method combined with molecular biology and bioinformatics methods were used to identify potato disease resistance of 23 transgene mutant strains， analyzing the transformation groupss external gene whose inserted information. And the double-direct sandwich ELISA technique was used to study infested potato leaf roll virus gene expression in the transformation of the body. The results showed that some character mutation strain appeared， most of the strains measured by the molecular biological tools had some potato leaf roll virus resistance， but the resistance level difference was big.

Key words： potato leaf roll virus（PLRV）； RNA interference（RNAi）； enzyme-linked immune detection

馬鈴薯卷葉病毒（Potato leaf roll virus，PLRV）屬黃化病毒組，由蚜蟲以持久方式傳播，是馬鈴薯上最重要的病毒病害之一[1]。馬鈴薯卷葉病毒可侵染馬鈴薯引起卷葉、黃化、矮縮、僵化及塊莖網(wǎng)狀壞死等癥狀，嚴重影響馬鈴薯的產(chǎn)量和品質(zhì)，是一種世界范圍的馬鈴薯重要病害[2-5]。

RNAi是由dsRNA介導(dǎo)的基因沉默現(xiàn)象，是細胞內(nèi)的一種防御機制，可特異地降解細胞內(nèi)與之具有同源性的核酸[6]，起到調(diào)節(jié)細胞內(nèi)編碼基因表達的作用。由于RNAi具有抗病毒表現(xiàn)型為高抗或近似于免疫、抗病性更持久、生物安全性高等優(yōu)點，具有更加廣闊的應(yīng)用前景[7-10]。因此，探討利用RNA介導(dǎo)抗性來培育抗病毒轉(zhuǎn)基因馬鈴薯的這一新策略的可行性和應(yīng)用價值具有重要的現(xiàn)實意義。

本試驗利用大田統(tǒng)計方法結(jié)合分子生物學(xué)手段和生物信息學(xué)手段對青海大學(xué)農(nóng)牧學(xué)院實驗室轉(zhuǎn)化的23個轉(zhuǎn)基因馬鈴薯突變株進行抗病性鑒定，整個試驗以驗證RNA干涉技術(shù)策略的可行性，為得到對馬鈴薯卷葉病毒具有穩(wěn)定抗性的馬鈴薯轉(zhuǎn)基因植株提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗材料為青海大學(xué)農(nóng)牧學(xué)院實驗室轉(zhuǎn)化的23個轉(zhuǎn)基因馬鈴薯突變株和未轉(zhuǎn)基因?qū)φ崭咴?號和脫毒175以及感染馬鈴薯卷葉病毒的馬鈴薯植株P(guān)LRV-2、PLRV-4、PLRV-8（表1）。所轉(zhuǎn)入的基因為RNA干涉片段，根據(jù)馬鈴薯卷葉病毒基因開放閱讀框設(shè)計引物擴增出2個片段，分別命名為PLRV1和PLRV2，大小分別為240 bp和400 bp。通過正向方向插入載體PCADS1341中，再通過根癌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)入馬鈴薯植株，通過驗證獲得轉(zhuǎn)基因材料。

1.2 主要試劑及儀器

主要試劑有十六烷基-三甲基-溴化胺（CTAB）（上海博奧生物科技公司）、PCR試劑（10×Buffer、2.5 mmol/L dNTP、10 μmol/L引物、5 U/μL Taq聚合酶）（Takara）、瓊脂糖（Agarose）（Biowest）、Marker2000（Takara）、ELISA試劑盒（Cygnus）。TE（pH 8.0）：分別量取2 mL 1 mol/L的Tris HCL和0.4 mL 0.5 mol/L的EDTA（pH 8.0）加入到150 mL去離子水中，攪拌混勻，加去離子水定容至200 mL，0.1 MPa、120 ℃高壓滅菌30 min，備用。

主要儀器有DYY-2C電泳儀（北京六一生物科技有限公司）、Eppendorf Bio-photometer紫外分光光度計、S1000 Thermal cycle PCR儀（BIO-RAD）、PB303-N電子精密天平[梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司]、Versadoc 1000凝膠成像系統(tǒng)（美國BIO-RAD公司）、Eppendorf 5415D臺式離心機（德國）、Elx800酶標儀（Bio-tek），其他儀器及耗材均由青海省農(nóng)林科學(xué)院生物所實驗室提供。

1.3 大田抗病性試驗觀察

1.3.1 大田試驗 將固體MS培養(yǎng)基中擴繁的小植株在株高4～5 cm時取出，假植于蛭石中，約2周后移入大田。2012年5月15日將轉(zhuǎn)基因材料及病毒株按隨機區(qū)組法種植于西寧市城北區(qū)農(nóng)林科學(xué)院生物所試驗田，共25株系，3個重復(fù)，病毒株種植于小區(qū)間。行距×株距=70 cm×30 cm，小區(qū)間距1.5 m，小區(qū)寬3 m，長19 m，小區(qū)面積57 m2，區(qū)組面積171 m2，小區(qū)間面積57 m2，共計總面積228 m2。定植前對以上田塊進行深翻和施肥。

1.3.2 蚜蟲傳染馬鈴薯卷葉病毒試驗 2012年6月當(dāng)轉(zhuǎn)基因株高15 cm時，用帶病毒的桃蚜（Myzus persicae Sulz）接種PLRV，每株10頭。傳毒前先將無毒蚜蟲放在感染PLRV的馬鈴薯上飼毒3 d，傳毒5 d后殺死蚜蟲，于接種5周后采集上部葉片檢測PLRV，用ELISA法和實時定量PCR測定。同時觀察葉片是否有典型的卷葉病特征。

1.3.3 大田植株表型觀察 2012年7月13日在試驗田進行表型統(tǒng)計，對葉片的形狀、顏色、株高、花期進行觀察并分析是否有表型突變，同時觀察是否有典型的馬鈴薯卷葉病癥狀，記錄并分析。

1.4 ELISA檢測

在進行酶聯(lián)免疫之前用普通PCR對這些轉(zhuǎn)基因材料進行外源載體的潮霉素抗性基因檢測（HYG基因），證明外源基因沒有丟失。PCR所用上游引物為AAGTTCGACAGCGTCTCCGAC，下游引物為TCTACACAGCCATCGGTCCAG。PCR擴增參數(shù)：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性30 s；60 ℃退火40 s；72 ℃延伸2 min，35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。

ELISA檢測步驟：①編號。將樣品對應(yīng)微孔按序編號，每板應(yīng)設(shè)陰性對照3孔、陽性對照3孔、空白對照3孔（空白對照孔不加樣品，加提取緩沖液，其余各步操作相同）；②包被酶聯(lián)板。每孔加配制好的包被抗體100 μL，封板膜封板后置于37 ℃溫育4 min；③配液。將5倍Wash buffer加去離子水至1倍后備用；④洗滌。小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30 s后棄去，如此重復(fù)3次，拍干；⑤研磨。每樣品取0.1 g葉片于勻漿管中，加入1 mL提取緩沖液，勻漿機7 500 r/min；⑥加樣。分別在陰、陽性對照孔中加入陰性對照、陽性對照100 μL。然后在待測樣品孔加待測樣品100 μL，加樣將樣品加于酶標板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻；⑦溫育。用封板膜封板后置37 ℃溫育16 min；⑧洗滌。小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30 s后棄去，如此重復(fù)3次，拍干；⑨加酶標抗體。每孔加入酶標抗體100 μL；⑩溫育。37 ℃溫育1 h； 11 洗滌。小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30 s后棄去，如此重復(fù)4次，拍干；■配制底物液。將2 mL 5倍的底物緩沖液加去離子水至10 mL，再加2片PNPP底物藥片（裝底物液的瓶子用錫箔紙包裹）；13 顯色。每孔先加入100 μL底物液，錫箔紙包裹酶聯(lián)板于37 ℃避光放置1 h；14 終止。每孔加終止液50 μL 2 mol/mL硫酸，終止反應(yīng)；15 測定。在加終止液后15 min內(nèi)，用Bio-tek的Elx800酶標儀測定OD值。

2 結(jié)果與分析

2.1 大田植株表型變化

5p2-4葉片小而多皺褶，4p2-9矮化（圖1），4p1-4、4p2-7植株高，5p2-6葉片皺縮，4p1-2矮化葉片小而稠密，4p1-1花期提前，4p2-6矮化，5p1-1較脫毒5號葉片顏色深，5p1-4葉片皺縮，稀疏，葉色淺（圖2），5p1-5葉片小而皺褶（圖3）。初步分析這些表型變化是由于在轉(zhuǎn)入外緣基因時改變或破壞了原有的一些形狀基因，如葉片形狀、顏色、株高，從而導(dǎo)致表型改變，真正原因還需要進一步的功能學(xué)研究。

除了4號、5號外，轉(zhuǎn)基因各株系沒有出現(xiàn)典型的馬鈴薯卷葉病癥狀，如葉片卷曲、直立、干脆等。初步斷定所轉(zhuǎn)入的RNA干涉載體起到了沉默卷葉病毒基因的作用。

2.2 ELISA檢測結(jié)果與分析

從圖4可以看出，23個轉(zhuǎn)基因株系通過PCR均擴增出潮霉素抗性基因，表明轉(zhuǎn)基因材料在繼代培養(yǎng)過程中外源基因沒有丟失。圖5為對參試材料進行ELISA試驗的結(jié)果，顏色越深表明馬鈴薯卷葉病毒含量越高，植株的抗病性越差。反之表明植株中馬鈴薯卷葉病毒含量越低，抗性越強。

2012年11月24日進行ELISA試驗，并用Bio-rad酶標儀進行測量。測量數(shù)據(jù)見表2、表3。

利用Excel函數(shù)工具和SAS軟件對酶標儀測量數(shù)據(jù)進行分析得出，3個重復(fù)間相對標準偏差率小于15%，說明試驗操作重復(fù)性較好，數(shù)據(jù)可用于分析。

其中4p1-3、4p2-3、4p2-7、4號、5p1-6、5p2-6、5號為陽性，初步說明除這幾個株系以外的株系均有一定的馬鈴薯卷葉病毒抗性，所轉(zhuǎn)入的RNA干涉載體起到了一定的干涉PLRV的作用。

以高原4號為受體的轉(zhuǎn)基因株系與高原4號共15個株系，3個重復(fù)OD值及方差分析結(jié)果如表2所示。由表2可知，4p2-7與其他各號有極顯著差異（P<0.01），4p2-4與其他各號有極顯著差異，4p1-3、4號與其他各號有極其顯著性差異。

以脫毒175為受體的轉(zhuǎn)基因株系與脫毒175共14個株系，3個重復(fù)的OD值及方差分析結(jié)果如表3所示。由表3可知，5號與其他各參試材料均有極顯著差異（P<0.01），5p1-6、5p2-6之間無顯著差異，但與其他各號有極顯著差異，5p1-6、5p2-6表現(xiàn)為陽性，可能是轉(zhuǎn)入的干涉載體作用較弱。

3 小結(jié)與討論

本試驗利用大田試驗發(fā)現(xiàn)了一些具有明顯特征突變的轉(zhuǎn)化體，初步推測轉(zhuǎn)入基因破壞了馬鈴薯生長素基因或者是生長素轉(zhuǎn)運蛋白基因，此現(xiàn)象可以作進一步的研究。

通過PCR擴增出了900 bp大小的潮霉素抗性基因條帶，鑒定轉(zhuǎn)基因馬鈴薯中外源存在；利用酶聯(lián)免疫法檢測技術(shù)研究受侵染后馬鈴薯卷葉病毒基因在這些轉(zhuǎn)化體中的表達情況，結(jié)果表明均有不同程度的抗性，從而驗證RNA干涉技術(shù)策略的可行性，為得到對馬鈴薯卷葉病毒具有穩(wěn)定抗性的馬鈴薯轉(zhuǎn)基因植株提供依據(jù)。

參考文獻：

[1] 張鶴齡.馬鈴薯卷葉病毒（PLRV）基因組研究進展[J].中國病毒學(xué)，1996，11（1）：1-8.

[2] 李芝芳.中國馬鈴薯主要病毒圖鑒[M].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2004.

[3] 謝聯(lián)輝，林奇英，吳祖建.植物病毒名稱及其歸屬[M].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，1999.

[4] DEVERS M，SOULAS G，MARTIN-LAURENT F. Real-time reverse transcription PCR analysis of expression of atrazine catabolism genes in two bacterial strains isolated from soil[J].Microbiol Meth，2004，56：3-15.

[5] BAR-JOSEPH M，ROISTACHER C N，GARNSEY S M，et al. A review of tristeza， an ongoing threat tocitriculture[M]. In Proc Int Soc Citriculture，1981，l：419-423.

[6] HAMMOND S M，CAUDY A A，HANNON G J. Post-transcriptional gene silen cing by double-stranded RNA[J]. Nat Rev Genet，2001，2（2）：110-119.

[7] BAULCOMBE D C. Viruses an d gene silencing in plants[J].Arch Virol Suppl，1999，15：189-201.

[8] FIRE A，XU S Q，MONGOMERY M K，et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans[J].Nature，1998，391（6669）：806-811.

[9] SMITH N A，SINGH S P，WANG M B，et al. Total silencing by intron-spliced hairpin RNAs[J].Nature，2000，407（6802）：319-320.

[10] 翟 浩.BYDVs編碼的兩種抑制子及其作用機制研究[D].北京：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院，2011.