高產(chǎn)纖維素酶木霉菌株的篩選

馮小飛　趙寧　陳玉惠

摘要：以前期篩選獲得的20株木霉菌株為試驗對象，通過剛果紅羧甲基纖維素鈉（CMC-Na ）培養(yǎng)基篩選出11株產(chǎn)纖維素酶能力較好的菌株，對其進行酶活性檢測，發(fā)現(xiàn)菌株SS003產(chǎn)生的纖維素酶活性最高，并研究了溫度和pH對該菌株所產(chǎn)的纖維素粗酶活性的影響。結(jié)果表明，SS003產(chǎn)生的纖維素酶最適反應(yīng)溫度為55～60 ℃，最適pH為3.0。

關(guān)鍵詞：木霉；纖維素酶；酶活力

中圖分類號：Q55 文獻標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2016）06-1429-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.06.017

纖維素酶是降解纖維素生成葡萄糖的一組酶的總稱，具有很高的應(yīng)用價值。自1906年Serlliere[1]在蝸牛的消化液中發(fā)現(xiàn)纖維素酶以來，以纖維素轉(zhuǎn)化成葡萄糖為主要目標(biāo)對纖維素酶開展了大量的研究[2]。木霉屬（Trichoderma）真菌因其合成胞外纖維素酶，對纖維素的水解具有較強的活性而成為當(dāng)今研究的熱點。其中研究最多的木霉真菌有里氏木霉（T. reesei）、綠色木霉（T. viride）、康氏木霉（T.koningii）和擬康氏木霉（T. pseudokoningii）[3]。在酶學(xué)性質(zhì)的研究中，纖維素酶的活性受到多種因素的影響[4]。pH和溫度是影響纖維素酶活力的重要因素，也是酶制劑應(yīng)用中的一個主要參數(shù)。研究發(fā)現(xiàn)，木霉屬真菌產(chǎn)生的纖維素酶具有一定的熱穩(wěn)定性，最適反應(yīng)溫度變化范圍在40～60 ℃之間[5]；此外，纖維素酶在酸性環(huán)境中有較高的酶活，大多數(shù)纖維素酶組分最適pH在4～5之間，且酶活性與溫度有關(guān)[6]。近幾年來，人們陸續(xù)篩選到了一些耐堿性的細(xì)菌和真菌[7]，但是大規(guī)模工業(yè)化的生產(chǎn)對纖維素酶提出了更高的要求。為了選育高酶活的纖維素分解菌株，本研究在前期研究的基礎(chǔ)上，以20株木霉供試菌株為試驗對象，用CMC-Na培養(yǎng)基篩選出產(chǎn)酶高活性菌株，并研究溫度和pH對所產(chǎn)纖維素粗酶的影響，為高產(chǎn)纖維素酶木霉菌株的開發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 菌株來源 20株供試菌株由西南林業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院提供，于-70 ℃條件下保存。菌株名稱及編號為康氏木霉（Trichoderma koningii）：SWFC8662、SWFC8665、SWFC8676、SWFC8679、SWFC8675；深綠木霉（Trichoderma atroviride）：SS003、SWFC 8686、SWFC 8956；哈茨木霉（Trichoderma harzianum）：SWFC 8705、SWFC 8719、 SWFC 8696、 SWFC 8713；長枝木霉（Trichoderma longibrachiatum）：SWFC 8690、SWFC 8682、SWFC 8661；綠色木霉（Trichoderma viride）：LS020；里氏木霉（Trichoderma reesei）：SWFC 8709、SWFC 8732、SWFC 8695、SWFC 8727。

1.1.2 主要試劑 葡萄糖、CMC-Na、（NH4）2SO4、NH4NO3、MgSO4·7H2O、KH2PO4、NaCl、剛果紅、NaOH、Na2HPO4、檸檬酸、3，5-二硝基水楊酸、酒石酸鉀鈉、苯酚、無水亞硫酸鈉，所有藥品均為分析純試劑，購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基 PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯 200 g、葡萄糖 20 g、瓊脂 17 g、水1 000 mL，自然pH；初篩培養(yǎng)基[8]（剛果紅-CMC-Na培養(yǎng)基）：CMC-Na 2 g、（NH4）2SO4 2 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、KH2PO4 1 g、剛果紅 0.2 g、瓊脂 20 g、水1 000 mL、自然pH；種子培養(yǎng)基：馬鈴薯 200 g、葡萄糖 20 g、水1 000 mL、自然pH；發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基[9]：CMC-Na 10 g、（NH4）2SO4 4 g、KH2PO4 2 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、水1 000 mL、自然pH。

1.1.4 儀器和設(shè)備 BHC-1300ⅡA/B3生物安全柜；HH-S型水浴鍋；722型可見分光光度計；MLS-3750型高壓滅菌器；P270型搖床；5810R型高速冷凍離心機。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌株活化 將20株凍藏菌株在38℃的水浴鍋中迅速解凍，在無菌條件下將其轉(zhuǎn)移到PDA平板上，每個菌株設(shè)2個重復(fù)，室溫下培養(yǎng)5 d。

1.2.2 菌株種子液體培養(yǎng) 在裝有50 mL液體種子培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中接入2塊直徑為6 mm的菌塊，每個菌株設(shè)2個重復(fù)，在25～28 ℃下，120 r/min搖床中培養(yǎng)2 d，作為液體種子。

1.2.3 產(chǎn)纖維素酶菌株的初篩 將供試木霉菌株接種在初篩培養(yǎng)基上，每個平板上3個菌落，使其均勻分布。25～28 ℃培養(yǎng)72 h后，測量菌落直徑和透明圈直徑大小。根據(jù)透明圈和菌落直徑比值的大小衡量纖維素酶的產(chǎn)生能力并進行產(chǎn)酶菌株的初步選擇。

1.2.4 產(chǎn)纖維素酶菌株復(fù)篩

1）產(chǎn)酶培養(yǎng)。根據(jù)初篩結(jié)果，將初步篩選出來的菌株以4%（V/V）的接種量接種到盛有100 mL發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，每個菌株設(shè)3個重復(fù)，在25～28 ℃、120 r/min的搖床中培養(yǎng)4 d。發(fā)酵液經(jīng)多層紗布過濾，4 ℃、5 000 r/min條件下離心20 min，上清液即為粗酶液。

2）纖維素酶活力測定。參照巫小琴等[10]的方法并稍加改動。將1.0 mL粗酶溶液在50 ℃水浴鍋中預(yù)熱2 min，加入4 mL已預(yù)熱至50 ℃的1.2%羧甲基纖維素鈉溶液后再置于50 ℃水浴中準(zhǔn)確保溫15 min。保溫結(jié)束后立即加入1 mL 2 mol/L氫氧化鈉溶液和2 mL DNS顯色液，搖勻并置于沸水浴中5 min后取出，流水迅速冷卻后定容至50 mL，搖勻后于722型分光光度計490 nm處測定吸光值。每個樣品設(shè)3個重復(fù)，以失活的粗酶液做對照。用葡萄糖做標(biāo)準(zhǔn)曲線，以每1 mL酶提取液15 min催化CMC-Na水解產(chǎn)生1 mg葡萄糖為1個酶活力單位（U）。

1.2.5 纖維素酶的最適溫度及熱穩(wěn)定性測定 取粗酶液各1.0 mL，按“1.2.4”中“2）”的反應(yīng)系統(tǒng)分別于40、45、50、55、60、65 ℃溫度下反應(yīng)15 min后，測定不同溫度下的酶活力。

1.2.6 高產(chǎn)酶菌株纖維素酶的最適pH及酸堿穩(wěn)定性測定 取粗酶液1.0 mL，加入0.2 mol/L Na2HPO4-檸檬酸緩沖液2 mL，按“1.2.4”中“2）”的反應(yīng)系統(tǒng)分別于pH為3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0的條件下反應(yīng)15 min后，測定不同pH條件下的酶活力。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)纖維素酶菌株的初篩

供試20株木霉在剛果紅培養(yǎng)基上生長3 d后菌落直徑、水解圈直徑及清晰度見表1。由表1可知，20株供試菌株中僅2株哈茨木霉（SWFC8703、SWFC8719）在纖維素酶篩選培養(yǎng)基上未觀察到水解圈產(chǎn)生，表明他們沒有產(chǎn)生纖維素酶的能力。而其余18株木霉在纖維素酶篩選培養(yǎng)基上生長時均不同程度地出現(xiàn)了水解圈即具有產(chǎn)生纖維素酶的能力，但各菌株產(chǎn)酶能力不同，所產(chǎn)水解圈的大小和清晰度存在一定差異。其中SWFC 8675、SWFC 8676、SS003、SWFC 8686、SWFC 8696、SWFC 8713、SWFC 8690、SWFC 8661、SWFC 8709、SWFC 8732、LS020這11株木霉產(chǎn)生的水解圈清晰度較好，水解圈直徑與菌落直徑之比大于1.10，產(chǎn)纖維素酶的能力較強。

2.2 產(chǎn)纖維素酶菌株的復(fù)篩

對初篩獲得的11株產(chǎn)纖維素酶較強的菌株進行復(fù)篩，結(jié)果見圖1。由圖1可知，11株供試木霉液體發(fā)酵后發(fā)酵液中均檢測出了纖維素酶活性，但各菌株的產(chǎn)酶能力存在著明顯差異。11株木霉中有8株木霉的纖維素酶活性大于1 U，其中綠色木霉LS020、深綠木霉SS003和SWFC8686 3個菌株的纖維素酶活性超過1.4 U，平均分別達到1.595、1.644和1.420 U，顯示出了較強的產(chǎn)酶能力。纖維素酶活性小于1 U的菌株僅有3株，分別為長枝木霉SWFC8690、里氏木霉SWFC8709和SWFC8732，其中產(chǎn)酶能力最差的菌株為SWFC8690，平均酶活性僅為0.344 U且與SWFC8709和SWFC8732菌株間存在顯著差異（P<0.05）。

2.3 SS003菌株產(chǎn)纖維素酶的基本性質(zhì)

2.3.1 溫度對SS003菌株纖維素酶活性的影響 SS003菌株的粗酶液在40、45、50、55、60、65 ℃溫度梯度條件下的酶活性見圖2。從圖2可以看出，SS003產(chǎn)生的纖維素酶（粗酶）在40～60 ℃溫度范圍內(nèi)酶活力隨溫度的升高逐漸增加，但增加幅度不大。而當(dāng)溫度超過60 ℃時，隨溫度的繼續(xù)升高，酶活力迅速下降。以上結(jié)果表明SS003的粗酶在60 ℃以下溫度范圍內(nèi)對熱較穩(wěn)定。而當(dāng)溫度超過60 ℃后其熱穩(wěn)定性迅速下降。通過趨勢圖的比較可得出SS003菌株所產(chǎn)纖維素粗酶的最適反應(yīng)溫度范圍為55～60 ℃。

2.3.2 pH對酶活性的影響 SS003菌株的粗酶液分別在pH為3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0條件下的酶活性見圖3。從圖3可以看出，SS003產(chǎn)生的纖維素粗酶在3.0～6.0的pH范圍內(nèi)酶活力隨著pH的升高而呈現(xiàn)出逐漸降低的趨勢，但酶活力相對都較高，而當(dāng)pH超過6以后，酶活力急劇下降，當(dāng)pH升至8時酶已完全散失原有活力。以上結(jié)果表明該菌株所產(chǎn)纖維素粗酶具有酸穩(wěn)定性而對堿不穩(wěn)定。通過趨勢圖可以看出，在所測pH范圍內(nèi)SS003的纖維素粗酶在pH 3時的酶活力最高。

3 討論

1）剛果紅纖維素培養(yǎng)基篩選法[11]明顯優(yōu)于傳統(tǒng)的篩選法。該法除了可用于識別產(chǎn)纖維素酶的菌株外，它還可用于初步判定酶活性高低。產(chǎn)酶越多，水解圈越大，產(chǎn)酶越快，水解圈出現(xiàn)越早。因此，根據(jù)水解圈/菌落直徑大小、水解圈出現(xiàn)早遲可粗略估計菌株產(chǎn)酶情況，免去了一一篩選的煩瑣。然而，雖然水解圈大小、水解圈/菌落直徑大小直接反映了酶濃度的高低，但不能完全代表菌株產(chǎn)酶能力，這主要由于各種類型分泌纖維素酶的微生物本身差異就較大，水解圈大小除了同酶濃度有關(guān)外，應(yīng)當(dāng)還涉及到細(xì)胞壁厚薄、菌絲粗細(xì)和疏密、細(xì)胞聚集成團的程度、凝固劑多少而引起的水解酶滲過快慢、菌落與菌落之間相互位置和產(chǎn)物或分泌物抑制等因素，因而以水解圈大小、水解圈/菌落直徑大小作為菌株產(chǎn)纖維素酶活力大小的定量指標(biāo)是不可靠的，所以液體發(fā)酵復(fù)篩必不可少。只要能產(chǎn)纖維素酶的菌株都應(yīng)該進行液體發(fā)酵，測定酶活力，這樣得出的數(shù)據(jù)才比較可靠。

2）深綠木霉SS003在供試菌株中產(chǎn)生的纖維素酶活力最強，達到了1.64 U。通過測定不同溫度和pH梯度條件下SS003的酶活力，發(fā)現(xiàn)該菌株產(chǎn)生的纖維素酶在一定范圍內(nèi)對熱（40～60 ℃）和酸（pH 3～6）都具有穩(wěn)定性；其最適反應(yīng)溫度為55～60 ℃、最適反應(yīng)pH為3。本研究探索了木霉屬部分菌株產(chǎn)纖維素酶的基本情況，發(fā)現(xiàn)了產(chǎn)纖維素酶活力最強的菌株SS003，為木霉屬高產(chǎn)纖維素酶菌株的開發(fā)和利用奠定了基礎(chǔ)。但是由于本研究供試菌株數(shù)量較少，若要全面反映木霉屬產(chǎn)纖維素酶的情況，相關(guān)研究還有待進一步深入。

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