姜上川 梅超 王小芳 張大鵬

摘要：為研究天然植物激素脫落酸（ABA）作為轉(zhuǎn)基因植物選擇性除草劑以實(shí)現(xiàn)環(huán)境友好型除草策略的可能性，采用改變擬南芥SOAR1基因表達(dá)的方法可以大幅度調(diào)控植物對(duì)ABA的耐受性，通過(guò)SOAR1基因過(guò)量表達(dá)獲得對(duì)ABA耐受性高度增強(qiáng)的轉(zhuǎn)基因植物。進(jìn)一步通過(guò)植物在不同生長(zhǎng)時(shí)期對(duì)ABA耐受性的試驗(yàn)檢測(cè)ABA除草劑的有效濃度。結(jié)果表明，SOAR1過(guò)量表達(dá)轉(zhuǎn)基因植物種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)對(duì)ABA的耐受性超出了目前已知的極限，過(guò)量表達(dá)株系OE1、OE3和OE6所能夠耐受ABA的最高濃度在種子萌發(fā)期為200 μM，在幼苗期生長(zhǎng)期為500 μM。以最大限度抑制雜草生長(zhǎng)發(fā)育和最少影響作物正常生長(zhǎng)發(fā)育為前提，設(shè)定ABA除草劑的有效除草濃度范圍在種子萌發(fā)期為3～100 μM，在幼苗生長(zhǎng)期為10～200 μM。

關(guān)鍵詞：脫落酸； SOAR1； ABA耐受性； 轉(zhuǎn)基因植物； ABA除草劑

中圖分類(lèi)號(hào)：S451 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2016）05-1172-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.05.021

Potential Weed Control Based on High ABA Tolerance of SOAR1-overexpression Plants

JIANG Shang-chuan， MEI Chao， WANG Xiao-fang， ZHANG Da-peng

（ School of Life Sciences， Tsinghua University， Beijing 100084，China ）

Abstract： To study the potential eco-friendly weed control strategy with abscisic acid （ABA） as the selective herbicide for transgenic plants， we employed plant materials with changes in the expression level of SOAR1 which sharply regulate ABA tolerance in Arabidopsis. Transgenic plants with dramatically increased ABA tolerance can be obtained by overexpressing SOAR1. Additionally， a set of ABA tolerance assays during different growth stages were conducted to test the effective concentration of ABAs herbicidal activity. The results showed that the ABA tolerance of SOAR1-overexpression plants goes beyond the known extremity， and the highest endurable concentration of ABA for overexpression lines OE1， OE3 and OE6 was 200 μM during seed germination and 500 μM during seedling growth， respectively. With the precondition of maximum growth repression of weed and minimum growth inhibition of transgenic plants， the effective concentration range of ABAs herbicidal activity was 3～100 μM during seed germination and 10～200 μM during seedling growth， respectively.

Key words： abscisic acid （ABA）； SOAR1； ABA tolerance； transgenic plant； ABA herbicide

天然植物激素脫落酸（Abscisic acid，ABA）參與調(diào)控植物生長(zhǎng)發(fā)育各個(gè)階段，包括種子休眠、萌發(fā)，幼苗生長(zhǎng)、側(cè)根生長(zhǎng)、氣孔運(yùn)動(dòng)以及營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)向生殖生長(zhǎng)轉(zhuǎn)換等過(guò)程，并在植物對(duì)外界多種逆境脅迫的響應(yīng)中起著重要作用[1-3]。

擬南芥中有450多個(gè)PPR（Pentatricopeptide repeats）基因家族成員。PPR蛋白在細(xì)胞內(nèi)主要分布在線(xiàn)粒體、葉綠體或其他亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)內(nèi)，參與細(xì)胞器mRNA的加工過(guò)程，包括剪切、剪接、穩(wěn)定、RNA編輯以及蛋白質(zhì)翻譯起始和核糖體組裝[4]。目前在擬南芥中已發(fā)現(xiàn)幾個(gè)PPR蛋白參與了ABA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程，如PPR40[5]、ABO5[6]、SLG1[7]、PGN[8]與AHG11[9]等。所有這些PPR蛋白均定位在線(xiàn)粒體中，并可能通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞器中的活性氧產(chǎn)生來(lái)參與ABA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。

清華大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院實(shí)驗(yàn)室在擬南芥中發(fā)現(xiàn)的一種細(xì)胞質(zhì)-核定位的PPR蛋白SOAR1參與ABA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[10，11]。研究發(fā)現(xiàn)，改變SOAR1的基因表達(dá)可以大幅度調(diào)控植物對(duì)ABA的耐受性；尤其是SOAR1過(guò)表達(dá)植物種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)對(duì)ABA的耐受性超出了目前已知的極限[10，11]。本研究通過(guò)SOAR1基因過(guò)量表達(dá)，獲得對(duì)ABA耐受性高度增強(qiáng)的轉(zhuǎn)基因植物，為天然植物激素ABA作為轉(zhuǎn)基因植物的選擇性除草劑、實(shí)現(xiàn)環(huán)境友好型綠色除草提供一種可能。

1 材料與方法

1.1 植物材料

①擬南芥（Arabidopsis thaliana）野生型（Col）種子購(gòu)自美國(guó)俄亥俄州立大學(xué)擬南芥生物資源中心（ABRC）；②SOAR1基因表達(dá)調(diào)低的2個(gè)T-DNA插入突變體soar1-2和soar1-3種子購(gòu)自凡爾賽遺傳學(xué)和植物育種實(shí)驗(yàn)室擬南芥資源中心（http：//dbsgap.versailles.inra.fr/portail/），SOAR1（AT5G11310）基因T-DNA插入突變體soar1-2（FLAG_546D07）和soar1-3（FLAG_500B04），其遺傳背景為Col生態(tài)型；③擬南芥野生型Col用于獲得SOAR1轉(zhuǎn)基因過(guò)表達(dá)植物。SOAR1過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株OE1、OE3和OE6等為本實(shí)驗(yàn)室獲得并保存；④ABI2 （AT5G 57050）轉(zhuǎn)基因過(guò)表達(dá)植株ABI2-OE為本實(shí)驗(yàn)室保存[12]，ABI5（AT5G36270）功能缺失突變體abi5-1 （CS8105：abi5-1）為本實(shí)驗(yàn)室保存并與野生型Col回交。這兩個(gè)遺傳材料都是公認(rèn)的ABA不敏感突變材料[12，13]，其中ABI2-OE對(duì)ABA強(qiáng)烈脫敏[10-12]。以上所有植物材料均經(jīng)過(guò)了分子鑒定[10，11]。

1.2 植物生長(zhǎng)條件

在超凈工作臺(tái)中，用0.5%（V/V）次氯酸鈉溶液浸泡漂洗擬南芥種子15 min，再用無(wú)菌水漂洗5次，之后將種子播在MS固體培養(yǎng)基上。4 ℃低溫層積處理3 d后，將平板放入光照培養(yǎng)箱生長(zhǎng)10 d左右，將幼苗移栽到營(yíng)養(yǎng)土中生長(zhǎng)。光周期為16 h/8 h（光照/黑暗），溫度為20～22 ℃，光照強(qiáng)度為120 μm/m2s。

2 結(jié)果與分析

2.1 SOAR1過(guò)量表達(dá)株系種子萌發(fā)期A(yíng)BA除草濃度的選擇區(qū)間

將擬南芥野生型Col、SOAR1過(guò)量表達(dá)株系OE1、OE3和OE6、SOAR1低表達(dá)突變體soar1-2和soar1-3、ABA不敏感對(duì)照ABI5功能缺失突變體abi5-1以及具有顯著ABA脫敏表型的ABI2過(guò)量表達(dá)株系A(chǔ)BI2-OE種子直接播種在含有一系列不同濃度ABA （0、3、5、10、100和200 μM）的MS培養(yǎng)基上，4 ℃下低溫層積3 d后移入光照培養(yǎng)箱中，14 d后觀(guān)察幼苗對(duì)ABA的耐受情況，如圖1-A所示。

在含0 μM ABA的MS培養(yǎng)基上，各遺傳材料的幼苗生長(zhǎng)差異不顯著（圖1-B）。從濃度3 μM ABA開(kāi)始，突變體soar1-2和soar1-3與野生型Col表現(xiàn)出無(wú)法耐受，其生長(zhǎng)發(fā)育狀態(tài)基本停滯。而在10 μM ABA培養(yǎng)基上SOAR1過(guò)量表達(dá)轉(zhuǎn)基因株系OE1、OE3和OE6幼苗的真葉與根系生長(zhǎng)幾乎不受ABA影響，其真葉與根系仍能正常生長(zhǎng)發(fā)育，與無(wú)ABA（0 μM）培養(yǎng)基上生長(zhǎng)狀態(tài)接近。

在高達(dá)100 μM ABA的MS培養(yǎng)基上，擬南芥野生型Col被ABA強(qiáng)烈抑制，突變體soar1-2和soar1-3受抑制程度更高，基本上完全不萌發(fā)；而SOAR1過(guò)量表達(dá)轉(zhuǎn)基因株系幼苗仍能正常生長(zhǎng)出真葉與根系。SOAR1過(guò)量表達(dá)株系對(duì)ABA的耐受程度顯著高于對(duì)ABA不敏感突變體abi5-1，并略高于A(yíng)BI2過(guò)量表達(dá)株系A(chǔ)BI2-OE。在含有200 μM ABA的MS培養(yǎng)基上，SOAR1過(guò)量表達(dá)轉(zhuǎn)基因株系OE1、OE3和OE6幼苗的生長(zhǎng)受到ABA的抑制。

結(jié)果表明，在種子直接萌發(fā)生長(zhǎng)條件下，突變體soar1-2和soar1-3與野生型Col（視同雜草）所能夠耐受ABA的最高濃度為3 μM；過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因株系OE1、OE3和OE6（視同作物）所能夠耐受ABA的最高濃度為200 μM?？紤]到ABA濃度要高到能足以抑制雜草種子萌發(fā)，又盡量減少對(duì)SOAR1轉(zhuǎn)基因株系（作物）的萌發(fā)生長(zhǎng)的影響，因此在種子萌發(fā)期，ABA除草劑的有效除草濃度范圍為3～100 μM。

2.2 SOAR1過(guò)量表達(dá)株系幼苗生長(zhǎng)早期A(yíng)BA除草濃度的選擇區(qū)間

如圖2-A所示，將擬南芥野生型Col，SOAR1過(guò)表達(dá)株系OE1、OE3和OE6，SOAR1低量表達(dá)突變體soar1-2和soar1-3，ABA不敏感對(duì)照ABI5功能缺失突變體abi5-1以及具有顯著ABA脫敏表型的ABI2過(guò)量表達(dá)株系A(chǔ)BI2-OE種子直接播種在正常MS培養(yǎng)基上，4 ℃下低溫層積3 d，然后移入光照培養(yǎng)箱中生長(zhǎng)48 h后，再將剛萌發(fā)的幼苗分別移入含有不同濃度ABA （0、 5、10、50、200和500 μM）的培養(yǎng)基上，生長(zhǎng)12 d后觀(guān)察幼苗生長(zhǎng)的情況。

由圖2-B可知，在含0 μM ABA的MS培養(yǎng)基上，各遺傳材料的幼苗生長(zhǎng)差異不顯著。而從5 μM開(kāi)始到10 μM ABA的MS培養(yǎng)基上，野生型Col、突變體soar1-2和soar1-3移苗生長(zhǎng)后生長(zhǎng)狀態(tài)受到ABA強(qiáng)烈抑制（子葉不能變綠、根部幾乎不能生長(zhǎng)）。而在含有20 μM ABA的MS培養(yǎng)基上SOAR1過(guò)量表達(dá)株系OE1、OE3和OE6幼苗的真葉與根系生長(zhǎng)狀態(tài)幾乎沒(méi)有受到ABA的抑制，與無(wú)ABA的MS培養(yǎng)基上生長(zhǎng)狀態(tài)接近，其對(duì)ABA的耐受能力高于abi5-1以及ABI2過(guò)表達(dá)株系A(chǔ)BI2-OE。ABA不敏感突變體abi5-1受ABA抑制程度與野生型接近。

在200 μM ABA處理后，野生型Col、突變體soar1-2和soar1-3、ABA不敏感突變體abi5-1不能耐受ABA處理，幾乎停滯生長(zhǎng)；而SOAR1過(guò)量表達(dá)轉(zhuǎn)基因株系OE1、OE3和OE6幼苗子葉仍能轉(zhuǎn)綠，真葉與根系仍能生長(zhǎng)，其對(duì)ABA耐受能力仍強(qiáng)于A(yíng)BI2-OE。直到500 μM ABA處理后，SOAR1過(guò)量表達(dá)轉(zhuǎn)基因株系OE1、OE3和OE6幼苗才能顯現(xiàn)出受到ABA抑制的表型。

以上結(jié)果表明，在移苗生長(zhǎng)條件下，突變體soar1-2和soar1-3與野生型Col（視同雜草）所能夠耐受ABA的最高濃度為10 μM；過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因株系OE1、OE3和OE6（視同作物）所能夠耐受ABA的最高濃度為500 μM。如上所述，考慮到ABA濃度要高到能足以抑制雜草種子萌發(fā)，又盡量減少對(duì)SOAR1轉(zhuǎn)基因株系的萌發(fā)生長(zhǎng)的影響，因此在幼苗期生長(zhǎng)早期，ABA除草劑的有效濃度范圍應(yīng)該為10～200 μM。

3 小結(jié)與討論

本研究通過(guò)SOAR1過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因擬南芥株系（視同作物）與野生型Col、SOAR1低表達(dá)突變體等（視同雜草），在不同生長(zhǎng)時(shí)期對(duì)ABA耐受性的對(duì)比試驗(yàn)，ABA除草劑的有效除草濃度范圍是以最大限度抑制雜草生長(zhǎng)發(fā)育和最少影響作物正常生長(zhǎng)發(fā)育為前提的試驗(yàn)數(shù)據(jù)。得出如下結(jié)論。

1）在種子萌發(fā)期，SOAR1表達(dá)調(diào)低的植物（雜草）所能夠耐受ABA的最高濃度為3 μM；而SOAR1過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因植物（作物）所能夠耐受ABA的濃度高達(dá)200 μM。ABA除草劑的有效除草濃度范圍可設(shè)定為3～100 μM。

2）在幼苗生長(zhǎng)早期，SOAR1表達(dá)調(diào)低的植物（雜草）所能夠耐受ABA的最高濃度為10 μM；而SOAR1過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因植物（作物）所能夠耐受ABA的濃度高達(dá)500 μM。因此ABA除草劑的有效除草濃度范圍可設(shè)定為10～200 μM。

近年來(lái)現(xiàn)代化農(nóng)業(yè)生產(chǎn)過(guò)程中化學(xué)除草劑的使用量日益增加，長(zhǎng)期大量使用化學(xué)除草劑帶來(lái)的有害化學(xué)物質(zhì)殘留造成嚴(yán)重環(huán)境污染，危及農(nóng)業(yè)生態(tài)環(huán)境，不僅對(duì)作物產(chǎn)生藥害，同時(shí)影響人畜健康，亟待采取有效措施加以控制。研究開(kāi)發(fā)天然植物激素類(lèi)（或激素類(lèi)似物）除草劑，即利用植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑（包括人工合成和提取的天然植物激素或激素類(lèi)似物等），取代化學(xué)除草劑是未來(lái)的發(fā)展趨勢(shì)。天然植物激素ABA抑制種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)，可以利用這個(gè)特性開(kāi)發(fā)出一種潛在的除草劑。但要用ABA作為除草劑，作物必須能耐受高濃度的ABA。SOAR1過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因擬南芥株系表現(xiàn)為對(duì)ABA強(qiáng)烈脫敏，幾乎完全阻斷ABA信號(hào)傳導(dǎo)，可以耐受高濃度的ABA。以上證據(jù)表明，通過(guò)獲得SOAR1過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因作物，為利用天然植物激素ABA作為環(huán)境友好型綠色除草劑提供了可能的選擇。當(dāng)然，過(guò)量表達(dá)SOAR1基因在作物中的表現(xiàn)，以及其他作物中的SOAR1類(lèi)似基因的開(kāi)發(fā)，還需要有進(jìn)一步的研究資料。此外，ABA及其合成類(lèi)似物的低成本也是生產(chǎn)上有用的前提條件。隨著ABA發(fā)酵生產(chǎn)技術(shù)的突破，ABA工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)必將為利用天然植物激素ABA除草在農(nóng)業(yè)中推廣應(yīng)用奠定基礎(chǔ)?？梢灶A(yù)計(jì)，利用ABA作為轉(zhuǎn)基因植物的選擇性除草劑具有很高的經(jīng)濟(jì)效益和廣闊的發(fā)展前景。

參考文獻(xiàn)：

[1] FINKELSTEIN R R，GAMPALA S S L，ROCK C D. Abscisic acid signaling in seeds and seedlings[J]. Plant Cell，2002，14（S）：15-45.

[2] ADIE B A T，P？魪REZ-P？魪REZ J，P？魪REZ-P？魪REZ M M，et al. ABA is an essential signal for plant resistance to pathogens affecting JA biosynthesis and the activation of defenses in Arabidopsis[J].Plant Cell，2007，19（5）：1665-1681.

[3] CUTLER S R，RODRIGUEZ P L，F(xiàn)INKELSTEIN R R，et al. Abscisic acid： Emergence of a core signaling network[J].Annual Review of Plant Biology，2010，61：651-679.

[4] SCHMITZ-LINNEWEBER C，SMALL I. Pentatricopeptide repeat proteins： A socket set for organelle gene expression[J]. Trends in Plant Science，2008，13（12）：663-670.

[5] ZSIGMOND L，RIG？魷G，SZARKA A，et al. Arabidopsis PPR40 connects abiotic stress responses to mitochondrial electron transport[J].Plant Physiology，2008，146（4）：1721-1737.

[6] LIU Y，HE J，CHEN Z，et al. ABA overly-sensitive 5 （ABO5）， encoding a pentatricopeptide repeat protein required for cis-splicing of mitochondrial nad2 intron 3， is involved in the abscisic acid response in Arabidopsis[J]. Plant Journal， 2010， 63（5）：749-765.

[7] YUAN H，LIU D. Functional disruption of the pentatricopeptide protein SLG1 affects mitochondrial RNA editing， plant development， and responses to abiotic stresses in Arabidopsis[J]. Plant Journal， 2012，70（3）：432-444.

[8] LALUK K，ABUQAMAR S，MENGISTE T. The Arabidopsis mitochondria-localized pentatricopeptide repeat protein PGN functions in defense against necrotrophic fungi and abiotic stress tolerance[J].Plant Physiology，2011，156（4）：2053-2068.

[9] MURAYAMA M，HAYASHI S，NISHIMURA N，et al. Isolation of arabidopsis ahg11， a weak ABA hypersensitive mutant defective in nad4 RNA editing[J]. Journal of Experimental Botany，2012，63（14）：5301-5310.

[10] JIANG S C，MEI C，WANG X F，et al. A hub for ABA signaling to the nucleus： Significance of a cytosolic and nuclear dual-localized PPR protein SOAR1 acting downstream of Mg-chelatase H subunit[J]. Plant Signaling and Behavior，2014， 9（11）：e972899.

[11] MEI C，JIANG S C，LU Y F，et al. Arabidopsis pentatricopeptide repeat protein SOAR1 plays a critical role in abscisic acid signalling[J]. Journal of Experimental Botany，2014， 65（18）：5317-5330.

[12] SUN H L，WANG X J，DING W H，et al. Identification of an important site for function of the type 2C protein phosphatase ABI2 in abscisic acid signalling in Arabidopsis[J]. Journal of Experimental Botany，2011，62（15）：5713-5725.

[13] FINKELSTEIN R R，LYNCH T J. The Arabidopsis abscisic acid response gene ABI5 encodes a basic leucine zipper transcription factor[J].Plant Cell，2000，12（4）：599-609.