王景超

摘要 玉米轉(zhuǎn)基因方法有多種，最主要的是基因槍轉(zhuǎn)化法和農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法。本文綜述了玉米轉(zhuǎn)基因方法的研究進(jìn)展，對(duì)影響轉(zhuǎn)化頻率的因素進(jìn)行了總結(jié)，并分析了標(biāo)記基因的使用現(xiàn)狀。

關(guān)鍵詞 玉米；轉(zhuǎn)基因；基因槍?zhuān)晦r(nóng)桿菌介導(dǎo)

中圖分類(lèi)號(hào) S513 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 1007-5739（2016）06-0034-02

Study Progress on Maize Transformation Methods

WANG Jing-chao

（Shandong Product Quality Inspection Research Institute，Ji′nan Shandong 250100）

Abstract There are many methods for maize transformation，and the particle bombardment and agrobacterium-mediated transformation are the most commonly used. This paper reviewd the research progress of maize transformation，and the critical factors that influence the transformation frequency.It also analyzed the selected markers.

Key words maize；transformation；particle bombardment；agrobacterium-mediated

從20世紀(jì)80年代中期開(kāi)始，在玉米的遺傳轉(zhuǎn)化方面做出了多種嘗試，主要有電擊法、碳化硅晶體轉(zhuǎn)化法、基因槍法和農(nóng)桿菌介導(dǎo)法。其中基因槍法和農(nóng)桿菌介導(dǎo)法得到了積極發(fā)展[1-2]。80年代末通過(guò)基因槍法首次獲得了可育的轉(zhuǎn)基因玉米[3]，而在1996年，報(bào)道了一種有效的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的玉米轉(zhuǎn)化方法[4]。因?yàn)檗r(nóng)桿菌介導(dǎo)法得到的轉(zhuǎn)基因植株具有單拷貝或低拷貝的優(yōu)點(diǎn)，因此在玉米研究中開(kāi)始傾向于使用這種轉(zhuǎn)化方法。本文對(duì)玉米遺傳轉(zhuǎn)化方法做一綜述，并對(duì)其應(yīng)用前景做一展望。

1 常用的玉米轉(zhuǎn)基因方法

1.1 電擊法

細(xì)胞壁被認(rèn)為是DNA穿過(guò)細(xì)胞的最大障礙，于是原生質(zhì)體被選作最初的轉(zhuǎn)化材料。通過(guò)電擊法轉(zhuǎn)化玉米的原生質(zhì)體，獲得了穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化系[5]，但是得不到可育的轉(zhuǎn)基因植株。目前研究發(fā)現(xiàn)，電擊法轉(zhuǎn)化原生質(zhì)體可當(dāng)作瞬時(shí)轉(zhuǎn)化工具來(lái)分析基因功能[6]。

1.2 碳化硅晶體轉(zhuǎn)化法

碳化硅晶體（SiC）是工業(yè)上生產(chǎn)復(fù)合材料使用的一種針狀晶體[7]，利用攜帶外源遺傳信息的碳化硅晶體轟擊玉米外植體，是一種最簡(jiǎn)單的將DNA導(dǎo)入玉米細(xì)胞的方法。該方法因操作簡(jiǎn)單、成本低廉而深受喜愛(ài)，但是它只能應(yīng)用于很少數(shù)目的組織如分散很好的玉米懸浮培養(yǎng)系[8]或愈傷組織[9]中，影響了該方法的推廣。

1.3 基因槍法

所謂基因槍轉(zhuǎn)化，是指將DNA包裹到重金屬微粒上，通過(guò)外力直接將DNA導(dǎo)入植物細(xì)胞或組織中。因?yàn)楦咚龠\(yùn)動(dòng)的微粒可以很輕松地穿過(guò)細(xì)胞壁，成功避開(kāi)了去除細(xì)胞壁的要求，所以各種類(lèi)型的組織都可作為受體。利用這種方法得到的最早的轉(zhuǎn)基因植株來(lái)自細(xì)胞懸浮培養(yǎng)物和Ⅱ型愈傷受體[3，10-12]。之后，利用Ⅰ型愈傷、幼胚、莖端分生組織等外植體作為受體，也成功獲得了轉(zhuǎn)基因植株[13-16]。在此方法報(bào)道后不足6年的時(shí)間，利用該方法獲得的抗蟲(chóng)轉(zhuǎn)基因品種就已商業(yè)化。利用這種方法獲得了多種不同的玉米基因型的轉(zhuǎn)基因植株。

1.4 農(nóng)桿菌介導(dǎo)法

土壤中的根癌農(nóng)桿菌能利用腫瘤誘導(dǎo)相關(guān)質(zhì)粒（Ti質(zhì)粒）將DNA片段（T-DNA）轉(zhuǎn)到植物細(xì)胞中[17]?？茖W(xué)家們利用這種機(jī)制研究出了多種雙子葉植物的高效轉(zhuǎn)化方法。由于單子葉植物沒(méi)有根癌農(nóng)桿菌的天然宿主，因此推測(cè)這種方法不能推廣到單子葉植物上[18]。盡管如此，科學(xué)家們還是在玉米和其他谷類(lèi)作物上進(jìn)行了嘗試。后來(lái)，利用改造的生物載體成功獲得了轉(zhuǎn)基因玉米。該方法具有整合位點(diǎn)穩(wěn)定、外源插入片段大、外源基因拷貝數(shù)少等優(yōu)點(diǎn)，因此得到了廣泛應(yīng)用。但是它只適用于極少數(shù)的基因型，而且是在農(nóng)藝性狀差的A188自交系和它的變種中有較高的效率。為此，之后又進(jìn)行了大量的嘗試來(lái)擴(kuò)展可適用的基因型和提高轉(zhuǎn)化效率[19-22]。

2 影響轉(zhuǎn)化頻率的因素

經(jīng)過(guò)多年的研究，通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)獲得可育的玉米轉(zhuǎn)基因植株已不再是難題。但是要想獲得高效的轉(zhuǎn)化頻率，還要通過(guò)不斷優(yōu)化轉(zhuǎn)化體系來(lái)實(shí)現(xiàn)。下面就通過(guò)常用的2種轉(zhuǎn)化方法來(lái)總結(jié)影響轉(zhuǎn)化頻率的因素。

影響基因槍法轉(zhuǎn)化成功與否的關(guān)鍵因素可被分為2類(lèi)：生物參數(shù)和物理參數(shù)。最主要的生物參數(shù)是高滲處理和轟擊前的幼胚預(yù)培養(yǎng)[12，23]。為了提高轉(zhuǎn)化頻率，通常會(huì)用添加有甘露醇、山梨醇等的高滲培養(yǎng)基在轟擊前后培養(yǎng)受體材料[12]。物理參數(shù)主要包括金屬微粒的體積、微粒的類(lèi)型、收集微粒的方法、微粒的離心速率、微粒表面黏附的DNA的量等[24-25]。

農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)涉及植物細(xì)胞和細(xì)菌這2種生物體系。要優(yōu)化這個(gè)系統(tǒng)，就需要最大限度地降低細(xì)菌對(duì)植物細(xì)胞的傷害，最大限度地恢復(fù)轉(zhuǎn)化子的活性。為此，可以在侵染階段和共培養(yǎng)階段進(jìn)行一系列條件優(yōu)化。例如，將侵染幼胚的菌液濃度控制在OD值為0.6～0.8[4，20]，將幼胚置于細(xì)菌懸浮液中[26]，在侵染液中添加表面活性劑[27]等；在共培養(yǎng)培養(yǎng)基中添加乙酰丁香酮[4]、硝酸銀[20]、硫酸銅[28]和L-半胱氨酸[19]，并將共培養(yǎng)培養(yǎng)基的pH值調(diào)至5.8[4]，以及將共培養(yǎng)溫度控制在20～25 ℃之間[19]等，這些條件都能在他們各自的研究中有效地提高轉(zhuǎn)化頻率。此外，在侵染之前對(duì)幼胚進(jìn)行熱擊和離心處理，也能提高轉(zhuǎn)化效率[29]。在玉米中，最適的條件是46 ℃熱擊3 min，接著20 000×g離心10 min[28]。

3 標(biāo)記基因的選擇

標(biāo)記基因是用來(lái)篩選和鑒定轉(zhuǎn)化細(xì)胞、組織和轉(zhuǎn)基因植物的有效途徑。最開(kāi)始使用的標(biāo)記基因主要有新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因nptⅡ、潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因hpt，之后又選用了草丁膦乙酸轉(zhuǎn)移酶基因bar和5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶基因epsps等[30]。這些都屬于負(fù)向選擇系統(tǒng)。影響這類(lèi)基因廣泛應(yīng)用的主要問(wèn)題是當(dāng)轉(zhuǎn)基因植物再生成功以后，標(biāo)記基因便毫無(wú)用處，而這些基因已經(jīng)整合到植物基因組中，會(huì)產(chǎn)生一些有毒產(chǎn)物，影響轉(zhuǎn)基因玉米的推廣；并且存在基因漂移的可能性，對(duì)生態(tài)環(huán)境存在潛在威脅。這些都是轉(zhuǎn)基因技術(shù)亟需解決的問(wèn)題。出于標(biāo)記基因安全性和篩選劑性?xún)r(jià)比的考慮，屬于正向選擇系統(tǒng)的甘露糖異構(gòu)酶基因pmi是比較合適的篩選標(biāo)記基因。類(lèi)似基因的安全性使它能應(yīng)用于經(jīng)濟(jì)作物的遺傳轉(zhuǎn)化，因此這類(lèi)基因有望成為以后植物篩選研究的主導(dǎo)系統(tǒng)[31-32]。

4 展望

2009年玉米全基因組測(cè)序完成，為研究玉米基因的功能創(chuàng)造了條件，也為在分子水平上對(duì)玉米進(jìn)行遺傳操作的玉米分子育種提供了直接、準(zhǔn)確、可靠的依據(jù)，為玉米轉(zhuǎn)基因技術(shù)的發(fā)展帶來(lái)了一個(gè)新的契機(jī)。我國(guó)地域廣闊，人口眾多，面臨著人均耕地面積偏少的現(xiàn)狀，加之我國(guó)土地資源具有農(nóng)用土地資源比重小和后備耕地資源不足等特點(diǎn)，這就要求提高單產(chǎn)[19]。通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)可以突破種間隔離、加速育種進(jìn)程，為育種學(xué)者選育高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的新品種提供了新機(jī)遇。

5 參考文獻(xiàn)

[1] ARMSTRONG C L.The first decade of maize transformation：a review and future perspective[J].Maydica，1999，44：101-109.

[2] POTRYKUS I，SPANGENBERG G. Gene Transfer to Plants[M].Berlin：Springer-Verlag，1995.

[3] GORDON-KAMM W J，SPENCER T M，MANGANO M L，et al.Transfo-rmation of maize cells and regeneration of fertile transgenic plants[J].Plant cell，1990，2：603-618.

[4] ISHIDA Y，SAITO H，OHTA S，et al.High efficiency transformation of maize（Zea mays L.）mediated by Agrobacterium tumefaciens[J].Nature Biotechnology，1996，14：745-750.

[5] FROMM M E，TAYLOR L P，WALBOT V.Stable transformation of maize after gene transfer by electroporation[J].Nature，1986，319：791-793.

[6] SHEEN J.Signal transduction in maize and Arabidopsis mesophyll proto-plasts[J].Plant physiology，2001，127：1466-1475.

[7] BRAUN H J.Ceramic material. In：Hempstead C.A.，Worthington W.E. Jr（eds）Encyclopedia of 20th century technology.Taylor & Francis/Rout-ledge，Kentucky，2004，134-136.

[8] FRAME BR，DRAYTON PR，BAGNALL SV，et al.Production of fertile transgenic maize plants by silicon carbide whisker-mediated transform-ation[J].Plant Journal，1994，6：941-948.

[9] PETOLINO J F，HOPKINS N L，KOSEGI B D，et al.Whisker-mediated transformation of embryogenic callus of maize[J].Plant cell report，2000， 19：781-786.

[10] FROMM M E，MORRISH F，ARMSTRONG C，et al.Inheritance and expression of chimeric genes in the progeny of transgenic maize plants[J].Biotechnology，1990，8（9）：833-839.

[11] WALTERS D A，VETSCH C S，POTTS D E，et al.Transformation and inheritance of a hygromycin phosphotransferase gene in maize plants[J].Plant molecular biology，1992，18：189-200.

[12] VAIN P，MCMULLEN M D，F(xiàn)INER J J.Osmotic treatment enhances particle bombardment-mediated transient and stable transformation of maize[J].Plant cell report，1993，12：84-88.

[13] WAN Y，WIDHOLM J M，LEMAUX P G.Type I callus as a bombardment target for generating fertile transgenic maize（Zea mays L.）[J].Planta，1995，196：7-14.

[14] ZHONG H，SUN B，WARKENTIN D，et al.The competence of maize shoot meristems for integrative transformation and inherited expression of transgenes[J].Plant physiology，1996，110：1097-1107.

[15] ZHANG S，WILLIAMS-CARRIER R，LEMAUX P G.Transformation of recalcitrant maize elite inbreds using in vitro shoot meristematic cultures induced from germinated seedlings[J].Plant cell report，2002，21：263-270.

[16] AHMADABADI M，RUF S，BOCK R.A leaf-based regeneration and transformation system for maize（Zea mays L.）[J].Transgenic research，2007，16：437-448.

[17] GELVIN S B.Agrobacterium-mediated plant transformation：the biology behind the “genejockeying” tool[J].Microbiology and molecular biology reviews，2003，67：16-37.

[18] HERNALSTEENS J P，THIA-TOONG L，SCHELL J，et al.An Agrobac-terium-transformed cell culture from the monocot Asparagus officinalis[J].The EMBO Journal，1984，3：3039-3041.

[19] FRAME B R，SHOU H，CHIKWAMBA R K，et al.Agrobacterium tumef-aciens-mediated transformation of maize embryos using a standard binary vector system[J].Plant Physiology，2002，129：13-22.

[20] ISHIDA Y，SAITO H，HIEI Y，et al.Improved protocol for transformation of maize（Zea mays L.）mediated by Agrobacterium tumefaciens[J].Plant Biotechnology，2003，20：57-66.

[21] QUAN R，SHANG M，ZHANG H，et al.Improved chilling tolerance by transformation with betA gene for the enhancement of glycinebetaine synthesis in maize[J].Plant science，2004，166：141-149.

[22] ZHAO Z Y，GU W，CAI T，et al.High throughput genetic transformation mediated by Agrobacterium tumefaciens in maize[J].Molecular breeding，2001，8：323-333.

[23] SONGSTAD D D，ARMSTRONG C L，PETERSEN W L，et al.（1996）Production of transgenic maize plants and progeny by bombardment of Hi-II immature embryos[J].In vitro cellular & developmental biology plant，1996，32：179-183.

[24] FRAME B R，ZHANG H，COCCIOLONE S M，et al.Production of trans-genic maize from bombarded Type II callus：Effect of gold particle size and callus morphology on transformation efficiency[J].In vitro cellular & developmental biology plant，2000，36：21-29.

[25] HORIKAWA Y，YOSHIZUMI T，KAKUTA H.Transformants through pollination of mature maize（Zea mays L.）pollen delivered bar gene by particle gun[J].Grassland science，1997，43：117-123.

[26] TRICK H N，F(xiàn)INER J J.SAAT：Sonication-assisted Agrobacterium-mediated transformation[J].Transgenic research，1997，6：1-8.

[27] HUANG X，WEI Z.Successful Agrobacterium-mediated genetic transfo-rmation of maize elite inbred lines[J].Plant cell tissue and organ culture，2005，3：187-200.

[28] ISHIDA Y，HIEI Y，KOMARI T.Agrobacterium-mediated transformation of maize[J].Nature protocols，2007，2：1614-1621.

[29] HIEI Y，ISHIDA H，KASAOKA K，et al.Improved frequency of transfor-mation in rice and maize by treatment of immature embryos with centrifugation and heat prior to infection with Agrobacterium tumefaciens[J].Plant cell tissue and organ culture，2006，87：233-243.

[30] 史慶玲.玉米轉(zhuǎn)基因方法研究進(jìn)展[J].生物技術(shù)進(jìn)展，2011，1（3）：178-183.

[31] JOERSBO M，DONALDSON I，KREIBERG J，et al.Analysis of mannose selection used for transformation of sugar beet[J].Molecular breeding，1998，4：111-117.

[32] 張彥琴.玉米轉(zhuǎn)基因技術(shù)研究現(xiàn)狀及發(fā)展趨勢(shì)[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015（32）：197-199.