周純潔 劉歡 趙博 鄧美林 黃思瑜

摘要 為了完善植物生長(zhǎng)延緩劑殘留檢測(cè)技術(shù)，建立了快速測(cè)定蔬菜中3種強(qiáng)極性植物生長(zhǎng)延緩劑（矮壯素、縮節(jié)胺和丁酰肼）的QuEChERS-HILIC-MS/MS方法。考察了不同提取劑對(duì)蔬菜中這3種植物生長(zhǎng)延緩劑的提取效果以及不同吸附劑的凈化效果，并以提取后添加法評(píng)估了黃瓜、番茄、蘿卜、白菜及四季豆中各化合物的基質(zhì)效應(yīng)。樣品經(jīng)QuEChERS方法凈化后，采用BEH HILIC色譜柱為分析柱，乙腈和10 mmol/L乙酸銨水溶液作流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫。質(zhì)譜分析采用電噴霧正離子電離，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式，以基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線外標(biāo)法定量。3種植物生長(zhǎng)延緩劑在各自濃度范圍內(nèi)線性良好，回收率在80.5%～109.0%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）在1.1%～8.6%之間。方法操作簡(jiǎn)便、快速、靈敏度和準(zhǔn)確性較好，可滿足蔬菜中植物生長(zhǎng)延緩劑殘留量快速測(cè)定的需要。

關(guān)鍵詞 植物生長(zhǎng)延緩劑；蔬菜；QuEChERS；HILIC

中圖分類號(hào) TQ452.2 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 1007-5739（2016）06-0268-04

Determination of Three Extremely Polar Plant Growth Retardators in Vegetables by QuEChERS-HILIC-MS/MS

ZHOU Chun-jie LIU Huan ZHAO Bo DENG Mei-lin HUANG Si-yu

（Chongqing Institute for Food and Drug Control，Chongqing 401121）

Abstract A new method for the rapid determination of three extremely polar plant growth retardators（chlormequat chloride，mepiquat chloride and daminozide）residues in vegetables was developed by using QuEChERS-HILIC-MS/MS，in order to improve determination method for plant growth retardators residues. Both the extraction effect and clean-up effect for the three plant growth retardators in vegetables were studied by using different extracting agents and sorbents. The addition method after extraction was used to evaluate the matrix effects（ME）of the compounds in matrix of cucumber，tomato，radish，cabbage and kidney bean. The analytes were extracted by QuEChERS and chromatographic analysis was carried out on a BEH HILIC column using a mobile phase comprised of acetonitrile and 10 mmol/L ammonium acetate solution in gradient program. The plant growth retardators were analyzed by positive electrosprary ionization（ESI+）tandem mass spectrometry under multiple reaction monitoring mode. Quantification was achieved using matrix-matched external standard method. The calibration curves showed good linearity in each concentration range，and the recoveries of the three plant growth retardators were between 80.5% and 109.0%，with the relative standard deviation（RSD）ranging from 1.1% to 8.6%. The method is simple，convenient，sensitive and accurate，and suitable for the rapid determination of plant growth retardators residues in vegetables.

Key words plant growth retardator；vegetable；QuEChERS；HILIC

植物生長(zhǎng)延緩劑是指能夠延緩植物亞頂端分生組織的細(xì)胞分裂和生長(zhǎng)的一類人工合成的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，可有效控制植物徒長(zhǎng)，提高農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量，但如果施用不當(dāng)，可能會(huì)在農(nóng)作物中殘留，從而給人體帶來(lái)危害。隨著人們對(duì)植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑在蔬菜中殘留問(wèn)題的關(guān)注度不斷提高，其殘留限量標(biāo)準(zhǔn)也在不斷被加強(qiáng)[1-3]。矮壯素、縮節(jié)胺和丁酰肼是3種常見(jiàn)的植物生長(zhǎng)延緩劑，由于其極性都非常強(qiáng)且無(wú)生色基團(tuán)，采用氣相色譜法或液相色譜法測(cè)定往往需要衍生化，操作繁瑣，無(wú)法滿足保質(zhì)期普遍較短的蔬菜中的測(cè)定需求。因此，有必要建立蔬菜中這3種強(qiáng)極性植物生長(zhǎng)延緩劑殘留量的快速測(cè)定方法。

目前，針對(duì)矮壯素和縮節(jié)胺測(cè)定方法的研究相對(duì)較多，主要是液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜法，但針對(duì)丁酰肼測(cè)定方法的研究相對(duì)較少[4-7]。本試驗(yàn)將簡(jiǎn)便、快速且有效的QuEChERS樣品前處理技術(shù)與對(duì)強(qiáng)極性化合物有良好保留能力的親水作用色譜（HILIC）分離技術(shù)相結(jié)合，建立了同時(shí)測(cè)定蔬菜中矮壯素、縮節(jié)胺和丁酰肼的QuEChERS-HILIC-MS/MS方法。在葉菜類、瓜類、茄果類、豆類、塊莖類五大類蔬菜中各選擇1種代表基質(zhì)，考察了方法的基質(zhì)效應(yīng)、回收率、精密度、線性關(guān)系、檢出限及定量限等。通過(guò)QuEChERS-HILIC-MS/MS方法進(jìn)行測(cè)定，可有效縮短蔬菜中3種強(qiáng)極性植物生長(zhǎng)延緩劑的檢測(cè)周期，提高檢測(cè)效率。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試驗(yàn)儀器。TSQ Endura型三重四級(jí)桿質(zhì)譜（配電噴霧離子源，Thermo-Fisher公司）；U3000型高效液相色譜儀（Thermo-Fisher公司）；VORTEX GENIUS 3型旋渦振蕩器（IKA公司）；Allegra X-30R Centrifuge型臺(tái)式離心機(jī)（Beckman Coulter公司）。

1.1.2 試驗(yàn)試劑。無(wú)水硫酸鎂（分析純）、氯化鈉（分析純）均購(gòu)于成都市科龍化工試劑廠；無(wú)水乙酸鈉（分析純），天津市大茂化工試劑廠；C18粉、乙二胺-N-丙基硅烷（PSA）和石墨化炭黑（GCB）均購(gòu)于美國(guó)Welch公司；乙酸銨（色譜純），CNW公司；乙酸（色譜純），Thermo-Fisher公司；甲酸（色譜純），ACS公司；乙腈（色譜純），Merck公司；試驗(yàn)用水均為超純水。

1.1.3 試驗(yàn)用植物生長(zhǎng)延緩劑。矮壯素（純度>97.2%，Sigma-Aldrich公司），縮節(jié)胺（純度>99.0%）和丁酰肼（純度>97.0%）均購(gòu)于德國(guó)Dr. Ehrenstorfer公司。分別準(zhǔn)確稱取3種植物生長(zhǎng)延緩劑對(duì)照品，用甲醇配成濃度各為1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，-18 ℃儲(chǔ)存。

1.2 樣品前處理

準(zhǔn)確稱取5.00 g已均質(zhì)的蔬菜樣品于50 mL具塞離心管中，加入10 mL含1%乙酸的乙腈，旋渦1 min混勻。加入4 g無(wú)水硫酸鎂，迅速振搖，旋渦振蕩1 min，以4 000 r/min離心5 min。轉(zhuǎn)移2 mL上清液至QuEChERS凈化管（含無(wú)水硫酸鎂200 mg、C18粉50 mg和GCB 20 mg）中，旋渦混合1 min，以10 000 r/min離心2 min。取上清液過(guò)0.22 μm有機(jī)系濾膜，待測(cè)。

1.3 色譜條件

ACQUITY UPLC BEH HILIC色譜柱（50 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流動(dòng)相：A為乙腈，B為10 mmol/L乙酸銨水溶液；柱溫40 ℃；流速0.3 mL/min；進(jìn)樣量5 μL；梯度洗脫程序：0～0.5 min，95% A～60% A；0.5～3.0 min，60% A；3.0～3.5 min，95%A；3.5～5.0 min，95%A。

1.4 質(zhì)譜條件

電噴霧離子源，正離子模式（ESI+），電噴霧電壓：3 500 V，鞘氣：35 Arb，輔助氣：10 Arb，吹掃氣：1 Arb，離子傳輸管溫度：350 ℃，霧化溫度：300 ℃，定性離子對(duì)、定量離子對(duì)、射頻透鏡電壓（RF Lens）和碰撞能（CE）見(jiàn)表1。

2 結(jié)果與分析

2.1 流動(dòng)相的選擇

由于矮壯素、丁酰肼和縮節(jié)胺都是強(qiáng)極性化合物，常見(jiàn)的反相色譜柱對(duì)其保留非常弱，因此本試驗(yàn)采用對(duì)強(qiáng)極性化合物有良好保留能力的親水作用色譜（HILIC）柱作為分析柱[8-10]。試驗(yàn)考察了乙腈-水、乙腈-0.1%甲酸水溶液、乙腈-10 mmol/L乙酸銨水溶液以及乙腈-10 mmol/L乙酸銨水溶液（含0.1%甲酸）為流動(dòng)相時(shí)，3種植物生長(zhǎng)延緩劑的分離效果（圖1）。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，乙腈-水作流動(dòng)相時(shí)，3種化合物均未出峰；當(dāng)加入緩沖鹽乙酸銨時(shí)，3種化合物的峰形和分離度均較理想；但當(dāng)在流動(dòng)相中引入甲酸時(shí)，丁酰肼的色譜峰展寬嚴(yán)重，且矮壯素和縮節(jié)胺分離效果較差。因此，本試驗(yàn)選擇乙腈-10 mmol/L乙酸銨水溶液作為流動(dòng)相。

2.2 QuEChERS樣品前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

2.2.1 萃取。乙腈對(duì)不同極性的物質(zhì)均具有一定的溶解能力，且提取出的色素等干擾物較少，因此QuEChERS方法中常采用乙腈作為提取溶劑。由于丁酰肼分子結(jié)構(gòu)中含有羧基，乙酸的加入有利于其形成結(jié)合態(tài)從而增加其在乙腈中的溶解度，本試驗(yàn)考慮采用酸化乙腈作為提取劑。以黃瓜、番茄、蘿卜、白菜、四季豆為代表基質(zhì)，分別考察了用乙腈和1%乙酸乙腈作為提取劑時(shí)各化合物的回收率（圖2）。結(jié)果表明，乙酸的加入使丁酰肼在5種代表基質(zhì)中的回收率均有較大程度的提高。因此，試驗(yàn)選擇用1%乙酸乙腈作為提取劑。

此外，由于蔬菜中含有大量的水分，QuEChERS方法常在萃取過(guò)程中加入一定量的無(wú)水硫酸鎂-氯化鈉或無(wú)水硫酸鎂-無(wú)水乙酸鈉鹽析及除水。如圖2所示，雖然無(wú)水硫酸鎂-氯化鈉及無(wú)水硫酸鎂-無(wú)水乙酸鈉的加入均使得縮節(jié)胺的回收率有一定程度的提高，但丁酰肼的回收率大大降低。當(dāng)加入無(wú)水硫酸鎂-無(wú)水乙酸鈉時(shí)，5種基質(zhì)中丁酰肼的回收率均低于10%，這可能是由于水溶性無(wú)機(jī)鹽的引入使得提取液中雜質(zhì)增多。為除去提取液中的水分，本試驗(yàn)直接在萃取過(guò)程中加入無(wú)水硫酸鎂。

2.2.2 凈化。QuEChERS方法中常用的吸附劑主要有乙二胺-N-丙基硅烷（PSA）、C18粉及石墨化炭黑（GCB）等。PSA主要用于吸附基質(zhì)中的有機(jī)酸、酚類等，C18粉可去除脂肪等非極性干擾，GCB去除色素及甾醇等干擾物的能力較好[11]。本試驗(yàn)考察了黃瓜、番茄、蘿卜、白菜、四季豆5種基質(zhì)提取液中分別加入PSA、C18粉和GCB的凈化效果，結(jié)果見(jiàn)圖2。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，3種吸附劑的加入均可提高矮壯素和縮節(jié)胺的回收率，但PSA作為吸附劑時(shí)丁酰肼的回收率大大降低。因此，本試驗(yàn)選擇C18粉和GCB作為吸附劑，并加入適量無(wú)水硫酸鎂除水。

2.3 基質(zhì)效應(yīng)的校正

采用提取后添加法評(píng)價(jià)基質(zhì)效應(yīng)（ME），結(jié)果如表2所示。5種基質(zhì)對(duì)矮壯素和縮節(jié)胺均表現(xiàn)出明顯的基質(zhì)抑制效應(yīng)，而對(duì)丁酰肼則表現(xiàn)出很強(qiáng)的基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)。因此，在進(jìn)行定量分析時(shí)需采用空白基質(zhì)配制標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，以校正基質(zhì)效應(yīng)。

2.4 線性方程、方法檢出限及定量限

采用空白基質(zhì)溶液配制3種化合物的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，以峰面積（Y）對(duì)質(zhì)量濃度（X）進(jìn)行線性回歸分析，這3種化合物在相應(yīng)的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（R2>0.99），以3倍信噪比（S/N=3）濃度估算方法檢出限（LOD），以10倍信噪比（S/N=10）所對(duì)應(yīng)濃度作為方法定量限（LOQ）（表3）。

2.5 方法回收率和精密度

以黃瓜、番茄、蘿卜、白菜及四季豆為代表基質(zhì)，進(jìn)行添加回收和精密度試驗(yàn)。3個(gè)添加水平的回收率在80.5%～109.0%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）均不大于8.6%（表4）。

3 結(jié)論與討論

本試驗(yàn)采用QuEChERS樣品前處理技術(shù)，建立了蔬菜中3種強(qiáng)極性植物生長(zhǎng)延緩劑的HILIC-MS/MS快速檢測(cè)方法。對(duì)色譜分離條件及樣品前處理方法均進(jìn)行了優(yōu)化，達(dá)到良好的分離效果并獲得了理想的回收率。本方法簡(jiǎn)便快速，靈敏度和準(zhǔn)確性高，應(yīng)用于日常檢測(cè)可以縮短檢測(cè)周期，降低檢測(cè)成本，對(duì)于完善蔬菜中植物生長(zhǎng)延緩劑殘留檢測(cè)方法具有重要意義。

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