徐燕英 余慧 謝云飛等

摘要[目的]針對食品中屢禁不止的違禁添加色素柯衣定，擬建立一種以整體柱為活性增強基底、適合大批量樣品快速篩查的表面增強拉曼散射（SERS）技術(shù)。[方法]在確定整體柱的合成后，以整體柱的柱狀及其粉碎后的粉末為基底，優(yōu)化金溶膠與樣品的混合比例、體系pH、取樣量和檢測時間，分別建立柯衣定SERS檢測方法。[結(jié)果]以整體柱的柱狀及其粉碎后的粉末為基底分別建立柯衣定的SERS檢測方法，其檢測限分別為0.10和0.25 μg/mL；在10.0 μg/mL濃度下，柯衣定在整體柱柱狀和粉狀承載形態(tài)下獲得的整體增強效果相近，1 138和1 171 cm-1處峰位移在柱狀SERS檢測中的信號強度明顯優(yōu)于粉狀SERS檢測結(jié)果，且柱狀的SERS信號更穩(wěn)定。[結(jié)論]建議采用整體柱的柱狀形態(tài)進行SERS檢測，更具實用價值，有望應(yīng)用于大批量樣品進行快速篩查。

關(guān)鍵詞整體柱；表面增強拉曼（SERS）；柯衣定

中圖分類號TS207文獻標(biāo)識碼A文章編號0517-6611（2016）04-020-04

Effects of Bearing Forms of Monolithic Column on the SERS Detection of Chrysoidine

XU Yanying1，2， YU Hui2， XIE Yunfei2，3 YAO Weirong2* et al （1. Market Supervision Administration of Gusu District， Suzhou， Jiangsu 215100； 2. School of Food Science and Technology， Jiangnan University， Wuxi， Jiangsu 214122；3. Jiangsu Kangzhi Yuan Grain and oil Group Co.，LTD，Suqian，Jiangsu 223600）

Abstract[Objective] To establish a Surfaceenhanced Raman Spectroscopy （SERS） technology for rapid screening of mass samples， with monolithic column as the active substrate. [Method] After ensuring that the monolithic column was synthesized， the detection conditons were optimized based on different bearing forms of monolithic column， including the ratio of gold colloids to sample， pH of system， and Raman detection time. SERS detection method of chrysoidine was established. [Result] With the cylindricity and powder of monolithic column as the substrates， SERS detection limits were 0.10 and 0.25 μg/mL respectively. Under the 10.0 μg/mL concentration， their enhancing effects were close. Signal strengths of 1 138 and 1 171 cm-1 peak shifts in cylindricity SERS detection were significantly superior to those in powder SERS detection.And the cylindricity SERS signal was more stable. [Conclusion] Cylindricity of monolithic column should be used for SERS detection， which has greater practical value， and can be applied in the rapid screening of mass samples.

Key wordsMonolithic column； Surfaceenhanced Raman Spectroscopy； Chrysoidine

由于天然色素在食品加工過程中容易變色，工業(yè)染料柯衣定（別名：堿性橙II）價格低廉，顏色鮮艷，易溶于水，比其他人工合成色素，如日落黃、檸檬黃等更容易對食品上色且不易褪色，因此容易被一些不法商販濫用于黃魚、豆制品、腐竹、辣椒粉等食品中。目前柯衣定的檢測方法主要有高效液相色譜法[1]、超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[2]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[3]、反相高效液相色譜法[4]、薄層色譜掃描法[5]、比色法[6]等，均不適合對大批量樣品進行快速篩查。

拉曼光譜（Raman spectroscopy）能夠提供分子振動能和轉(zhuǎn)動能方面的信息，每種物質(zhì)在單色強光照射下均能產(chǎn)生特定的分子振動能和轉(zhuǎn)動能變化，產(chǎn)生獨一無二的拉曼光譜，因而能對物質(zhì)進行指紋定性乃至定量鑒定。粗糙納米表面結(jié)構(gòu)能將拉曼信號增強106倍[7]，稱為表面增強拉曼散射（Surface Enhanced Raman Scattering，簡稱SERS）。通過SERS技術(shù)能得到高于普通拉曼14個數(shù)量級的檢測效果[8]，極大地提高了拉曼光譜靈敏度，能夠用于檢測更低濃度的待測物質(zhì)，最終達到單分子檢測的目的[9]。目前常用的主流SERS基底有貴金屬溶膠[10]、金銀納米棒[11]、金屬電極[7]、金屬島膜[12]、核殼材料[13]、多孔氧化鋁模板[14]等。基底的表面粗糙度影響SERS信號的增強，目前應(yīng)用最廣泛的經(jīng)典SERS基底是金、銀溶膠[15]。Svec等[16]采用空管柱“原位”聚合法制得性能優(yōu)良的剛性整體柱，常作為色譜柱內(nèi)連續(xù)床固定相應(yīng)用于液相色譜中[17-18]，其物理和化學(xué)穩(wěn)定性好，表面非特異性吸附小，重復(fù)性好，易于制備，適用的pH范圍寬，具有豐富的納米級別的孔徑分布和粗糙表面結(jié)構(gòu)等優(yōu)點，是一種具有極大發(fā)展?jié)摿Φ腟ERS增強活性基底。研究表明，結(jié)合了納米銀溶膠整體柱用于檢測R6G，檢測限可低達10-18 mol/L[19]。整體柱的孔徑分布結(jié)構(gòu)能夠通過改變單體交聯(lián)劑含量、致孔劑組成比例及反應(yīng)溫度來進行調(diào)整[20]。針對近年來頻繁曝光的柯衣定違禁添加問題，筆者通過改變單體交聯(lián)劑含量、致孔劑組成及溫度來調(diào)節(jié)整體柱的孔徑，得到吸附聚集納米金粒子的SERS增強材料，通過整體柱的掃描電鏡圖，以及結(jié)合對10 μg/mL柯衣定的SERS增強效果評價整體柱的SERS增強性能；并分別以其柱狀及其粉末狀態(tài)使用，分別建立柯衣定的檢測方法，考察其檢測限，從而評估其實用價值。

1材料與方法

1.1試驗材料與儀器柯衣定（≥97%）：上海染料研究所；氯金酸鉀（≥99%）：Sigma，USA；甲基丙烯酸縮水甘油酯、乙二醇二甲基丙烯酸酯、環(huán)己醇、十二醇、過氧化苯甲酰（AR）：百靈威科技有限公司。RamTracer200HS便攜式激光拉曼檢測分析儀：美國，785 nm激發(fā)光波長，100～3 300 cm-1光譜掃描范圍，334 mW最大激光功率，6 cm-1分辨率，含簡易型液體樣品池和固體樣品檢測臺；Hitachi S4800 型場發(fā)射掃描電子顯微鏡（Hitachi）：日本。

1.2密度泛函數(shù)理論計算（DFT）采用GaussView 5.0軟件初步繪制柯衣定的3D分子模型，得到原始計算化學(xué)文件；用Ultra Edit32軟件對原始文件進行名稱編輯、路徑修改、優(yōu)化命令和參數(shù)設(shè)定、分子帶電荷及自旋多重度設(shè)定；修改之后文件用FSecure SHH軟件上傳至安裝Linux系統(tǒng)的計算專用電腦中，使用Gaussian 09軟件對柯衣定的3D分子模型進行結(jié)構(gòu)優(yōu)化，依次采用HF、B3LYP算法結(jié)合321G、631G、631G（d）、6311G（d）命令基組，逐漸調(diào)整柯衣定分子的3D模型結(jié)構(gòu)；最后采用freq=raman命令計算柯衣定分子的理論拉曼光譜，得到最終計算化學(xué)文件；采用Gauss View 5.0軟件打開最終文件，得到柯衣定分子的理論拉曼光譜峰以及每個峰對應(yīng)的分子振動形式。

1.3整體柱材料的制備及表征參照整體柱經(jīng)典合成方法[16]，用一次性玻璃注射器分別量取一定比例的單體甲基丙烯酸縮水甘油酯（GMA）、交聯(lián)劑乙二醇二甲基丙烯酸（EDMA）、致孔劑（環(huán)己醇和十二醇），按照GMA∶ EDMA∶環(huán)己醇∶十二醇=24∶16∶54∶6（V∶V∶V∶V）比例混合于燒杯中，加入引發(fā)劑（BPO），用保鮮膜將燒杯密封并氮吹15 min，在氮氣保護下將反應(yīng)溶液分裝入10 mL離心管中，蓋上離心管蓋并豎直放置于55 ℃恒溫水浴鍋中反應(yīng)24 h；反應(yīng)完畢后，用打火機將離心管底部燒熔，方便取出整體柱；將取出的整體柱用無水乙醇浸泡2 h除去殘余反應(yīng)液，再用30 ℃烘箱烘干；將上述整體柱切成1 cm 長的圓柱，并在橫截面上摳出一個小凹槽做樣品池。殘余的整體柱碎末研磨成粉備用。

用小刀將整體柱刮出橫截面表層薄片，采用日本的Hitachi S4800場發(fā)射掃描電子顯微鏡對整體柱進行結(jié)構(gòu)表征，同時結(jié)合色素在整體柱上的SERS檢測效果對整體柱的合成條件進行優(yōu)化。

1.4金溶膠的制備及表征金溶膠采用Fleischmann等[21]的經(jīng)典化學(xué)還原法制備。

1.5拉曼檢測采用便攜式拉曼檢測儀RamTracer200HS（OptoTrace Technologies Co.Ltd），785 nm激發(fā)光，激發(fā)光功率334 mW，拉曼信號積分時間10 s，積分2次，每個樣品平行檢測2次。

1.6SERS檢測柯衣定色素方法的優(yōu)化

1.6.1整體柱柱狀與粉狀承載形態(tài)的選取。稱取不同量的整體柱粉末小心放到載玻片上聚攏，蓋上一層載玻片，以整體柱粉末的位置為中心用力按壓2次，每次保持5 s，形成直徑1 cm的整體柱粉末平面，吸取50 μL等體積比的金溶膠柯衣定混合液輕輕滴加在整體柱粉未表面進行拉曼檢測。

1.6.2最佳檢測時間的選取。吸取50 μL等體積比的金溶膠柯衣定混合液到0.010 g整體柱粉末上和整體柱表面凹槽內(nèi)進行拉曼檢測。

1.6.3金溶膠與樣品比例的選取。將柯衣定與金溶膠不同體積比混勻后，吸取50 μL混合溶液到0.010 g整體柱粉末上和整體柱表面凹槽內(nèi)進行拉曼檢測。

1.6.4樣品pH的選取。吸取6份金溶膠與柯衣定1.0∶1.5體積比的混合液，加入不同量的0.1 mol/L HCl或0.1 mol/L NaOH溶液，分別調(diào)節(jié)pH為1.01、3.10、4.27、6.58、7.74、9.15，吸取50 μL混合溶液到0.010 g整體柱粉末上和整體柱表面凹槽內(nèi)進行拉曼檢測。

1.7數(shù)據(jù)處理采用Raman Analyzer軟件導(dǎo)出Excel數(shù)據(jù)表，再用Origin 8.1軟件繪制圖表。

2結(jié)果與分析

2.1整體柱的優(yōu)化制備與表征選用金溶膠作為整體柱的輔助SERS活性基底，通過優(yōu)化制備得到的整體柱基底掃描電鏡結(jié)果見圖1A。由圖1A可知，50 nm左右的納米金顆粒在整體柱納米級孔徑結(jié)構(gòu)上吸附聚集。用0.1 mol/L HCl和0.1 mol/L NaOH溶液調(diào)整檢測體系的pH，得到柯衣定在整體柱上的SERS信號（圖1B）。由圖1B可知，pH為9.15的柯衣定SERS檢測峰與固體拉曼峰和pH 4.27的SERS檢測峰有較大差別，尤其是1 250～1 550 cm-1峰位移區(qū)域，pH 9.15的檢測環(huán)境下，該區(qū)域1 382 cm-1位移處的峰被顯著增強，將旁邊強度較弱的峰掩蓋。結(jié)合理論計算結(jié)果，該區(qū)域注：A.整體柱基底的SEM照片，B.柯衣定的拉曼圖譜；a.柯衣定的理論計算拉曼光譜，b.試驗測得柯衣定的固體拉曼光譜，c.pH 4.27時柯衣定在整體柱上的SERS光譜，d.pH 9.15時柯衣定在整體柱上的SERS光譜。荷分布改變，分子運動強度發(fā)生改變，從而峰形有所改變。因此，當(dāng)pH為9.15時，柯衣定的定性特征峰為518、994、1 138、1 171、1 298、1 382、1 451、1 584、1 610 cm-1。

2.2整體柱不同承載形態(tài)下檢測柯衣定的條件優(yōu)化

2.2.1最佳檢測時間。在整體柱材料上進行連續(xù)SERS檢測，觀測其信號強度，結(jié)果見圖2。由圖2可知，隨著時間的推移，柯衣定在整體柱材料上的SERS信號逐漸增強到最佳狀態(tài)后，又逐漸減弱，甚至消失，SERS信號只能在一個短時間范圍內(nèi)保持良好的狀態(tài)。針對柱狀，最佳檢測時間段為20～30 s；針對粉末狀，最佳檢測時間段為15～25 s。

結(jié)合SERS增強信號的化學(xué)增強原理以及整體柱材料的信號增強原理，推測隨著時間的推移，被測溶液中的溶劑從整體柱材料內(nèi)部孔隙結(jié)構(gòu)分流，被測分子的濃度逐步增大，所以檢測到逐漸增強的SERS信號；當(dāng)溶劑完全流出，被檢測物質(zhì)處于干燥環(huán)境中時，溶液中的納米金顆粒完全聚沉在整體柱表面，柯衣定分子沒有足夠的空間與納米金顆粒充分結(jié)合，破壞了有效的分子極化率，因此導(dǎo)致SERS信號逐漸降低。

2.2.2金溶膠與樣品比例。由圖3可知，柯衣定過量或量不足時，測得的SERS信號都不是最強，與理論分析結(jié)果一致。對于柱狀，金溶膠與10.0 μg/mL柯衣定體積比為1.0∶1.5的SERS檢測效果最優(yōu)；對于粉末，金溶膠與2.5 μg/mL柯衣定體積比為1.0∶1.5的SERS檢測效果最優(yōu)。

2.2.3樣品pH。采用0.1 mol/L HCl和0.1 mol/L NaOH調(diào)整檢測體系的pH，于最優(yōu)整體柱上最佳檢測時間范圍內(nèi)對柯衣定進行SERS檢測，結(jié)果見圖4。由圖4可知，當(dāng)pH升高時，柯衣定的峰形更加清晰穩(wěn)定，SERS檢測信號也大大增強。與整體柱柱狀承載形態(tài)不同的是，整體柱粉末狀態(tài)檢測時，pH 7.74時對柯衣定的SERS檢測效果略優(yōu)于pH 9.15時的檢測效果。

安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)2016年2.3以整體柱為基底SERS法檢測柯衣定的檢測限將518、994、1 138、1 171、1 298、1 382、1 451、1 584、1 610 cm-1處峰位移為柯衣定的定性特征峰，檢測不同濃度下的信號，結(jié)果見圖5。由圖5可知，隨著柯衣定濃度的減小，柯衣定的SERS信號強度也逐漸減小，能檢測到的特征峰也逐漸減少，對于柱狀，柯衣定的最低檢出濃度為0.1 μg/mL，而對于粉末，柯衣定的最低檢出濃度為0.25 μg/mL，略低于整體柱柱狀SERS檢測方法。

2.4整體柱不同承載形態(tài)檢測方法的比較由圖6可知，同一濃度下的柯衣定在整體柱柱狀和粉狀承載形態(tài)下獲得的整體增強效果相近，1 138和1 171 cm-1處峰位移在柱狀SERS檢測中的信號強度明顯優(yōu)于粉狀SERS檢測結(jié)果。

由表1可知，2種方法在檢測條件和SERS增強原理上非常相似，對柯衣定的SERS檢測限分別為0.10和0.25 μg/mL，整體柱柱狀對柯衣定的檢測略優(yōu)于粉狀。由于整體柱粉末檢測法操作較繁瑣，粉末的用量對檢測效果影響很大，且整體柱粉末質(zhì)輕易漂浮，導(dǎo)致檢測信號不穩(wěn)定，而整體柱柱狀檢測法材料準(zhǔn)備較簡單，檢測效果在一段時間范圍內(nèi)能夠保持穩(wěn)定，因此，建議采用整體柱柱狀SERS檢測法進行試驗。

3結(jié)論與討論

該研究建立了一種以整體柱為SERS增強活性基底的檢測技術(shù)。在對整體柱SERS增強基底進行制備和優(yōu)化的基礎(chǔ)上，確定了能使SERS增強信號最強的整體柱合成方法。使用SEM對整體柱上SERS檢測活性位點進行表征，觀察到納米金顆粒在整體柱上呈吸附聚集狀態(tài)；建立了柯衣定在整體柱柱狀和粉末承載狀態(tài)下的SERS檢測法。在柱狀承載狀態(tài)下，金溶膠與樣品按照1.0∶1.5體積比混合后，調(diào)整體系pH為9.15，在20～30 s檢測時間范圍內(nèi)的SERS檢測信號最好且最穩(wěn)定，檢測限為0.1 μg/mL；在粉狀承載狀態(tài)下，金溶膠與樣品按照1.0∶1.5體積比混合后，調(diào)整體系pH為7.74，取50 μL混合液在15～25 s檢測時間范圍內(nèi)在0.010 g整體柱粉末上的SERS檢測信號最好，檢測限為0.25 μg/mL，檢測信號的穩(wěn)定性不如整體柱柱狀SERS法。該研究建立的以整體柱為SERS增強活性基底的檢測方法，有望用于違禁添加色素柯衣定的快速篩查，但尚需要推廣應(yīng)用于其他種類的違禁色素，并深入探索進行定量檢測的可能性。

整體柱材料的孔徑分布與SERS信號的增強息息相關(guān)。孔徑過大，結(jié)合了柯衣定的納米金粒子容易通過整體柱內(nèi)部孔徑；另外，由于整體柱本身并不具備電磁特性，也不帶電荷，因此需要選擇一種有效的輔助增強基底。目前應(yīng)用最廣泛的SERS增強活性基底是金、銀、銅溶膠[22]，由于該研究所用便攜式激光拉曼儀的激發(fā)波長為785 nm，金溶膠在此波長下的拉曼檢測效果優(yōu)于其他溶膠，因此該試驗選用金溶膠作為整體柱的輔助SERS活性基底。

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