杏鮑菇多糖的提取及其對RAW264.7細胞吞噬活性·NO釋放的影響

王海洋 楊獻玲 韓苗苗等

摘要[目的]以杏鮑菇多糖的理化性質(zhì)作為綜合評價指標，提取杏鮑菇多糖，并研究其對RAW264.7細胞吞噬活性的作用及對NO釋放的影響。[方法]采用水煎煮提取、超聲提取、90 ℃熱水浸提、70 ℃熱水浸提、50 ℃熱水浸提提取杏鮑菇多糖，并采用苯酚-硫酸法、間羥基聯(lián)苯法以及Lowry法測定其總糖、酸性糖和蛋白質(zhì)含量；采用PMP柱前衍生化法和HPGPC法測定其組成糖和分子量分布；采用吞噬中性紅法和Griess試劑盒法測定其吞噬能力及NO的釋放量。[結(jié)果]試驗得出，50 ℃熱水浸提提取的多糖總糖含量最高，超聲提取的多糖蛋白質(zhì)含量最高，各組提取酸性糖含量相當且均較低，水煎煮提取多糖中的單糖種類最少、分子量最低。綜合比較，90 ℃熱水浸提為杏鮑菇多糖的最佳提取方法；在質(zhì)量濃度為25～100 μg/mL，能夠極顯著地促進細胞吞噬中性紅的能力和NO的釋放。[結(jié)論]90 ℃熱水浸提水煎煮為杏鮑菇多糖的最佳提取方法，一定濃度的杏鮑菇多糖能夠提高RAW264.7細胞的吞噬活性，并能促進NO的釋放，提示杏鮑菇多糖具有一定的免疫活性。

關(guān)鍵詞杏鮑菇多糖；提取；理化性質(zhì)；吞噬指數(shù)；一氧化氮

中圖分類號S646文獻標識碼A文章編號0517-6611（2016）04-116-04

Extraction of Pleurotus eryngii Polysaccharides and Its Effects on the Macrophages Activity of RAW264.7 Cell and the Release of NO

WANG Haiyang1， YANG Xianling2， HAN Miaomiao3， XU Duoduo1* et al（1. Changchun University of Chinese Medicine， Changchun， Jilin 130117； 2. Jilin Institute for Drug Control， Changchun， Jilin 130033； 3. Affiliated Hospital of Qingdao University， Qingdao， Shandong 266555）

Abstract[Objective] With the physicochemical property of Pleurotus eryngii polysaccharides as the comprehensive evaluation index， polysaccharides were extracted from P. eryngii； and its effects on the macrophages activity of RAW264.7 cell and the release of NO were researched. [Method] Polysaccharides were extracted from P. eryngii by the methods of water decoction extraction （A）， ultrasonic extraction （B）， 90 ℃ hot water extraction （C）， 70 ℃ hot water extraction （D） and 50 ℃ hot water extraction （E）. Contents of total glucose， acid glucose and protein were detected by phenolsulfuric acid method， mhydroxydiphenyl method and lowry method. Glucose component and molecular weight distribution were detected by PMP precolumn derivatization method and HPGPC method. Phagocytic ability and NO release were detected by neutral red method and Griess kit method. [Result] Polysaccharides and total glucose contents were the maximum in 50 ℃ hot water extraction. Polysaccharides and protein contents were the maximum in ultrasonic extraction. Acid sugar content in each group was relatively low. Monosaccharide type was relatively less in polysaccharides， and molecular weight was relatively low in water decoction extraction. 90 ℃ hot water extraction was the maximum extraction method. 25-100 μg/mL significantly promoted the phagocytic ability and NO release. [Conclusion] 90 ℃ hot water extraction is the optimal extraction method for P. eryngii polysaccharides. A given concentration of P. eryngii polysaccharides enhances the phagocytic activity of RAW264.7 cells， and promotes the NO release， indicating that P. eryngii polysaccharides have certain immunocompetence.

Key wordsP. eryngii polysaccharides； Extraction； Physical and chemical properties； Phagocytic index； NO

是機體內(nèi)重要的免疫細胞，屬于免疫系統(tǒng)的“哨兵”，是繼黏膜屏障之后的機體第2道防御體系，參與抗原處理并將抗原遞呈給免疫活性細胞，是連接先天免疫和獲得免疫的紐帶，在去除病原體、抗腫瘤及一些慢性炎癥疾病中具有不可替代的作用[1]?，F(xiàn)代研究表明，巨噬細胞具有免疫防御、監(jiān)視、調(diào)節(jié)等免疫功能，是生物體重要的免疫效應(yīng)細胞，在生物體的免疫系統(tǒng)中發(fā)揮著不可替代的作用，它通過吞噬作用和分泌多種細胞因子等多種功能而調(diào)控機體的免疫應(yīng)答[2]。

杏鮑菇（Pleurotus eryngii），別名刺芹側(cè)耳，屬側(cè)耳（口蘑）科（Pleurotaceae）側(cè)耳屬（Agaricochaete），是一種十分重要的藥食同源的珍稀食用菌，目前在我國已經(jīng)成為繼金針菇之后的第二大工業(yè)化栽培品種[3]。杏鮑菇子實體營養(yǎng)豐富，含有大量的蛋白質(zhì)、氨基酸、還原性糖、不飽和脂肪酸等膳食纖維，具有很高的營養(yǎng)價值[4]?，F(xiàn)代藥理研究表明，杏鮑菇的主要活性成分為多糖組分，其具有抗氧化、抗腫瘤、抑菌、抗疲勞、降低膽固醇等功效[5-9]。目前，針對各種方法提取杏鮑菇多糖的工藝條件報道有很多[10-13]，但針對各提取方法得到的多糖的理化性質(zhì)、組成糖、分子量差異及免疫活性卻鮮見報道。筆者采用不同方法提取杏鮑菇多糖，比較其理化性質(zhì)、組成糖及分子量差異，并初步研究其免疫活性，旨在為杏鮑菇的進一步資源開發(fā)利用提供新的理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料原料及主要試劑：杏鮑菇，購自吉林農(nóng)業(yè)大學菌菜基地，菌種號：Pleurotus eryngii 2601；右旋糖酐（Dextran）及甘露糖等標準品、脂多糖（LPS）、中性紅，均購自美國Sigma公司；RAW264.7細胞，購自中國科學院上海細胞庫；RPMI 1640培養(yǎng)基等，購自美國Gibco公司；3（4，5二甲基噻唑2）2，5二苯基四氮唑溴鹽（噻唑藍，MTT），美國Amresco；小鼠Griess試劑盒，美國Promega公司；乙腈、甲醇為色譜純，其他試劑均為分析純；水為超純水。主要儀器：MCO15AC 二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱，日本SANYO公司；MK3酶標儀，美國Thermo公司。

1.2方法

1.2.1杏鮑菇多糖的提取。將新鮮杏鮑菇用清水洗凈，切成小塊，風干，于95%乙醇中室溫浸泡24 h后過濾，將濾渣烘干，備用。試驗共分為5組，每組100 g，分別為水煎煮提取（A）、超聲提?。˙）、90 ℃熱水浸提（C）、70 ℃熱水浸提（D）、50 ℃熱水浸提（E）。每次提取1 h，提取3次，分別過濾、濃縮、放至室溫，緩慢向其加入無水乙醇至乙醇濃度為80%，放置過夜，離心（3 000 r/min，5 min），取沉淀，揮去乙醇，凍干，即得杏鮑菇多糖樣品[14]，備用。

1.2.2理化性質(zhì)的測定。分別采用苯酚-硫酸法[15]、間羥基聯(lián)苯法[16]、Lowry法[17]測定所提取多糖的總糖、酸性糖和蛋白質(zhì)含量。

1.2.3組成糖分析。采用PMP柱前衍生化高效液相色譜法，參照文獻[18]步驟制備衍生化產(chǎn)物，根據(jù)單糖標準品與樣品的保留時間確定單糖種類。

色譜條件：Agilent 1200高效液相色譜儀，Grace Apollo C18（5 μm，250 mm×4.6 mm）色譜柱；以不同比例0.025 mol/L磷酸鹽緩沖液（KH2PO4NaOH，pH 6.8）-乙腈作為流動相，梯度洗脫比例見表1；流速0.8 mL/min；柱溫為40 ℃；檢測波長為250 nm。

1.2.4分子量分析。采用高效凝膠分子排阻色譜法進行測定[19]。

1.2.4.1色譜條件。TSK G3000PWxl凝膠色譜柱（300 mm×7.8 mm）、TSK guard column PWML預柱（40 mm×6.0 mm），流動相為0.7%Na2SO4溶液（內(nèi)含0.02%疊氮鈉），流速0.5 mL/min，柱溫35 ℃，進樣量20 μL，RI201H檢測器。

1.2.4.2對照品溶液的制備。精密稱取已知分子量的Dextran T180、T1000、T5000、T12000、T25000的葡聚糖對照品，加流動相配制成5 mg/mL的溶液，過0.45 μm微孔濾膜，作為對照品溶液。

1.2.4.3供試品溶液的制備。取樣品適量，加入流動相配制成濃度為5 mg/mL的溶液，過0.45 μm微孔濾膜，作為供試品溶液。

1.2.5杏鮑菇多糖的吞噬活性及NO含量的測定[20]。RAW264.7細胞培養(yǎng)于含有10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基（含1%雙抗）中，置于37 ℃、5%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔2～3 d更換新鮮培養(yǎng)液，待細胞長滿瓶底80%時，消化、傳代。取對數(shù)生長期的細胞用于試驗。

1.2.5.1杏鮑菇多糖對RAW264.7細胞的影響。將細胞消化調(diào)整至1×105個/mL接種于96孔板中，每孔100 μL，于37 ℃、5%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后棄去培養(yǎng)液，每孔加入不同質(zhì)量濃度各多糖溶液（0、1.50、3.13、6.25、12.50、25.00、50.00、100.00、200.00、400.00、800.00、1 000.00 μg/mL）100.00 μL，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，采用MTT比色法測定其吸光度（A）值。每組5個復孔。

1.2.5.2杏鮑菇多糖對RAW264.7細胞吞噬作用的影響。細胞處理同“1.2.5.1”。試驗分為3組，分別為空白組、對照組和給藥組。空白組加入100 μL新鮮培養(yǎng)液；對照組每孔分別加入10 μg/mL LPS溶液；給藥組加入質(zhì)量濃度為1.50、3.13、6.25、12.50、25.00、50.00、100.00 μg/mL的多糖溶液。將各組置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。培養(yǎng)24 h后傾去液體，每孔加入0.075%的中性紅溶液進行染色，1 h后傾去染色液，用磷酸鹽緩沖液清洗3次，每孔各加入100 μL醋酸乙醇（V/V=1∶1）細胞溶解液，室溫放置過夜，次日于酶標儀在波長492 nm下測定吸光度值。細胞對中性紅吞噬能力用吞噬指數(shù)（pinocytotic index，PI）表示。

吞噬指數(shù)=A試驗A空白×100%

1.2.5.3NO含量的測定。將細胞消化調(diào)整至1×105個/mL接種于6孔板中，每孔1 mL，于37 ℃、5%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后棄去培養(yǎng)液，每孔加入1 mL質(zhì)量濃度為1.50～100.00 μg/mL的多糖溶液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后吸取上清液，離心，取上清，按Griess試劑盒操作計算NO的釋放量。

1.2.6統(tǒng)計學分析。采用SPSS統(tǒng)計軟件進行分析，計量數(shù)據(jù)用±S表示，用單因素方差分析組間差異，以P<0.05具有統(tǒng)計學意義。

2結(jié)果與分析

2.1粗多糖的理化性質(zhì)測定結(jié)果由表2可知，E組提取得到的多糖總糖含量最高，A組提取多糖的總糖含量最低；各組提取得到的酸性糖含量均較低且含量相當；B組提取得到的杏鮑菇多糖的蛋白質(zhì)含量最高。

A、C、D、E組的總糖含量顯示，隨著提取溫度的降低，所得多糖的總糖含量呈上升趨勢，但對酸性糖和蛋白質(zhì)含量影響不大；超聲的空化效應(yīng)能促進蛋白質(zhì)類成分溶出；在水煎煮過程中，溫度過高，會將某些多糖組分破壞，同時也會提取出較多非糖類雜質(zhì)，使總糖含量下降。

2.2組成糖測定結(jié)果由表3可見，各組提取多糖均含有甘露糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖4種單糖。B、C、D、E組提取的杏鮑菇多糖單糖組成相同，只有A組提取多糖不含葡萄糖醛酸，可能的原因是在水煎提取過程中的過高溫度使葡萄糖醛酸受到破壞。

2.3分子量測定結(jié)果高效凝膠色譜法（HPGPC）結(jié)果顯示，A組提取的杏鮑菇多糖分子量較小，分子量分布大于20 000 D的僅占7.73%，其分子量主要分布在300～2 000 D；C組提取多糖分子量相對較高，分子量分布在20 000 D的占55.02%；其余各組多糖分子量分布基本相同，主要集中分布在500～15 000 D。由此可見，水煎煮提取的過高溫度可能使多糖組分中高分子部分受到破壞，使其分子量變小。

2.4杏鮑菇多糖對RAW264.7細胞吞噬作用及NO含量的影響

2.4.1杏鮑菇多糖對RAW264.7細胞的影響。由圖1可知，在試驗濃度下，杏鮑菇多糖直接作用于RAW264.7細胞時，能夠促進RAW264.7細胞增殖，并且，隨著濃度的增大，增殖率隨之升高。在質(zhì)量濃度為1.50～100.00 μg/mL時，杏鮑菇多糖作用于RAW264.7細胞與空白組無明顯差異；200.00 μg/mL能顯著促進RAW264.7細胞增殖；400.00～1 000.00 μg/mL能極顯著促進RAW264.7細胞增殖。

4.7細胞的影響

Fig.1Effects of polysaccharides in different concentration groups on RAW264.7 cells2.4.2杏鮑菇多糖對RAW264.7細胞吞噬能力的影響。由圖2可知，各組提取的多糖在試驗濃度下均能促進RAW264.7細胞吞噬中性紅的能力，并且，隨著濃度的增高，其吞噬指數(shù)也隨之增大。在質(zhì)量濃度為12.50 μg/mL時與空白組相比具有顯著性差異；在質(zhì)量濃度為25.00～100.00 μg/mL時與空白組相比具有極顯著性差異；在質(zhì)量濃度為100.00 μg/mL時，其吞噬指數(shù)大于LPS對照組，提示杏鮑菇多糖具有活化RAW264.7巨噬細胞、提高吞噬能力的作用，可保護機體免受抗原感染。

3結(jié)論與討論

多糖作為良好的免疫調(diào)節(jié)劑，其免疫活性越來越受到國內(nèi)外廣大學者的廣泛關(guān)注，巨噬細胞是免疫系統(tǒng)中的“哨兵”，它會傳遞病原體的信息給淋巴細胞，以此來激活免疫應(yīng)答，所以這類細胞在機體的免疫反應(yīng)中起著重要的作用。

NO是一種新型的生物活性信息遞質(zhì)，具有重要的免疫學功能，在免疫、神經(jīng)和呼吸等多個系統(tǒng)中均發(fā)揮著重要作用，并且廣泛參與到機體的免疫反應(yīng)、炎癥反應(yīng)等多種生理和病理過程中，與獲得性免疫、細胞因子的分泌以及自身免疫病都密切相關(guān)[21]。

該研究以杏鮑菇作為研究對象，分別采用水煎煮法、超聲提取法以及不同溫度的熱水浸提提取杏鮑菇多糖，研究不同提取方法下杏鮑菇多糖的理化性質(zhì)、組成糖、分子量差異。結(jié)果顯示，不同提取方法對杏鮑菇多糖的免疫活性影響不大，隨著提取溫度的升高，會有許多非糖類物質(zhì)溶出，同時多糖分子中的某些組分會受到破壞，使總糖含量相對降低，分子量降低。

以小鼠單核巨噬RAW264.7細胞作為試驗對象，通過分析細胞的增殖能力、吞噬能力、NO釋放水平來探討杏鮑菇多糖的免疫調(diào)節(jié)活性。結(jié)果顯示，杏鮑菇多糖直接作用于RAW264.7細胞能夠激活巨噬細胞，提高其吞噬能力，促進其釋放NO，提示杏鮑菇多糖具有免疫調(diào)節(jié)活性，是一種良好的免疫調(diào)節(jié)劑[22]，這為其開發(fā)成為免疫調(diào)節(jié)藥物提供了一定的試驗依據(jù)，并有待于進一步研究。

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