付維維 劉娟 王業(yè)秋等

摘要[目的]研究甘草黃酮對UVB照射后產(chǎn)生光老化現(xiàn)象的HDF細胞保護作用。[方法]采用30 mJ/cm2的UVB照射HDF細胞建立損傷模型；加入不同濃度的甘草黃酮，24 h后MTT法檢測細胞活性；用試劑盒法測定細胞上清液中谷胱甘肽過氧化物酶（GSHPx）、超氧化物歧化酶（SOD）活性、丙二醛（MDA）含量。[結(jié)果]甘草黃酮濃度為10-9、10-10、10-11 mol/L時，能使受UVB照射損傷的HDF細胞活性增強；甘草黃酮濃度為10-9、10-10 mol/L時，GSHPx、SOD活性升高，MDA含量降低；甘草黃酮濃度為10-11 mol/L時，SOD活性升高、MDA含量降低。[結(jié)論]甘草黃酮能減輕UVB對HDF細胞的損傷，其機制可能與抑制氧化損傷、提高SOD活性有關(guān)。

關(guān)鍵詞甘草黃酮；光老化；UVB；HDF細胞；保護作用

中圖分類號S567.7+1文獻標識碼A文章編號0517-6611（2016）04-170-02

Effects of Licoflavone on HDF Cytoprotection after UVB Injury

FU Weiwei1，2， LIU Juan1， WANG Yeqiu2， LI Jianmin2* et al （1. Jiamusi University， Jiamusi， Heilongjiang 154007； 2. College of Jiamusi， Heilongjiang University of Chinese Medicine， Jiamusi， Heilongjiang 154007）

Abstract[Objective] To research the effects of licoflavone on HDF cytoprotection after UVB injury. [Method] HDF was irradiated under 30 mJ/cm2 UVB to establish injury mode. After adding different concentrations of licoflavone， cell viability was detected by MTT method after 24 h. Contents of GSHPx， SOD and MDA in cell supernatant were detected by kit method. [Result] When licoflavone concentration was 10-9， 10-10 and 10-11 mol/L， HDF activities enhanced after UVB injury. When licoflavone content was 10-9 and 10-10 mol/L， contents of GSHPx， SOD and MDA reduced. When licoflavone content was 10-11 mol/L， SOD activity enhanced and MDA content reduced. [Conclusion] Licoflavone reduces the HDF injury induced by UVB. Its mechanism might be related to the restriction of oxidative damage and the enhancement of SOD.

Key wordsLicoflavone；Photoaging； UVB；HDF cell；Protection effects

皮膚是身體與外界環(huán)境直接接觸的第一道防線，長期暴露于紫外線下會產(chǎn)生氧化應激效應[1]。因紫外線中UVB極大部分被皮膚表皮所吸收，很難滲入皮膚內(nèi)部，所以多數(shù)研究者選擇研究UVB對于皮膚表皮層中角質(zhì)細胞的作用。但由于UVB階能較高，可到達真皮層的成纖維細胞（HDF），導致被照射部位細胞發(fā)生代謝反應，伴隨產(chǎn)生活性氧簇（ROS）[2]，抗氧化防御系統(tǒng)被破壞，產(chǎn)生機體氧化損傷，直接表現(xiàn)為皮膚松弛、干燥、紋理變粗、癌變等[3]。在抑制ROS誘導的損傷方面，人體內(nèi)存在的多種抗氧化酶和非酶性抗氧化物發(fā)揮著巨大的作用，谷胱甘肽過氧化物酶（Glutathione peroxidase，GSHPx）、超氧化物歧化酶（SOD）等抗氧化酶可以清除機體內(nèi)產(chǎn)生的ROS，維持機體平衡，但當機體內(nèi)抗氧化物酶的活性降低或ROS產(chǎn)生過量時，機體細胞會受到損傷，引起氧化-抗氧化平衡系統(tǒng)破壞，產(chǎn)生DNA損傷、酶活性喪失及細胞凋亡等，發(fā)生皮膚發(fā)炎、皺紋，機體出現(xiàn)疾病（腫瘤）等[4]。

甘草黃酮對Fenton反應生成的羥自由基具有較強的直接清除作用[5]，并能與超氧陰離子結(jié)合，阻止自由基反應發(fā)生，降低脂質(zhì)過氧化物丙二醛（MDA）的生成從而發(fā)揮其抗氧化功能及活性。葉懷義等[6]研究表明甘草黃酮能增強衰老小鼠SOD的活性，減少體內(nèi)MDA的含量，延緩了小鼠衰老進程，提高了衰老小鼠抗應激能力。雖然關(guān)于甘草黃酮對皮膚光老化的研究較多，但仍處在起步階段。因此，該試驗通過研究甘草黃酮對UVB損傷的HDF細胞的保護作用，使用試劑盒檢測法檢測細胞上清液中GSHPx、SOD活性和MDA含量的變化，探討甘草黃酮抗皮膚光老化作用，為進一步將其發(fā)展為安全有效的防紫外線制劑提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1細胞。人皮膚成纖維細胞（HDF），來源于上海中喬新舟生物科技有限公司。

1.1.2試劑。FM培養(yǎng)液（上海中喬新舟生物科技有限公司）、胎牛血清（上海中喬新舟生物科技有限公司）、雙抗（上海中喬新舟生物科技有限公司）、二甲基亞砜DMSO（Sigma公司）、MTT（Sigma公司）、胰蛋白酶（Billab公司）、PBS（北京中杉金橋有限公司）、細胞計數(shù)板（上海求精生化試劑儀器有限公司）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSHPx）測定試劑盒（南京建成生物工程研究所）、超氧化物歧化酶（SOD）測定試劑盒（南京建成生物工程研究所）、丙二醛（MDA）測定試劑盒（南京建成生物工程研究所）、冰乙酸（天津市科密歐化學試劑有限公司）、甘草黃酮對照品（質(zhì)量分數(shù)≥98%，成都普菲德生物技術(shù)有限公司）。

1.1.3儀器。紫外照射儀（Sigma公司）、紫外線輻照計（北京師范大學光電儀器廠）、Research UV UF型超純水制備系統(tǒng)（上海和泰儀器有限公司）、IX7121PH型Olympus倒置顯微鏡（日本Olympus株式會社）、HF90型二氧化碳培養(yǎng)箱（上海智城分析儀器有限公司）、ZHWY103B型小容量恒溫培養(yǎng)振蕩器（上海智城分析儀器有限公司）、BCM1000A型生物潔凈工作臺（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）、DK2000ⅢL型電熱恒溫水浴鍋（天津市泰斯特儀器有限公司）、移液器（100～1 000 μl）、YB1201DW型電子天平（上海海康電子儀器廠）、85 K離心機（上海安亭科學儀器廠）、MS500A型半自動生化分析儀（四川美生科技有限公司）、MK3型酶標儀（上海熱電儀器有限公司）、TGL16GC 型高速冷凍離心機（上海安亭科學儀器廠）。

1.2方法

1.2.1藥物與試劑配制。

1.2.1.1藥物的配制。通過預試驗發(fā)現(xiàn)甘草黃酮濃度>10-9mol/L 時對HDF細胞產(chǎn)生毒性，該試驗將甘草黃酮加入FM培養(yǎng)液中，配制成高、中、低（10-9、10-10 、10-11mol/L）3個濃度，調(diào)pH為7.0，0.22 μm孔徑濾膜濾過除菌，-20 ℃保存待用。

1.2.1.2 培養(yǎng)液的配制。培養(yǎng)液按照FM培養(yǎng)液∶胎牛血清∶雙抗=89∶10∶1的比例配制，混勻后，4 ℃保存待用。

1.2.1.3MTT溶液的配制。稱取250 mg MTT，放入小燒杯中，加45 mL PBS（無Ca2+、Mg2+離子，pH=7.2），在50 ℃水浴中攪拌溶解，50 mL容量瓶定容至50 mL，用0.22 μm孔徑濾膜過濾除菌分裝，-20 ℃保存待用。

1.2.2HDF細胞的復蘇。從液氮灌中取出凍存管后，迅速投入37 ℃水浴的同時搖動凍存管，使其快速溶解，移入超凈工作臺中，將凍存的細胞懸液移入一無菌的離心管，同時向該離心管中加入3～4 mL新鮮FM培養(yǎng)液，混勻，1 500 r/min離心3 min，棄去上清，加入3～4 mL新鮮FM培養(yǎng)液吹懸細胞，轉(zhuǎn)入新的培養(yǎng)瓶中，放入37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，次日更換培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.3HDF細胞的體外培養(yǎng)。HDF細胞在含有10%胎牛血清的FM培養(yǎng)液中，37 ℃、5%CO2、飽和濕度條件下進行培養(yǎng)，待細胞呈現(xiàn)80%～90%融合時進行處理。

1.2.4細胞分組及給藥。接種于96孔板內(nèi)的細胞分為空白對照組、模型組以及甘草黃酮高（10-9 mol/L）、中（10-10 mol/L）、低（10-11 mol/L）劑量組，每組設6個復孔?？瞻讓φ战M：細胞加入FM培養(yǎng)液，培養(yǎng)48 h；模型組：培養(yǎng)24 h的細胞棄培養(yǎng)液，每孔加入150 μL PBS，采用30 mJ/cm2 的UVB照射細胞，棄PBS，加入不含藥的FM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24 h；甘草黃酮組：細胞加入FM培養(yǎng)液，培養(yǎng)24 h后，棄培養(yǎng)液，每孔加入150 μL PBS，采用30 mJ/cm2 的UVB照射細胞，棄PBS，加入含不同濃度（10-9、10-10、10-11 mol/L）甘草黃酮的FM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

1.2.5指標檢測。

1.2.5.1細胞中GSHPx、SOD活性和MDA含量。按照各試劑盒說明書，取細胞上清液進行測定。

1.2.5.2細胞活性。取5 mg/mL的MTT 20 μL加入至96孔板中，將其放入CO2 培養(yǎng)箱中孵育4 h后棄上清液加入150 μL的二甲基亞砜（DMSO），在恒溫培養(yǎng)振蕩器內(nèi)振蕩10 min，在492 nm處測定各孔吸光度值（OD值）。按公式計算細胞活性：細胞活性=OD試驗組/OD對照組×100%。

1.3數(shù)據(jù)處理用SPSS17.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)均以±s表示，多樣本間的方差分析采用LSD法。

2結(jié)果與分析

2.1甘草黃酮對HDF細胞活性的影響由表1可知，與空白對照組比較，模型組細胞活性明顯降低，兩者具有統(tǒng)計學意義（P<0.01），表示細胞光老化模型建立成功；甘草黃酮組與模型組比較，不同濃度的甘草黃酮組（10-9、10-10、10-11mol/L）分別不同程度地提高了細胞活性（P<0.01、P<0.05），表明甘草黃酮能抑制UVB輻射引起HDF細胞的氧化損傷。

2.2甘草黃酮對HDF細胞中GSHPx、SOD活性的影響由表2可知，與空白對照組比較，模型組的GSHPx、SOD活性明顯降低，兩者具有統(tǒng)計學意義（P<0.01），表示模型建立成功；甘草黃酮組與模型組比較，不同濃度的甘草黃酮組（10-9、10-10、10-11mol/L）分別不同程度地提高了GSHPx、SOD活性（P<0.01、P<0.05），表明甘草黃酮能抵抗UVB輻射引起HDF細胞的氧化損傷。

2.3甘草黃酮對HDF細胞中MDA含量的影響由表2可知，與空白對照組比較，模型組的MDA含量明顯上升，兩者具有統(tǒng)計學意義（P<0.01），表示模型建立成功；甘草黃酮組與模型組比較，10-9、10-10、10-11mol/L甘草黃酮作用于細胞時，明顯降低了MDA的含量（P<0.01、P<0.05），表明甘草黃酮能抵抗UVB輻射引起的MDA外漏。

3討論與結(jié)論

活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）是一組具有未配對電子的原子或分子，包括超氧陰離子（superoxide anion，O2- ）、單線態(tài)氧（singlet oxygen，1O2）、過氧化氫（hydrogen peroxide，H2O2）、羥基自由基（hydroxyl free radical，·OH）等。正常情況下，人體內(nèi)ROS的產(chǎn)生與消除處于平衡狀態(tài)，當ROS增多時，細胞內(nèi)的GSHPx、SOD、CAT等抗氧化酶可快速清除ROS，維持機體促氧化-抗氧化的平衡，但隨著機體衰老或受某些外界因素（紫外線）影響時，會打破平衡狀態(tài)，機體受到多余ROS的傷害。

GSHPx是一種含硒酶，由谷氨酸、半胱氨酸及甘氨酸組成，可以調(diào)節(jié)硒消耗和形成，具有清除過氧化物和保護細胞免于氧化損傷的重要作用，能夠解除過氧化氫的毒性，恢復氧化變性的大分子。SOD是最有效的超氧化自由基清除劑，可以有效預防或延緩皮膚老化。MDA是一種能夠引起膠原蛋白長度縮短、性狀發(fā)生變化的脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物，對細胞具有毒性。該試驗以30 mJ/cm2的UVB照射HDF細胞，HDF細胞活性下降，細胞內(nèi)谷胱甘肽過氧化物酶（GSHPx）、超氧化物歧化酶（SOD）活性下降，丙二醛（MDA）含量上升。試驗結(jié)果證明，甘草黃酮濃度為10-9 mol/L時，細胞活性顯著升高；隨著甘草黃酮濃度的增加（10-11、10-10 、10-9 mol/L），細胞GSHPx、SOD活性隨之增加，MDA含量降低，中藥甘草的主要活性成分甘草黃酮可能抑制氧化損傷、提高SOD活性，在防治皮膚光老化方面具有一定作用。

參考文獻

[1] NAYLOR E C，WATSON R E，SHERRATT M J. Molecular aspects of skin ageing[J].Maturitas， 2011，69（3）：249-256.

[2] EPE B.DNA damage spectra induced by photosensitization[J].Photochemical & photobiological sciences， 2012，11（1）： 98-106.

[3] 徐慧，劉健航，陳向東，等.非光暴露皮膚經(jīng)窄譜中波紫外線照射前后MMP-1的表達[J].中國皮膚性病學雜志，2009，23（1）：11-12.

[4] CENCIONI C，SPALLOTTA F，MARTELLI F，et al.Oxidative stress and epigenetic regulation in ageingand agerelated diseases[J].Int J Mol Sci，2013，14（9）： 17643-17663.

[5] WU B H，LONG C G，WANG X M，et al.The scavening effect of flavonoids of Glycyrrhiza on hydroxyl radical studied in vitro[J].J North Sichuan Med Coll，2001，16（1）：3-5.

[6] 葉懷義，龔賦嵐，尚明，等.甘草黃酮抗衰老作用的研究[J].哈爾濱商業(yè)大學學報，2004，20（1）：93-97.