超高效液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜法分析雞蛋中利巴韋林及其代謝物殘留

齊凱 湯曉艷 王敏 鄭鋅 楊夢(mèng)瑞 周劍

摘要 建立了超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)快速測(cè)定雞蛋中利巴韋林及其兩種主要代謝物TCONH2和RTCOOH的分析檢測(cè)方法。樣品采用乙腈水（9∶1， V/V）提取，乙腈飽和正己烷除脂，C18結(jié)合GCB進(jìn)行固相分散萃取除雜，Agilent ZORBAX SBAq色譜柱（100 mm × 3.0 mm，1.8 μm）分離，超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定。結(jié)果表明：利巴韋林、TCONH2和RTCOOH分別在2.0～200 μg/L， 0.5～200 μg/L， 5.0～200 μg/L濃度范圍內(nèi)，線(xiàn)性良好，相關(guān)系數(shù)R2>0.99，檢出限分別為0.54， 0.09和1.54 μg/L，定量限分別為1.79， 0.31和5.13 μg/L。在5.0，10.0和50.0 μg/L加標(biāo)水平下，利巴韋林和RTCOOH回收率分別為96.1%～99.6%和42.9%～58.3%；在0.5，2.0和5.0 μg/L加標(biāo)水平下，TCONH2的回收率為75.9%～106.7%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均為4.2%～12.7%。實(shí)際樣品測(cè)定結(jié)果表明，本方法操作簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確，能夠滿(mǎn)足雞蛋中利巴韋林及其兩種主要代謝物的分析檢測(cè)。

關(guān)鍵詞 超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜； 利巴韋林及其代謝物； 雞蛋

1引言

我國(guó)是禽蛋生產(chǎn)和消費(fèi)大國(guó)，禽蛋產(chǎn)量多年來(lái)位居世界第一。禽類(lèi)養(yǎng)殖過(guò)程中禽流感以及一些病毒性疾病一直是困擾養(yǎng)殖戶(hù)的頭等問(wèn)題，為了減少損失，人用抗病毒藥物利巴韋林曾被用于獸醫(yī)臨床用途。利巴韋林（1βDribofuranosyl1，2，4triazole3carboxamide）是一種人工合成的廣譜抗病毒藥物 [1 ]，在動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)被迅速代謝為T(mén)CONH2（1，2，4triazole3carboxamide）和 RTCOOH（1βDribofuranosyl1，2，4triazole3carboxylic acid）等相關(guān)代謝產(chǎn)物 [2 ]，利巴韋林及其兩種主要代謝物

圖1利巴韋林、TCONH2和RTCOOH的化學(xué)結(jié)構(gòu)式

Fig.1Chemical structures of ribavirin， 1，2，4triazole3carboxamide （TCONH2） and 1βDribofuranosyl1，24triazole3carboxylic acid （RTCOOH）化學(xué)結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖1。但利巴韋林具有一定的毒副作用，長(zhǎng)期使用可使病毒產(chǎn)生不同程度的耐藥性，誘導(dǎo)新型耐藥病毒的出現(xiàn)，從而影響人類(lèi)病毒疾病的防治，給人們的身體健康造成危害。因此，我國(guó)農(nóng)業(yè)部于2005年發(fā)布第 [560 ]號(hào)公告，明確規(guī)定禁止在動(dòng)物養(yǎng)殖過(guò)程中使用利巴韋林等人用抗病毒藥物 [3 ]。產(chǎn)業(yè)調(diào)研發(fā)現(xiàn)，在我國(guó)禽類(lèi)養(yǎng)殖過(guò)程中，違規(guī)使用利巴韋林等抗病毒性藥物現(xiàn)象目前仍然十分嚴(yán)重，嚴(yán)重威脅禽類(lèi)產(chǎn)品質(zhì)量安全。因此有必要建立快速、準(zhǔn)確、靈敏、高效的利巴韋林及其代謝物殘留檢測(cè)方法，為監(jiān)管提供強(qiáng)有力的技術(shù)支撐。

目前，檢測(cè)利巴韋林原型的方法有高效液相色譜法（HPLC） [4，5 ]、放射免疫法（RIA） [6 ]、毛細(xì)管電泳法（HPCE） [7 ]、液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法（HPLC/MS） [8～12 ]等，目標(biāo)分析物主要涉及人血漿和動(dòng)物源性食品。對(duì)于利巴韋林及其代謝物的檢測(cè)，僅在動(dòng)物血漿上有報(bào)道 [2 ]，雞蛋中利巴韋林及其代謝物的殘留檢測(cè)尚無(wú)相關(guān)報(bào)道。本研究采用超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法（UPLCMS/MS）測(cè)定雞蛋中利巴韋林及其兩種主要代謝物TCONH2和RTCOOH的殘留量，比較了不同前處理方法，優(yōu)化了超高效液相色譜和質(zhì)譜條件，同時(shí)進(jìn)行了方法學(xué)評(píng)估，并應(yīng)用于陽(yáng)性雞蛋樣品中3種殘留物檢測(cè)分析。本方法操作簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確，能夠滿(mǎn)足雞蛋中利巴韋林及其主要代謝物的殘留檢測(cè)。

2實(shí)驗(yàn)部分

2.1儀器與試劑

ACQUITY UPLC超高效液相色譜（美國(guó)Waters公司）；QTRAP 6500型三重四極桿線(xiàn)性離子阱復(fù)合質(zhì)譜系統(tǒng)（美國(guó)AB SCIEX公司）；TTLDCII型氮?dú)鉂饪s儀（北京同泰聯(lián)科技發(fā)展有限公司）；MilliQ超純水器（美國(guó)Millipore公司）。

利巴韋林標(biāo)準(zhǔn)品（德國(guó)Dr.Ehrenstorfer公司），純度99.9%；13C5利巴韋林標(biāo)準(zhǔn)品（加拿大TRC公司），純度99.9%；甲醇（HPLC級(jí)，德國(guó)MERCK公司）；甲酸、正己烷（HPLC級(jí)，美國(guó)MREDA公司）；乙腈（HPLC級(jí)，美國(guó)J.T.Baker公司）；實(shí)驗(yàn)用水為MilliQ超純水。

生鮮雞蛋為本實(shí)驗(yàn)所用雞蛋均為實(shí)驗(yàn)飼養(yǎng)蛋雞所產(chǎn)，其中給藥組為對(duì)蛋雞連續(xù)3天飼喂30 mg/kg利巴韋林原藥，停藥1， 2， 5和7天后采集的雞蛋樣品。

2.2標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

分別用甲醇配制濃度為100 mg/L的利巴韋林、TCONH2和RTCOOH標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，

Symbolm@@ 20℃避光保存。移取0.1 mL利巴韋林、TCONH2和RTCOOH標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液混合，用空白雞蛋提取凈化液稀釋成1.0 mg/L混合基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液，然后逐級(jí)稀釋配制成0.5，1.0，2.0，5.0，10，20，50，100和200 μg/L共9種不同濃度梯度基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液。

2.3樣品處理

準(zhǔn)確稱(chēng)取雞蛋液樣品1.0 g（精確至0.01g）置于50 mL具塞離心管中，加入200 μg/L13C5利巴韋林標(biāo)準(zhǔn)溶液100 μL作為內(nèi)標(biāo)，加入10 mL乙腈水（9∶1， V/V）提取，5000 r/min離心10 min，轉(zhuǎn)移上清液至50 mL離心管中。

在上清液中加入5 mL乙腈飽和的正己烷進(jìn)行除脂，5000 r/min離心5 min，取下層溶液5 mL于10 mL離心管中，加入固相萃取填充料石墨化碳黑（GCB）和C18各50 mg進(jìn)行凈化，5000 r/min離心5 min， 取上清液氮?dú)獯蹈?，? mL純水復(fù)溶，過(guò)0.22 μm濾膜后， 采用UPLCMS/MS測(cè)定。

2.4色譜條件

色譜柱： Agilent ZORBAX SBAq柱（100 mm×3.0 mm， 1.8 μm）；流動(dòng)相： A為0.1%（V/V）甲酸溶液，B相為甲醇；柱平衡時(shí)間1 min；梯度洗脫程序： 0～2.5 min，99% A；2.5～4.0 min，85% A；4.0～5.0 min，10% A；5.1～8.0 min，99% A；流速0.3 mL/min； 進(jìn)樣體積5 μL； 內(nèi)標(biāo)法定量。

2.5質(zhì)譜條件

離子源： 電噴霧離子源（ESI）；檢測(cè)方式： 多重反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）；掃描方式： 正離子掃描；碰撞氣（CAD）壓力為13.8 kPa；氣簾氣（CMR）壓力為172.4 kPa；霧化氣（GS1）壓力為206.8 kPa；干燥氣（GS2）壓力為1.9 MPa；電噴霧電壓（IS）為5500 V；離子化溫度（TEM）為550℃；MRM定量離子對(duì)、去簇電壓（DP）及碰撞電壓（CE）見(jiàn)表1。

3結(jié)果與討論

3.1提取溶劑的選擇

利巴韋林屬于強(qiáng)極性化合物，化學(xué)結(jié)構(gòu)中包含酰胺基、羥基等基團(tuán)，其油水分配系數(shù)lgP為

Symbolm@@ 2.06 [14 ]，易溶于水和乙腈、甲醇等有機(jī)溶劑。目前， 針對(duì)動(dòng)物組織中利巴韋林的提取劑主要有0.1%

甲酸乙腈溶液（1∶9， V/V）、0.1%甲酸20 mmol/L乙酸銨/甲醇溶液（1∶9， V/V）和乙腈水（9∶1， V/V）等 [15 ]。本實(shí)驗(yàn)比較了上述3種提取劑的提取效果。結(jié)果表明，0.1%甲酸乙腈溶液（1∶9， V/V）和0.1%甲酸20 mmol/L乙酸銨/甲醇溶液（1∶9， V/V）對(duì)利巴韋林及其代謝物并未達(dá)到理想的提取效果，且基質(zhì)響應(yīng)明顯增大，而乙腈水（9∶1， V/V）對(duì)目標(biāo)物具有很好的提取效果，且基質(zhì)效應(yīng)較前兩者明顯變小。分析原因，可能是酸性的提取液會(huì)對(duì)雞蛋基質(zhì)中具有與利巴韋林及其代謝物相似基團(tuán)和結(jié)構(gòu)的物質(zhì)進(jìn)行提取，從而導(dǎo)致質(zhì)譜中基質(zhì)響應(yīng)變大，影響目標(biāo)物分析，故本實(shí)驗(yàn)采用乙腈水溶液（9∶1， V/V）作為提取劑。

3.2凈化條件的選擇

目前，對(duì)于生物組織及體液中利巴韋林的凈化方式主要用固相萃取技術(shù)（SPE），采用磺酸基強(qiáng)陽(yáng)離子（MCX）萃取柱、氨基（NH2）萃取柱、苯硼酸基弱陽(yáng)離子（PBA）萃取柱和親水親脂平衡（HLB）萃取柱等 [16 ]。本方法應(yīng)用QuEChERS快速樣品前處理方法原理，采用乙腈飽和的正己烷去除溶于提取液中的油脂，用固相分散萃取填料除去脂溶性的雜質(zhì)和色素等。實(shí)驗(yàn)中考察了3種固相萃取柱填料N丙基乙二胺（PSA）、C18和GCB對(duì)利巴韋林及其主要代謝物回收率的影響，如圖2所示。結(jié)果表明，PSA對(duì)利巴韋林有較大的吸附作用，回收率在76%～79%之間，而C18和GCB對(duì)利巴韋林的吸附作用較小，回收率分別在88%～97%和99%～100%。分析原因發(fā)現(xiàn)，PSA在吸附基質(zhì)中的色素、有機(jī)酸等生物分子時(shí)，對(duì)利巴韋林也產(chǎn)生了吸附作用，導(dǎo)致回收率偏低。因此，本研究選用C18和GCB用于固相萃取凈化。此外，本方法與文獻(xiàn)[16]報(bào)道的利巴韋林傳統(tǒng)固相萃取法進(jìn)行了比較，結(jié)果表明，采用本方法凈化時(shí)，利巴韋林及其代謝物的回收率均高于固相萃取法，且重復(fù)性好，凈化時(shí)間縮短，成本降低。

3.3色譜質(zhì)譜條件的選擇及優(yōu)化

利巴韋林屬于強(qiáng)極性化合物，在C18柱上保留性差。本實(shí)驗(yàn)采用能分離極性化合物的Agilent ZORBAX SBAq色譜柱（100 mm×3.0 mm， 1.8 μm）進(jìn)行分離，發(fā)現(xiàn)利巴韋林在3.06 min處出峰，與RTCOOH達(dá)到了有效分離，與代謝物TCONH2分離度不夠，但利巴韋林和TCONH2在后續(xù)質(zhì)譜中電離生成的特征碎片離子對(duì)不同（m/z 245/113和m/z 113/96），根據(jù)不同特征離子對(duì)的質(zhì)荷比即可準(zhǔn)確定量利巴韋林原型和代謝物TCONH2。利巴韋林是核苷類(lèi)似物，由于雞蛋基質(zhì)中含有大量的與利巴韋林及其代謝物分子量相同的核苷類(lèi)似物，導(dǎo)致在提取的過(guò)程中，與目標(biāo)物一同提取出來(lái)。這種基質(zhì)在質(zhì)譜中響應(yīng)影響大，用目前的萃取方法難以除去，所以本實(shí)驗(yàn)采用液相色譜將基質(zhì)與目標(biāo)物進(jìn)行了很好的分離，從而消除基質(zhì)的影響。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，氮?dú)獯蹈珊蟮臉悠酚眉状既芤簭?fù)溶，在同樣的儀器條件下，利巴韋林及其代謝物在色譜柱中無(wú)保留，均在2 min前出峰。且利巴韋林及其代謝物和基質(zhì)峰重合，由于基質(zhì)效應(yīng)影響大，很難對(duì)結(jié)果進(jìn)行有效分析。所以本實(shí)驗(yàn)中均采用超純水對(duì)處理后的樣品復(fù)溶，基質(zhì)在4.2 min處出峰，與3種目標(biāo)物達(dá)到了有效的分離，保障了目標(biāo)物準(zhǔn)確的定性和定量分析。

本方法也同時(shí)考察了以0.1%甲酸甲醇作為流動(dòng)相時(shí)色譜柱對(duì)目標(biāo)物的分離效果。結(jié)果表明，在流動(dòng)相中甲醇的比例超過(guò)30%時(shí)，利巴韋林及其代謝物在色譜柱上的保留性差，有雙峰出現(xiàn)；隨著甲醇比例減少，水相比例增加，利巴韋林峰形變好且與代謝物達(dá)到了有效分離；將水相比例維持在99%進(jìn)行洗脫，此時(shí)得到的利巴韋林峰形較好，出峰時(shí)間有效避開(kāi)了基質(zhì)峰，排除了基質(zhì)影響，結(jié)果見(jiàn)圖3。

3.4線(xiàn)性范圍、方法檢出限和定量限

為了消除基質(zhì)效應(yīng)對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響，本方法采用基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)對(duì)利巴韋林及其代謝物進(jìn)行分析，以定量離子對(duì)和內(nèi)標(biāo)13C5利巴韋林的峰面積比為縱坐標(biāo)（Y），以基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作液濃度（0.5，1.0，2.0，5.0，10，20，50，100和200 μg/L）為橫坐標(biāo)（X）進(jìn)行線(xiàn)性回歸計(jì)算。結(jié)果表明，利巴韋林在2.0～200 μg/L濃度范圍內(nèi)線(xiàn)性關(guān)系良好，線(xiàn)性方程為Y=0.0669X+0.0608（相關(guān)系數(shù)R2=0.9997）；TCONH2在0.5～200.0 μg/L濃度范圍內(nèi)線(xiàn)性關(guān)系良好，線(xiàn)性方程為Y=0.739X+3.79（相關(guān)系數(shù)R2=0.9931）；RTCOOH在5.0～200.0 μg/L濃度范圍內(nèi)線(xiàn)性關(guān)系良好，線(xiàn)性方程為Y=0.0181X+0.0192（相關(guān)系數(shù)R2=0.9981）。以信噪比（S/N）確定方法的檢出限（LOD）和定量限（LOQ），得到利巴韋林的LOD（S/N=3）為0.54 μg/L，LOQ（S/N=10）為1.79 μg/L；TCONH2的LOD為0.09 μg/L，LOQ為0.31 μg/L；RTCOOH的LOD為1.54 μg/L，LOQ為5.13 μg/L。

3.5方法的回收率和精密度

本實(shí)驗(yàn)采用在空白的雞蛋中添加標(biāo)準(zhǔn)溶液的方法進(jìn)行添加回收實(shí)驗(yàn)測(cè)定，內(nèi)標(biāo)法校正，每個(gè)濃度點(diǎn)平行測(cè)定6次，其加標(biāo)回收率及精密度結(jié)果見(jiàn)表2。

3.6實(shí)際樣品分析

應(yīng)用本方法測(cè)定給藥試驗(yàn)蛋雞所產(chǎn)雞蛋中利巴韋林原藥及其代謝物。經(jīng)檢測(cè)分析，在停藥5天內(nèi)，雞蛋樣品中均檢測(cè)出3種物質(zhì)利巴韋林、TCONH2和RTCOOH，其中TCONH2殘留量遠(yuǎn)大于利巴韋林原型和RTCOOH。隨著停藥時(shí)間延長(zhǎng)，停藥7天后，雞蛋中均未檢測(cè)到利巴韋林原藥和代謝物RTCOOH，但TCONH2仍有殘留檢出，結(jié)果見(jiàn)表3。根據(jù)雞蛋中利巴韋林及其代謝物殘留消除的規(guī)律，確定較長(zhǎng)時(shí)間段內(nèi)殘留在雞蛋組織中的目標(biāo)物為T(mén)CONH2，可作為蛋雞養(yǎng)殖中監(jiān)察違規(guī)使用利巴韋林的重要依據(jù)。

4結(jié) 論

建立了超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)雞蛋中利巴韋林及其主要代謝物殘留的方法，針對(duì)利巴韋林在組織中殘留量低，轉(zhuǎn)化率高的特點(diǎn)，分析了利巴韋林及其代謝物TCONH2、RTCOOH在雞蛋中的殘留情況。本方法很好地分離了利巴韋林及其代謝物和基質(zhì)中的核苷類(lèi)似物，消除了基質(zhì)效應(yīng)影響。實(shí)驗(yàn)中樣品進(jìn)樣分析時(shí)間短，操作簡(jiǎn)單，分離度好，回收率高，定量限和精密度基本滿(mǎn)足要求，為實(shí)際禽類(lèi)養(yǎng)殖中利巴韋林的監(jiān)管提供了有效的方法支撐。

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