黃夢瑩 王娜 郭欣妍 邱盼子 湯衛(wèi)國 張尊建

摘要：建立了同時測定尿液中4種有機(jī)磷類農(nóng)藥代謝物的氣相色譜/串聯(lián)質(zhì)譜分析方法。尿液樣品以WCX固相萃取柱富集提取，乙酸乙酯乙腈（70∶30， V/V）再萃取，濃縮干燥，甲苯溶解，N叔丁基二甲基甲硅烷基N甲基三氟乙酰胺衍生化。采用HP5MS色譜柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）程序升溫分離，串聯(lián)質(zhì)譜多反應(yīng)檢測，內(nèi)標(biāo)法定量。通過比較尿樣中代謝物在不同萃取溶劑、固相萃取柱及pH值洗脫液等條件下的回收率，優(yōu)化了前處理方法。在0.2～200 μg/L范圍內(nèi)，4種代謝物峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值與質(zhì)量濃度的線性關(guān)系良好（R2≥0.992），方法檢出限為0.083～0.667 μg/L，定量限為0.2～2.0 μg/L，平均回收率為54.1%～68.6%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于8.5% （n=6）。本方法穩(wěn)定、可靠，分析時間短，不需要使用大量有機(jī)溶劑，可同時處理大批量樣品，適用于人群有機(jī)磷類農(nóng)藥暴露情況的評估。

關(guān)鍵詞 ：固相萃??； 氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜； 有機(jī)磷農(nóng)藥代謝物； 尿液

1 引 言

繼有機(jī)氯農(nóng)藥被全面禁用后，有機(jī)磷類農(nóng)藥（Organophosphorus pesticides，OPs）成為國內(nèi)目前農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上應(yīng)用最廣泛、使用量最大的農(nóng)藥[1]。OPs具有易降解、殺蟲效果好、抗性不顯著、殘效期較短的特點，除廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中[2]，還常作為除草劑應(yīng)用于公園、綠地等公共場所。

OPs進(jìn)入人體后代謝迅速，蓄積現(xiàn)象不明顯。OPs由于其結(jié)構(gòu)的相似性，進(jìn)入體內(nèi)后一般都能代謝成為6種二烷基磷酸酯（DialkylPhosphates，DAP）代謝產(chǎn)物中的1種或幾種，在較短的時間內(nèi)隨尿排出[3]，主要有機(jī)磷農(nóng)藥代謝產(chǎn)物見表1。除6種二烷基磷酸酯外，OPs還會產(chǎn)生特殊代謝產(chǎn)物，每種特殊代謝產(chǎn)物通常只由特定的1種或幾種OPs代謝產(chǎn)生，如毒死蜱、甲基毒死蜱的特殊代謝產(chǎn)物為3，5，6三氯2吡啶醇（3，5，6TCP），對硫磷、甲基對硫磷的特殊代謝產(chǎn)物為對硝基酚，馬拉硫磷的特殊代謝產(chǎn)物為馬拉硫磷二羥基酸[4]。

近年來，農(nóng)藥暴露對人體健康的影響受到廣泛關(guān)注[6～9]。根據(jù)OPs代謝較快的特點，檢測人群尿液樣品中OPs非特異性及特異性代謝物含量可有效評估人體的OPs暴露水平。檢測尿液中OPs代謝物的方法主要有氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法[10～12]、氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法[13～15]、液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法[16～18]。液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法前處理較為簡單，但實際應(yīng)用中靈敏度不高，且基質(zhì)效應(yīng)造成的離子抑制比較普遍[19]。提取尿液中DAPs的方法主要有液/液萃取[10～12，15～17]、固相萃取[13，20]、凍干法[14]。本研究采用固相萃取液/液萃取氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)建立了人體尿液中3種OPs非特異性代謝產(chǎn)物及1種特殊代謝產(chǎn)物的高靈敏檢測方法，避免了液/液萃取使用乙醚對實驗室造成的安全隱患，實驗時間大幅縮短，凈化效率優(yōu)于凍干法。本方法為有機(jī)磷農(nóng)藥的人體內(nèi)暴露研究提供了良好的技術(shù)支撐。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

Quattra micro GCMS/MS（美國Waters公司）；AG285電子天平（瑞士Mettler公司）； MG2200氮吹儀（日本EYELA公司）；R210旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（瑞士Buchi公司）；WH3微型旋渦混合儀（上海楚定分析儀器有限公司，中國）；Centrifuge C5804離心機(jī)、恒溫混勻儀（德國 Eppendorf公司）；MilliQ超純水器（美國Mimpore公司）。

乙腈、乙酸乙酯、甲苯（分析純，南京化學(xué)試劑有限公司）；甲醇、甲酸（色譜純，德國Merck公司）；N叔丁基二甲基甲硅烷基N甲基三氟乙酰胺（MTBSTFA，>97.0%，美國Aldrich公司）。 其它試劑均為國產(chǎn)分析純。

Waters Oasis WCX固相萃取柱（150 mg，6 mL）、Waters Oasis HLB固相萃取柱（200 mg，6 mL）、Waters Oasis WAX固相萃取柱（60 mg，3 mL），均購自美國Waters公司。

固相萃取DAPs：準(zhǔn)確吸取尿液10.0 mL于100 mL具塞塑料離心管中，加入100 μL濃HCl，渦旋1 min，上樣于Waters Oasis WCX固相萃取柱（柱子提前用6 mL甲醇、6 mL水活化），通過固相萃取小柱的尿液樣品收集于100 mL塑料離心管中。上樣后，干燥，用8 mL 10%甲酸甲醇溶液洗脫，洗脫液置于10 mL具塞比色管中。

液/液萃取TCP：通過固相萃取小柱的尿液樣品中加入適量NaOH，使樣品pH≈7.0，加入2 g NaCl，渦旋至溶解，加入20 mL乙酸乙酯乙腈（70∶30， V/V），渦旋3 min，6000 r/min離心5 min。上清液經(jīng)過含適量無水Na2SO4的漏斗轉(zhuǎn)移至雞心瓶中，旋蒸濃縮至2 mL左右。

用移液器將萃取濃縮液移出至含洗脫液的比色管中，40℃水浴中氮吹至完全干燥，比色管中加入0.5 mL甲苯，渦旋1 min，轉(zhuǎn)移至1.5 mL玻璃小管中，加入10 μL 0.2 mg/L內(nèi)標(biāo)DBP，20 μL MTBSTFA，置于90℃恒溫混勻儀中衍生化30 min。

衍生化后的溶液冷卻至室溫，過0.22 μm有機(jī)相濾膜，供GCMS/MS分析。

2.3 氣相色譜條件

DB5MS色譜柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；程序升溫：60℃保持2 min，以5℃/min升至90℃，以12℃/min升至160℃，再以10℃/min升至280℃，保持2 min；進(jìn)樣量1.0 μL；不分流進(jìn)樣，載氣：氦氣（99.999%），流量：1.0 mL/min，進(jìn)樣器溫度： 250℃。

2.4 質(zhì)譜條件

正離子模式的電噴霧電離ESI+，多反應(yīng)離子監(jiān)測（MRM），TCP采用選擇離子檢測（SIM）， EI源轟擊能：70 eV，離子源溫度：180℃，傳輸線溫度：250℃，溶劑延遲時間：5.0 min，碰撞氣：高純氬氣，保留時間定性，內(nèi)標(biāo)法定量。其它質(zhì)譜參數(shù)見表2。

3 結(jié)果與討論

3.1 空白基質(zhì)的選擇

選擇空白基質(zhì)時，如采用人工合成尿液進(jìn)行實驗，雖然本底較為干凈，干擾小，但人工尿液中不含蛋白質(zhì)，與實際尿液有很大差距，不能有效反映人體實際尿液基質(zhì)的復(fù)雜性。如采用單個個體尿液作為空白基質(zhì)，有的個體存在較高的本底值，不適合測定方法的建立。因此，本實驗通過篩選不同個體的尿液，選擇本底干擾較小的人體尿液作為本實驗的空白基質(zhì)。

3.2 前處理條件優(yōu)化

3.2.1 液/液萃取 大量文獻(xiàn)報道DAPs和TCP提取均采用液/液萃取的方法，故本實驗首先采用液/液萃取的方法提取DAPs和TCP。萃取溶劑見表3，結(jié)果見圖2。結(jié)果表明，采取液/液萃取法提取DAPs時，同一提取方案對不同代謝物提取回收率差別較大，很難找到平衡方案使各代謝物的回收率均符合要求，TCP的液/液萃取回收率較高。由于TCP的pKa=7.5，近中性，故萃取時將溶液調(diào)至pH ≈7，確保萃取時TCP的存在形式為分子態(tài)[18]。

3.2.2 固相萃取柱的選擇

目前文獻(xiàn)所報道的DAPs和TCP提取多采用液/液萃取法，固相萃取法的報道較少。本實驗分別考察了親水親油平衡柱（Waters Oasis HLB）、弱陽離子交換柱（Waters Oasis WCX）及弱陰離子交換柱（Waters Oasis WAX）對各代謝物的萃取效果，結(jié)果見圖3。

Waters Oasis HLB柱雖然適用范圍較廣，可從各種基質(zhì)中分離出多種酸性、堿性和中性化合物，但DMTP回收率過高，其它物質(zhì)則過低。Waters Oasis WAX柱為弱陰離子交換柱，適用于酸性物質(zhì)， 具有高選擇性，DAPs為酸性（DMP pKa=1.25， DMTP pKa=1.37， DEP pKa=1.37， DETP pKa=1.49），但本實驗發(fā)現(xiàn)其對DMP、DEP基本沒有保留，對DMTP、DETP雖有保留，但回收率非常不穩(wěn)定，不適用于從尿液中提取DAPs，而TCP的pKa近中性，不易被WAX柱吸附。

Waters Oasis WCX柱對DMTP、DEP、DETP、TCP均有保留，且回收率較穩(wěn)定。Waters Oasis WCX柱為陽離子交換柱，可吸附帶正電的分子。DAPs的pKa較低，呈酸性，實驗中采用強(qiáng)酸酸化并不會使DAPs分子解離，而分子中的硫原子及氧原子含有孤對電子，吸引溶液中的氫質(zhì)子，從而使DAPs分子質(zhì)子化，帶正電荷，可被WCX柱吸附。DMP相比于其它的DAPs，由于極性較大，正電性較弱，在WCX柱上基本無保留。WCX柱對除DMP外的DAPs及TCP均有保留，故選其作為固相萃取柱，并對其洗脫條件進(jìn)行優(yōu)化。

3.2.3 洗脫條件的優(yōu)化 在洗脫條件的優(yōu)化中，分別考察10%甲酸甲醇溶液、20%甲酸甲醇溶液、30%甲酸甲醇溶液，10%甲酸乙腈溶液的洗脫效果，結(jié)果見圖4。使用10%甲酸甲醇作為洗脫液時，各代謝物回收率在34.9%～77.5%之間（DMP基本無回收），高于20%甲酸甲醇溶液得到的回收率，且較30%甲酸甲醇溶液得到的回收率更為穩(wěn)定。10%甲酸乙腈溶液的洗脫效果與10%甲酸甲醇溶甲醇溶液相當(dāng)，TCP基本無回收。隨著酸度增加，DAPs的回收率基本都是呈先降低再升高的趨勢。使用10%甲酸甲醇作為洗脫液，回收率可以接受，且較為穩(wěn)定。

3.3 固相萃取與液/液萃取的比較

采用表3中方案4作為液/液萃取方法，與優(yōu)化過的固相萃取方法進(jìn)行回收率的比較，結(jié)果見圖5。

對于DMTP， DEP和DETP，固相萃取的回收率和穩(wěn)定性均高于液/液萃取。對于生物基質(zhì)樣品分析，方法的穩(wěn)定性十分重要。液/液萃取提取TCP的回收率和穩(wěn)定性優(yōu)于固相萃取。用何種提取方法DMP，結(jié)果均不能令人滿意。最終采用固相萃取提取DMTP， DEP和DETP，采用表3中方案4提取TCP。

3.4 衍生化反應(yīng)

本實驗采用硅烷化試劑N（叔丁基二甲基硅烷基）N甲基三氟乙酰胺（MTBSTFA）對目標(biāo)化合物進(jìn)行衍生化反應(yīng)。目標(biāo)代謝物與衍生化試劑MTBSTFA的反應(yīng)原理如圖6所示，通過硅烷化作用將叔丁基二甲基硅烷基引入目標(biāo)代謝物分子中，取代分子中的活性氫。

文獻(xiàn)[5，10，11，20，21]采用五氟溴芐苯（PFBBr）對DAPs進(jìn)行衍生化，衍生化反應(yīng)需加入適量K2CO3。與采用PFBBr相比，MTBSTFA的衍生化反應(yīng)時間較短（PFBBr衍生化反應(yīng)需16 h[21]），不需要其它試劑參與，不必考慮其它試劑的用量對衍生化效率的影響。

3.5 方法學(xué)驗證

3.5.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性范圍 向空白尿樣中添加目標(biāo)代謝物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按2.2節(jié)中前處理方法進(jìn)行提取、凈化，在優(yōu)化后的色譜及質(zhì)譜條件下進(jìn)樣，繪制工作曲線，記錄各待測物色譜峰面積（As）與內(nèi)標(biāo)色譜峰面積（Ar）。以各待測物與內(nèi)標(biāo)的峰面積比R （R= As/As）對濃度（C，mg/L）進(jìn)行線性回歸，確定線性范圍及檢出限、定量限。檢出限和定量限分別以3和10倍信噪比的濃度來確定。DMP在固相萃取柱上基本無保留，其它代謝物制定工作曲線得到的線性方程相關(guān)系數(shù)均在0.9923～0.9942之間，表明各代謝物在相應(yīng)的濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好， 結(jié)果見表4。

3.5.2 方法的回收率及精密度 由于無法獲得所分析的代謝物引入叔丁基二甲基硅烷基的標(biāo)準(zhǔn)品，衍生化反應(yīng)效率無法確定，整個樣品制備過程的絕對回收率無法考察。本研究按2.2節(jié)方法同時處理加標(biāo)與未加標(biāo)的空白基質(zhì)，未加標(biāo)空白基質(zhì)在衍生化前加入等量標(biāo)準(zhǔn)溶液，由兩者響應(yīng)的比值計算回收率，設(shè)置低、中、高3個添加濃度，結(jié)果見表5。生物體液樣本基質(zhì)較為復(fù)雜，分析前需要經(jīng)過衍生化反應(yīng)，處理步驟較多，回收率低于基質(zhì)單一的樣品。

3.5.3 基質(zhì)效應(yīng) 采用提取后添加法評定基質(zhì)效應(yīng)。按照2.2節(jié)方法處理空白尿液基質(zhì)，衍生化前加入標(biāo)準(zhǔn)品溶液，進(jìn)樣后所得峰面積記為A組峰面積；純?nèi)軇┭苌凹尤霕?biāo)準(zhǔn)品溶液，進(jìn)樣后所得峰面積記為B組峰面積。以A組峰面積與B組峰面積的比值（A/B）考察絕對基質(zhì)效應(yīng)，4種代謝物的絕對基質(zhì)效應(yīng)在60%～176%之間，故采用基質(zhì)加標(biāo)工作曲線消除基質(zhì)效應(yīng)的影響。

3.6 氣相色譜質(zhì)譜條件優(yōu)化

根據(jù)目前已有文獻(xiàn)報道，本研究嘗試了不同的升溫程序。優(yōu)化后的色譜圖見圖7，各物質(zhì)峰形良好，分離效果理想。

代謝物衍生化后在EI源中主要的裂解方式見圖7，運用Daughter Scan模式，進(jìn)行子離子掃描，并對碰撞能量進(jìn)行優(yōu)化，以達(dá)到較高的靈敏度。3，5，6TCP在正離子檢測方式下，基峰為m/z 256，運用Daughter Scan模式，進(jìn)行子離子掃描， 結(jié)果并未發(fā)現(xiàn)響應(yīng)穩(wěn)定且較強(qiáng)的碎片峰，這與3，5，6TCP的環(huán)狀結(jié)構(gòu)特點較為一致。

3.7 樣品分析

采集居住在農(nóng)藥廠附近居民的晨尿樣品40份，其中兒童尿液樣品20份，成人尿液樣品20份，按2.2節(jié)中的實驗方法進(jìn)行處理，測定結(jié)果見表6。

結(jié)果表明，成人尿液樣品DMTP， DEP， DETP， TCP檢出率分別為85%， 90%， 90%， 45%，兒童尿液樣品分別為35%， 75%， 65%， 60%。成人尿液中非特異性代謝物DMTP， DEP， DETP的檢出率均高于兒童，特異性代謝物TCP的檢出率低于兒童。結(jié)果表明，居住在農(nóng)藥廠附近的成人與兒童均有不同程度的有機(jī)磷農(nóng)藥內(nèi)暴露，呼吸可能是造成有機(jī)磷農(nóng)藥內(nèi)暴露的重要途徑。以尿液中代謝物作為評估有機(jī)磷農(nóng)藥暴露程度的指標(biāo)，成人的暴露量大于兒童，這是由于成人的呼吸量較大， 且對農(nóng)藥的代謝能力較強(qiáng)。不同成人與兒童尿液中有機(jī)磷代謝物檢出的差異與其住所位置、膳食結(jié)構(gòu)等都有密切的關(guān)系。

4 結(jié) 論

建立了固相萃取氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜同時分析制尿液中4種OPs代謝物的方法，定量檢測了人體尿液中4種代謝物含量。本研究采用WCX固相萃取柱，與液/液萃取相比，耗費的有機(jī)溶劑更少，耗時更短，適合于大批量樣品的前處理，為研究人群中低劑量OPs農(nóng)藥暴露情況提供了方法學(xué)基礎(chǔ)。

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Abstract A method for quantifying four urinary metabolites of organophosphorus pesticides using gas chromatographytandem mass spectrometry （GCMS/MS） was developed. The metabolites were extracted and enriched from urine samples with WCX solid phase extraction （SPE） cartridges， followed by liquidliquid extraction with ethyl acetateacetonitrile （70∶30， V/V）. The analytes were chemically derivatized with NtertbutyldimethylsilylNmethyltrifluoroacetamide after the derivatives were concentrated by drying and dissolved in phenylmethane. The separation was performed on a HP5MS capillary column （30 m×0.25 mm×0.25 μm） with temperature programming and the detection was performed in multiple reaction monitoring （MRM） mode using GCMS/MS. The internal standard method was used for quantification. The extraction solvents， types of SPE cartridges and eluents were optimized by comparing the sample recoveries under different conditions. The result showed that the calibration curves of four metabolites were linear in the range of 0.2-200 μg/L （R2≥0.992）. The limits of detection （LODs） and the limits of quantification （LOQs） of the four metabolites were 0.083-0.667 μg/L and 0.2-2.0 μg/L， respectively. The recoveries of four metabolites ranged from 54.1% to 68.6% （RSD<8.5%， n=6）. The established method whichs avoid using large amount of organic solvents in liquidliquid extraction is stable， reliable and efficient， and is suitable for the analysis of large amounts of samples. Therefore， the method can be applied to assess the exposure level of organophosphorus pesticide in general population.

Keywords Solid phase extraction； Gas chromatographytandem mass spectrometry； Organophosphorus pesticides metabolites； Urine