左氧氟沙星對大鼠氣管黏膜和肺組織的損傷及氨溴索的保護(hù)作用

文　文，劉　瑋，胡順振，賴國祥

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左氧氟沙星對大鼠氣管黏膜和肺組織的損傷及氨溴索的保護(hù)作用

文文，劉瑋，胡順振，賴國祥*

目的研究鹽酸氨溴索對左氧氟沙星經(jīng)氣管內(nèi)局部使用所致大鼠氣管黏膜和肺組織損傷的保護(hù)作用。方法將雄性SD大鼠隨機(jī)分為正常對照組(對照組)、左氧氟沙星組(左氧組)、鹽酸氨溴索干預(yù)組(干預(yù)組)，每組30只。對照組僅給予氣管穿刺，不注入任何藥物。左氧組及干預(yù)組大鼠氣管均注入左氧氟沙星注射液(28 mg/kg)，干預(yù)組大鼠則在使用左氧氟沙星前6 h，經(jīng)腹腔注入鹽酸氨溴索注射液(70 mg/kg)。分別于氣管穿刺后2、24、48、72、120、168 h 6個時間點分別處死大鼠(每組每個時間點各5只)，觀察大鼠肺組織的病理改變，并應(yīng)用掃描電鏡觀察氣管纖毛形態(tài)改變情況。結(jié)果與對照組相比，左氧組大鼠氣道黏膜纖毛上皮及肺組織均存在不同程度損傷(168 h除外)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。在第2、48、72、120小時時間點，干預(yù)組氣管黏膜纖毛及肺組織損傷程度較左氧組均有改善(P<0.05)。結(jié)論鹽酸氨溴索可保護(hù)氣管內(nèi)局部使用左氧氟沙星注射液所致的氣管黏膜和肺組織的損傷。

左氧氟沙星；氣管內(nèi)注藥；鹽酸氨溴索

0　引言

氣管內(nèi)給藥是直接將藥物注入到氣管內(nèi)的給藥方法，是經(jīng)氣管肺給藥的方式之一；另一種經(jīng)氣管肺給藥的方式是直接吸入。經(jīng)氣管肺給藥的方式具有局部濃度高，生物利用度高，全身不良反應(yīng)小等優(yōu)點[1]。左氧氟沙星通過氣管內(nèi)給藥在肺組織中具有很好的滲透性[2]，臨床上可將左氧氟沙星作為氣管鏡診療時氣管內(nèi)給藥的藥物，治療肺結(jié)核尤其是耐藥性肺結(jié)核[3]，亦可嘗試使用在無法耐受全身使用左氧氟沙星的肺部感染性疾病患者。但其是否會損傷氣道黏膜纖毛上皮和肺組織，損傷是否具有可逆性尚不清楚。本實驗擬以左氧氟沙星注射液作為氣管內(nèi)給藥的研究藥物，觀察其對大鼠氣管黏膜上皮和肺組織的影響，以及鹽酸氨溴索是否可減輕該損傷，為臨床上氣管內(nèi)給藥的安全性、合理性提供新的理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1實驗動物90只健康清潔級雄性SD大鼠[購于福建醫(yī)科大學(xué)，批號：SCXK(閩) 2012-0001]，體重(240±10)g。飼養(yǎng)環(huán)境：所有大鼠均置于飼養(yǎng)室普通環(huán)境下，光照、通風(fēng)良好，室溫在24～26 ℃左右，濕度40%～60%。基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng)。

1.2實驗藥物左氧氟沙星注射液(江蘇揚子江制藥有限公司，批號：596438)；鹽酸氨溴索注射液(上海勃林格殷格翰制藥有限公司，批號：428300)。

1.3方法

1.3.1動物分組大鼠隨機(jī)分為對照組、左氧組和干預(yù)組(各30只)。各組在6個不同時間點處理大鼠，每個時間點共5只大鼠。

1.3.2動物造模臨床上行纖維支氣管鏡檢查時，左氧氟沙星注射液的常用給藥劑量為4 mL(0.2 g)，大鼠的給藥劑量按人的7倍(/kg)[4]，按照此比值，假設(shè)以人為50 kg，大鼠為X kg，換算為大鼠氣管內(nèi)左氧氟沙星注射液的給藥劑量則應(yīng)為0.56 X mL(即0.028 X mg)，干預(yù)組大鼠按體重70 mg/kg腹腔注射鹽酸氨溴索注射液[5]。

大鼠麻醉生效后，對照組大鼠僅給予環(huán)甲膜穿刺而氣管內(nèi)不注射任何液體，左氧組及干預(yù)組大鼠氣管均注入左氧氟沙星注射液(28 mg/kg)，同時干預(yù)組在使用左氧氟沙星前6 h，腹腔注入鹽酸氨溴索注射液(70 mg/kg)。

1.3.3標(biāo)本制備氣管內(nèi)注藥后6個不同時間點(2 h、24 h、48 h、72 h、120 h、168 h)分別處死各組的5只大鼠，留取其中下段氣管和右肺的后葉。氣管用2.5%戊二醛固定，然后在磷酸鹽緩沖液中漂洗。取后1/3腹側(cè)段氣管，經(jīng)固定、漂洗、脫水、置換、干燥，IB-3型離子濺射儀真空噴金JSM-6380型掃描電鏡觀察和攝片，電鏡觀察中下段氣管纖毛形態(tài)。肺組織經(jīng)福爾馬林固定后切片染色(HE)，觀察肺組織的病理改變。

1.3.4氣管黏膜上皮細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化在9 000倍掃描電鏡下，隨機(jī)選取5個視野，每個視野均觀察氣管黏膜纖毛形態(tài)，評估纖毛損傷面積占視野內(nèi)總纖毛面積的百分比以及受損形態(tài)類型(包括倒伏、水腫、壞死脫落)。①纖毛損傷面積占視野內(nèi)總纖毛面積的百分比：0分：<5%，1分：6%～25%，2分：26%～50%，3分：51%～75%，4分：76%～100%[6]；②形態(tài)受損類型：纖毛排列致密、整齊記為0分；纖毛出現(xiàn)倒伏記為1分；纖毛出現(xiàn)水腫記為2分；纖毛出現(xiàn)壞死、脫落記為3分。兩者積分相乘為纖毛損傷程度，0分定為正常(-)，1～4分定為輕度損傷(+)，5～8分定為中度損傷(++)，9～12分定為重度損傷(+++)。應(yīng)用Imagepro Plus 6.0圖像分析系統(tǒng)處理圖片并綜合2個電鏡室醫(yī)師觀察后判斷得出數(shù)據(jù)，結(jié)果以積分形式表示[7]。

1.3.5肺組織病理圖像分析在100倍光學(xué)顯微鏡下，隨機(jī)選取5個視野，觀察肺組織病理切片，光鏡下肺組織病理損傷程度采用如下評判標(biāo)準(zhǔn)：①肺組織中中性粒細(xì)胞的浸潤面積。0分：0%，1分：1%～25%，2分：26%～50%，3分：5l%～75%，4分：76%～100%。②中性粒細(xì)胞滲出量(肺泡內(nèi))。0分：無，1分：少量，2分：大量，3分：肺泡腔幾乎被充滿，4分：肺泡腔充滿并出現(xiàn)擴(kuò)張。③肺泡腔內(nèi)滲出物量，包括纖維素、水腫液、透明膜、上皮壞死脫落物。0分：無滲出物，1分：少量，2分：大量，3分：肺泡腔幾乎充滿，4分：肺泡腔充滿并擴(kuò)張[6]。④肺實質(zhì)、空肺泡所占面積(%)。0分：肺實質(zhì)面積<15%，空肺泡面積>85%；1分：15%≤肺實質(zhì)面積<25%，75%<空肺泡面積≤85%；2分：25%≤肺實質(zhì)面積<50%，50%<空肺泡面積≤75%；3分：50%≤肺實質(zhì)面積<75%，25%<空肺泡面積≤50%；4分：75%≤肺實質(zhì)面積<100%，0%<空肺泡面積≤25%。四者積分相加評估病理損傷程度，應(yīng)用IPP 6.0圖像分析軟件對每張病理圖片進(jìn)行分析，算出肺實質(zhì)和空肺泡分別所占面積的百分比，3位經(jīng)驗豐富的病理醫(yī)師在雙盲情況下閱片，評估肺組織中中性粒細(xì)胞的浸潤面積、肺泡腔內(nèi)中性粒細(xì)胞滲出量和肺泡腔內(nèi)滲出物量，結(jié)果以積分形式表示[8]。

2　結(jié)果

2.1氣管黏膜上皮細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化①對照組：大鼠氣管黏膜纖毛朝向一致、整齊，呈麥浪樣起伏的“絨毯狀”外觀,纖毛朝向一致、整齊。結(jié)果見圖1。②左氧組：大鼠氣管黏膜在第2小時可見部分纖毛排列不齊，第24小時纖毛排列紊亂，部分纖毛倒伏聚集并融合，第48小時纖毛受損數(shù)量增加，受損程度加重，大量纖毛倒伏、水腫，呈“蚯蚓”狀，第72小時大量纖毛壞死、脫落，呈“蟲蝕”狀，第120小時壞死、脫落的纖毛吸收消失，部分水腫、未壞死纖毛水腫減輕，第168小時壞死、脫落的纖毛尚未再生，纖毛相對稀疏，水腫、未壞死的纖毛形態(tài)恢復(fù)正常，排列整齊。結(jié)果見圖2。③干預(yù)組：大鼠氣管黏膜纖毛受損程度和左氧組相比有所減輕，倒伏和水腫纖毛數(shù)量減少，第48小時纖毛排列稍不齊，纖毛無明顯水腫及倒伏，第72小時纖毛排列紊亂，末端水腫、相互融合，但纖毛結(jié)構(gòu)仍完整，無壞死、脫落，第168 h時大部分纖毛形態(tài)恢復(fù)正常，排列整齊、致密。結(jié)果見圖3。三組大鼠氣管黏膜上皮細(xì)胞受損情況見表1。

圖1　對照組大鼠氣管黏膜纖毛電鏡檢查像(×9 000)

表1　三組大鼠氣管黏膜纖毛受損程度評分比較[中位數(shù)(四分位間距)]

注：1.除2 h和24 h外，左氧組其余相鄰時間點間比較，P<0.05。2.干預(yù)組2 h和24 h時比較，P=0.051，24 h和84 h時比較，P=0.667，其余時間點兩兩比較，P<0.05。左氧組與對照組比較，168 h時P=0.134，其余各時間點P<0.05；干預(yù)組與左氧組比較，24 h時P=0.511，168 h時P=0.513，其余各時間點P<0.05

圖2　左氧組大鼠氣管黏膜纖毛電鏡檢查像(×9 000)

圖3　干預(yù)組大鼠氣管黏膜纖毛電鏡檢查像(×9 000)

2.2肺組織病理檢查結(jié)果①對照組大鼠肺組織病理結(jié)果：支氣管上皮完整、排列整齊。結(jié)果見圖4。②左氧組第2小時少量支氣管上皮細(xì)胞排列紊亂，無脫落，第24小時排列紊亂的支氣管上皮細(xì)胞數(shù)目增多，支氣管腔內(nèi)可見少量炎癥細(xì)胞滲出，第48小時支氣管上皮細(xì)胞排列極其紊亂，肺間質(zhì)毛細(xì)血管擴(kuò)張充血，大量炎癥細(xì)胞浸潤，支氣管腔增寬，其內(nèi)含有大量紅細(xì)胞、炎癥細(xì)胞、纖維蛋白，第72小時部分支氣管上皮細(xì)胞、杯狀細(xì)胞崩解，纖毛壞死脫落，第120小時支氣管腔內(nèi)壞死物及紅細(xì)胞、炎癥細(xì)胞減少，第168小時尚未壞死脫落的纖毛排列恢復(fù)正常，支氣管腔內(nèi)壞死脫落物、炎癥細(xì)胞基本吸收。結(jié)果見圖5。③干預(yù)組在第2小時和第24小時少量上皮細(xì)胞排列紊亂，第48小時與左氧組比較，支氣管上皮細(xì)胞排列仍較整齊，管腔黏液分泌量及紅細(xì)胞、炎癥細(xì)胞量減少，第72小時部分支氣管上皮細(xì)胞紊亂，未出現(xiàn)上皮細(xì)胞崩解、壞死，大部分壞死物吸收消失，第168小時支氣管上皮細(xì)胞恢復(fù)正常，管腔內(nèi)壞死物及紅細(xì)胞、滲出物完全吸收，肺實質(zhì)減少，空肺泡所占面積增加。結(jié)果見圖6。三組大鼠肺組織病理受損程度評分比較見表2。

圖4　對照組大鼠肺組織病理檢查像(HE×100)

表2　三組大鼠肺組織病理受損程度評分比較±s)

注：干預(yù)組各時間點間兩兩比較，除24 h和48 h比較P=0.483外，其他P<0.01。左氧組與對照組比較，除168 h時P=0.670外，其余時間點P<0.05。干預(yù)組與左氧組比較，除24 h時P=0.665外，168 h時P=0.394外，其余各時間點P<0.05

圖5　左氧組大鼠肺組織病理檢查像(HE×100)

圖6　干預(yù)組大鼠肺組織病理檢查像(HE×100)

3　討論

從上個世紀(jì)開始，國內(nèi)外學(xué)者就經(jīng)氣管肺給藥的安全性和有效性進(jìn)行了有益的探索。上世紀(jì)70年代，國外學(xué)者就嘗試霧化吸入抗生素治療呼吸機(jī)相關(guān)性肺炎[9]。隨著對氣管內(nèi)抗生素應(yīng)用的認(rèn)識逐步深入，美國胸科學(xué)會(ATS)將其寫入指南指導(dǎo)臨床[10]。近年來，經(jīng)纖維支氣管鏡支氣管肺泡灌洗、氣管內(nèi)置管注藥已廣泛應(yīng)用于重癥肺部感染、肺結(jié)核、肺真菌感染、肺膿腫等患者，臨床療效好[11-13]。目前業(yè)界一致認(rèn)為其是一種有效的用藥途徑，廣泛用于肺部感染、慢性氣道炎癥性疾病[14-15]甚至惡性腫瘤[16-17]的治療，相關(guān)研究受到重視并不斷取得進(jìn)展。目前，多項吸入性抗生素治療氣道炎癥性疾病的國際多中心藥物臨床試驗已經(jīng)開展，結(jié)果值得期待[18-19]。進(jìn)一步的基礎(chǔ)及臨床研究將有助于深入氣管內(nèi)局部用藥的開展。

通過動物實驗研究氣管內(nèi)使用不同藥物的安全性為臨床氣管內(nèi)局部藥物的使用提供了很好的理論基礎(chǔ)。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，氣管內(nèi)局部注射生理鹽水、利多卡因和丁胺卡那霉素，可造成大鼠氣管黏膜上皮細(xì)胞、細(xì)支氣管和肺泡組織急性、可逆性損傷，不同藥物所造成的肺組織損傷程度及修復(fù)的時間亦不同[20]。本實驗沿用前期實驗的研究方法，經(jīng)過預(yù)實驗觀察，在觀察時間點上去除了96 h這個時間點，增加了120 h和168 h兩個時間點。實驗觀察到左氧組在給藥后2 h電鏡下纖毛即出現(xiàn)倒伏現(xiàn)象，后逐漸加重，至72 h時受損最嚴(yán)重，后逐漸減輕至基本恢復(fù)正常(168 h)。同時肺組織亦出現(xiàn)不同程度的病理損傷，但至168 h時基本恢復(fù)正常。因此，本研究結(jié)果顯示，氣管內(nèi)注射左氧氟沙星注射液，可損傷大鼠氣管黏膜和肺組織，但該損傷在7 d內(nèi)可自行修復(fù)至正常。

然而，臨床上是否可通過使用肺保護(hù)藥物來減輕該損傷具有非常重要的意義。鹽酸氨溴索可溶解黏液，促進(jìn)排痰[21]；還具有抗炎、抗氧化[22]、抗纖維化等作用。本實驗中干預(yù)組各時間點中除給藥第168小時外，氣管黏膜受損程度均較左氧組減輕，同時肺組織損傷在2 h、48 h、72 h、120 h時也明顯減輕，表明氨溴索可減輕甚至預(yù)防經(jīng)氣管內(nèi)局部使用左氧氟沙星所致的大鼠氣管黏膜和肺組織損傷。但并未縮短損傷的恢復(fù)時間。

然而，本研究僅觀察了左氧氟沙星氣管內(nèi)局部使用后氣管黏膜超微結(jié)構(gòu)和肺組織病理的改變，并在不同時間點觀察損傷的變化情況，同時觀察使用氨溴索干預(yù)后的損傷改變情況，但并未對不同劑量氨溴索的保護(hù)作用進(jìn)行觀察，同時目前氣管內(nèi)給藥造成的氣管黏膜和肺組織的損傷機(jī)制尚未完全清楚，與增加炎癥因子如IL-6、IL-8、結(jié)締組織生長因子、TNF-α的表達(dá)和其他機(jī)制是否有關(guān)尚需明確。鹽酸氨溴索是否通過干預(yù)細(xì)胞因子的表達(dá)而對氣管黏膜纖毛和肺組織的損傷起保護(hù)作用，將是我們今后研究的方向。

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Damage of levofloxacin to airway mucosa and lung tissues in rats and the protection effect of ambroxol

WEN Wen,LIU Wei,HU Shun-zhen,LAI Guo-xiang*

(Department of Respiratory and Critical Care Medicine,Fuzhou General Hospital of Nanjing Command, Dongfang Hospital of Xiamen University，F(xiàn)uzhou 350025,China)

ObjectiveTo study the protection effect of ambroxol hydrochloride on the injury of rat airway mucosa and lung tissue induced by intratracheal instillation of levofloxacin.MethodsNinety male SD rats were divided into three groups randomly:normal control group (n=30),levofloxacin group (n=30) and ambroxol hydrochloride intervention group (n=30).The rats of normal control group were punctured through thyrocricoid without any drug injection.The rats of levofloxacin group and intervention group were both intratracheally injected with levofloxacin slowly through thyrocricoid puncture under intraperitoneal anesthesia (28 mg/kg).The rats of intervention group were intraperitoneally injected with ambroxol hydrochloride at 6 h before intratracheal instillation of levofloxacin(70 mg/kg).The rats were killed respectively at the time points of 2 h,24 h,48 h,72 h,120 h and 168 h after intratracheal instillation in each group (5 rats at each time point in each group).The middle-low segment of the trachea and the posterior lobe of right lung were collected for pathological observation under electron microscope.ResultsThe mucosa cilia and lung tissues were damaged in different degree in levofloxacin group(except 168 h),as compared to normal control group (P<0.05).Compared with levofloxacin group,the damage to the mucosa cilia and lung tissues in intervention group were alleviated at 2 h,48 h,72 h and 120 h (P<0.05).ConclusionAmbroxol can attenuate the damage to airway mucosa and lung tissues caused by intratracheal instillation of levofloxacin.

Levofloxacin;Intratracheal instillation of drugs；Ambroxol hydrochloride

2016-06-27

南京軍區(qū)福州總醫(yī)院，廈門大學(xué)附屬東方醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，福州 350025

福建省自然科學(xué)基金面上項目(2013J01348)

10.14053/j.cnki.ppcr.201609005