鐘金男，　蘭　蘭，　何光珍，　黃　革，　楊　炯，　高亞東

(武漢大學(xué)中南醫(yī)院呼吸內(nèi)科， 湖北 武漢 430071)

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·短篇論著·

鈣庫操縱性鈣通道在人循環(huán)纖維細胞中的表達及功能*

鐘金男，蘭蘭，何光珍，黃革，楊炯，高亞東△

(武漢大學(xué)中南醫(yī)院呼吸內(nèi)科， 湖北 武漢 430071)

目的： 研究鈣庫操縱性鈣通道(store-operated calcium channels，SOCC)相關(guān)功能蛋白ORAI1-3和STIM1-2在人循環(huán)纖維細胞(circulating fibrocytes)中的表達及SOCC對人循環(huán)纖維細胞分化的影響。方法: 采集健康人外周靜脈血，分離出單個核細胞，體外培養(yǎng)分化為循環(huán)纖維細胞。采用RT-PCR和real-time PCR檢測循環(huán)纖維細胞中ORAI1-3及STIM1-2的mRNA表達情況，并檢測SOCC抑制劑對循環(huán)纖維細胞分化的影響。結(jié)果: Real-time PCR 檢測結(jié)果顯示ORAI1-3和STIM1-2 mRNA在循環(huán)纖維細胞中有較高的表達水平，并且SOCC抑制劑 SKF-96365對循環(huán)纖維細胞分化具有明顯的抑制作用。結(jié)論: SOCC表達于循環(huán)纖維細胞中，并且影響循環(huán)纖維細胞的分化。

循環(huán)纖維細胞； 鈣庫操縱性鈣通道； ORAI1-3； STIM1-2

人循環(huán)纖維細胞(circulating fibrocytes)是外周循環(huán)中的一種骨髓來源的間充質(zhì)祖細胞[1]，由CD14+單核細胞分化而來[2]，主要參與組織的修復(fù)與纖維化的過程，除此之外，還能作為抗原遞呈細胞激活 T 淋巴細胞[3]、促進血管生成[4]和穩(wěn)定細胞外基質(zhì)[5]。在健康個體中，它占有核細胞的比例不到1%[6]。近年來，大量研究證實循環(huán)纖維細胞是肌成纖維細胞的前體[7]，能夠遷移并在肺中募集，可能通過促進平滑肌層增厚[8]、促纖維化和/或促進炎癥過程[3]、促進新血管生成[4]和重建細胞外基質(zhì)[5]等途徑參與慢性哮喘氣道重塑過程。

鈣信號是細胞的重要第二信使，參與了細胞的增殖、分化、遷移和細胞因子分泌等多種功能的調(diào)控。細胞內(nèi)鈣離子濃度升高主要通過肌漿網(wǎng)(sarcoplasmic reticulum，SR)/內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(endoplasmic reticulum，ER)等鈣庫中的內(nèi)鈣釋放和胞外鈣離子內(nèi)流兩種途徑實現(xiàn)[9]。細胞膜上鈣庫操縱性鈣通道(store-operated calcium channel, SOCC)介導(dǎo)的鈣庫操縱性鈣內(nèi)流(store-operated calcium entry，SOCE)是非興奮性細胞外鈣內(nèi)流的主要途徑[10]。

目前發(fā)現(xiàn)ORAI家族蛋白ORAI1-3主要參與SOCC的鈣內(nèi)流孔道的構(gòu)成，而STIM家族蛋白STIM1-2 主要作為胞內(nèi)鈣庫鈣離子濃度的“傳感器”，在鈣離子濃度下降時將這一信號傳遞到胞膜的 SOCC，促使其開放，介導(dǎo)鈣離子內(nèi)流。本研究應(yīng)用real-time PCR檢測了體外培養(yǎng)的人循環(huán)纖維細胞中SOCC相關(guān)功能蛋白ORAI1-3和STIM1-2表達情況，并初步探討SOCC抑制劑對循環(huán)纖維細胞分化成熟的影響，為將來深入探討它們在支氣管哮喘病理機制中的功能奠定基礎(chǔ)。

材　料　和　方　法

1主要試劑

RPMI-1640 培養(yǎng)基、1 mmol/L HEPES、100×非必須氨基酸、100 mmol/L丙酮酸鈉和100× ITS-3均購自Sigma；青霉素(1×107U/L)/鏈霉素(10 g/L)混合液(100×)和200 mmol/L谷氨酰胺購自HyClone；平底 24孔組織培養(yǎng)板購自BD Biosciences；人CD14+單核細胞負選磁珠購自 Dynal Biotech；TRITC連接的鼠抗人CD45 和 I型膠原(collagenⅠ,ColⅠ)抗體、驢抗兔 IgG H&L(FITC)II 抗及 SKF-96365 購自Abcam；TRIzol、DNA處理酶I 和逆轉(zhuǎn)錄酶SSⅢ購自Invitrogen；高保真 Taq酶和 SYBR?Premix Ex TaqTM購自 TaKaRa。所有引物由生工生物工程(上海)股份有限公司根據(jù)設(shè)計合成。

2主要方法

2.1人循環(huán)纖維細胞的分離及培養(yǎng)用肝素抗凝管采集每位健康志愿者(來自武漢大學(xué)醫(yī)學(xué)院，均簽署書面知情同意書)外周血50 mL, 用pH 7.4 無菌磷酸鹽緩沖液(PBS)等體積稀釋后, 用等體積的淋巴細胞分離液分離, 2 000 r/min離心 20 min，小心吸取白膜。用至少3倍體積的無菌 PBS 洗滌白膜，1 500 r/min離心15 min，輕輕吸除上清。分離所得的細胞即為外周血單個核細胞(periphral blood mononuclear cells,PBMCs)。加500 μL 隔離緩沖液(0.1% BSA 和2 mmol/L EDTA 的無Ca2+及Mg2+的PBS)輕輕混勻細胞，用Dynabeads?UntouchedTM人單核細胞磁珠負選試劑盒得CD14+單核細胞。用無血清的 RPMI-1640 完全培養(yǎng)基[含10 mmol/L HEPES，2 mmol/L谷氨酰胺，1×105U/L 青霉素，100 mg/L 鏈霉素， 0.2% BSA，1× ITS-3(5 mg/L胰島素，5 mg/L轉(zhuǎn)鐵蛋白，5 μg/L亞硒酸鈉)，1 mmol/L 丙酮酸鈉，1×非必需氨基酸] 1 mL 重懸細胞，吹打混勻。將所得的細胞按2.5×109/L的密度接種于24 孔培養(yǎng)板內(nèi)，每孔2 mL，然后將培養(yǎng)板置于含 5% CO2的細胞培養(yǎng)箱內(nèi)37 ℃培養(yǎng)7d，觀察細胞形態(tài)變化。

2.2人循環(huán)纖維細胞的鑒定(1)形態(tài)學(xué)鑒定：按上述方法培養(yǎng)7 d后，光鏡下觀察，呈紡錘狀的長梭形貼壁細胞即為循環(huán)纖維細胞。(2)免疫組織化學(xué)鑒定：將分離的細胞接種于共聚焦培養(yǎng)皿內(nèi)，置于37 ℃，含 5% CO2的細胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng) 7 d，然后選擇分化較好的細胞培養(yǎng)皿，棄培養(yǎng)基， PBS 洗滌細胞 3 次，加入TRITC 連接的 CD45 抗體，4 ℃孵育 30 min 后，細胞清洗 3 次。用 250 μL 的固定破膜劑重懸細胞，4 ℃固定破膜 20 min。加入 PBS 溶液 2 mL，輕輕晃動培養(yǎng)皿，洗滌細胞 3 次，用含 2% 牛血清白蛋白的 PBS 室溫封閉60 min。加 Col Ⅰ的I抗，4 ℃過夜。再用 2 mL PBS 清洗細胞3 次后，加入 FITC 標記的驢抗兔IgG的II抗，4 ℃暗室孵育，過夜。 2 mL PBS清洗細胞 3 次后，加入 PBS ，熒光顯微鏡下觀察CD45和Col I的表達情況。

2.3RT-PCR及Real-time PCR檢測循環(huán)纖維細胞中ORAI1-3及STIM1-2的mRNA表達情況將分離得到的CD14+單核細胞按 2.5×108/L 的密度接種到24 孔培養(yǎng)板培養(yǎng)7 d。取樣后每管加入1 mL TRIzol進行RNA 抽提，最后每管RNA 晾干后加40 μL滅菌0.1‰ DEPC 處理雙蒸水溶解RNA 沉淀。取2 μg 總RNA 至1.5 mL 離心管中進行反轉(zhuǎn)錄，所使用DNase I 和逆轉(zhuǎn)錄酶SS Ⅲ均來自Invitrogen ，反轉(zhuǎn)錄完成后生產(chǎn)的cDNA 產(chǎn)物補雙蒸水至50 μL。RT-PCR 檢測采用的反應(yīng)體系為：0.4 μL primer F/R(10 μmol/L)，2 μL dNTPs (2.5 mmol/L)，2 μL 10倍緩沖液，0.2 μL Ex Taq，2 μL反轉(zhuǎn)錄cDNA 產(chǎn)物為模板，最后補滅菌雙蒸水至20 μL；反應(yīng)條件為：為94 °C 5 min；94 °C 15 s，60 °C 30 s，72 °C 30 s，共28循環(huán)；72 °C 5 min。反應(yīng)完成后PCR 產(chǎn)物經(jīng)0.8% 瓊脂糖凝膠電泳檢測。Real-time PCR 檢測基因表達量采用的反應(yīng)體系是10 μL SYBR?Premix Ex TaqTM，0.4 μL primer F/R(10 μmol/L)，0.4 μL ROX Reference Dye Ⅱ(10 μmol/L)，2 μL 反轉(zhuǎn)錄cDNA 產(chǎn)物，最后補滅菌雙蒸水至20 μL。Real-time PCR 反應(yīng)程序為:94 °C 10 s；94 °C 5 s，60 °C 38 s，40 循環(huán)；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s。RT-PCR 以及real-time PCR 所用引物見表1。

2.4SOCC抑制劑對循環(huán)纖維細胞分化的影響將分離得到的 PBMCs 按 2.5×108/L 的密度接種到24孔板內(nèi)；分組情況如下：分別設(shè)置空白對照組和SOCC抑制劑 SKF-96365 干預(yù)組：選擇 1 μmol/L、3 μmol/L、10 μmol/L、30 μmol/L 和 100 μmol/L 多個濃度梯度；37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)7 d，然后于 10 倍光學(xué)顯微鏡下觀察循環(huán)纖維細胞分化的情況，隨機取5 個視野拍照，并進行細胞計數(shù)。

表1RT-PCR 以及real-time PCR所用引物序列

Table 1.The sequences of the primers for RT-PCR and real-time PCR

NamePrimersequence(5'-3')Product(bp)GAPDHF:CATCACCATCTTCCAG-GAGCGA343R:GTCTTCTGGGTGGCAGTGAT-GGhORAI1F:AATCTCAACTCGGTCAAG-GAGTC343R:ACTGTCGGTCAGTCTTATG-GCTAhORAI2F:CGCAGTACCAGTACCCGCG-GCCG327R:AGCCCGTGTGACTC-CCAGGGCCAhORAI3F:GCGAGCAGGCCCCGCTGAAC348R:CTTCAATGTGGGGCAGCAGA-CAChSTIM1F:GTTTGCCTATATCCAGAAC-CGTTA342R:TACCATGAGCTGTGAGAT-TCTAGChSTIM2F:AGATGGTGGAATTGAAG-TAGAGG344R:CTTGAGCTGAAGTTTTT-GTCTGTG

F: forward; R: reverse.

3統(tǒng)計學(xué)處理

本實驗中所有數(shù)據(jù)均在Excel中完成分析，數(shù)值計量資料均以均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，兩組間差異比較采用獨立樣本t檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)　　果

1循環(huán)纖維細胞的鑒定

將分離所得 PBMCs 用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)7 d后，光鏡下可見部分貼壁細胞分化為長梭形，形態(tài)上符合已分化的循環(huán)纖維細胞的特征(圖1)，與文獻報道一致[11]；免疫組織化學(xué)檢測細胞分子標記的表達情況，冰丙酮固定細胞并破膜后，用 TRITC 連接的 CD45 抗體和 FITC 連接的 Col I 抗體對細胞進行染色，經(jīng)生物素親和素的信號放大作用，熒光顯微鏡下可同時觀察到 TRITC 的紅色熒光和 FITC 的綠色熒光，證實梭形細胞能夠同時表達CD45和Col I分子(圖2)。

Figure 1.Morphological characteristics of human circulating fibrocytes. PBMCs were cultured in serum-free medium for 7 d (×200). Typical fibrocytes were spindle-shaped (black arrow); some round adherent cells with big nucleus were macrophages differentiated from PBMCs (red arrow); small round suspended cells were lymphocytes (blue arrow).

圖1循環(huán)纖維細胞的形態(tài)學(xué)特征

2RT-PCR和real-time PCR 檢測循環(huán)纖維細胞中ORAI1-3和STIM1-2的mRNA表達

RT-PCR 結(jié)果顯示各基因引物特異性良好，條帶特異且PCR 產(chǎn)物大小符合預(yù)期，同時也表明了這批引物能夠用于real-time PCR 檢測，凝膠電泳檢測結(jié)果見圖3。進一步使用這些引物我們在6 個志愿者的人體循環(huán)纖維細胞中對ORAI1、 ORAI2、ORAI3、STIM1和STIM2進行了real-time PCR 的檢測。結(jié)果顯示，ORAI1 mRNA的表達量明顯高于ORAI2和ORAI3；而STIM1 mRNA的表達量也高于STIM2，表明ORAI1和STIM1是循環(huán)纖維細胞SOCC的主要構(gòu)成和調(diào)節(jié)分子,見圖4。

Figure 2.The molecular markers of human circulating fibrocytes. The results of immunohistochemical detection of the molecular markers expressed in the fibrocytes were shown.

圖2循環(huán)纖維細胞的分子標記

Figure 3.The mRNA expression of SOCC-related proteins in human circulating fibrocytes detected by RT-PCR.

圖3RT-PCR檢測循環(huán)纖維細胞SOCC相關(guān)蛋白的mRNA表達

Figure 4.The mRNA expression of ORAI1-3 and STIM1-2 in human circulating fibrocytes detected by real-time PCR.Mean±SEM.n=6.*P<0.05vsORAI1;#P<0.05vsSTIM1.

圖4Real-time PCR檢測ORAI1-3 和STIM1-2的mRNA 在人循環(huán)纖維細胞組織中的表達譜及表達豐度

3SOCC抑制劑SKF-96365對循環(huán)纖維細胞分化的影響

SKF-96365 是 SOCC的非特異性抑制劑，研究表明在SKF濃度為10 μmol/L時，基本上對細胞無毒害作用[12]。如圖 5 所示，無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)的PBMCs在加入較低濃度(1 μmol/L和3 μmol/L)的SKF-96365時，循環(huán)纖維細胞的分化過程即受到明顯的抑制，且具有很強的濃度依賴性，即濃度越高抑制越明顯。當(dāng) SKF-96365 的濃度為10 μmol/L 時，能抑制大部分循環(huán)纖維細胞的分化。

Figure 5.SOCC inhibitor SKF-96365 inhibited the differentiation of human circulating fibrocytes. SKF-96365 at diffe-rent concentrations was added into culured PBMCs. Numbers of cells in 5 randomly selected fields were counted. Mean±SEM.n=3.**P<0.01vs0 μmol/L.

圖5SOCC抑制劑 SKF-96365 對循環(huán)纖維細胞分化的影響

討　　論

氣道重塑是慢性哮喘的重要特征，其病理改變包括氣道上皮下纖維化及肌成纖維細胞聚積[13]。許多研究都表明循環(huán)纖維細胞是參與哮喘結(jié)構(gòu)和功能損害的重要因素。最早在2003 年Schmidt 等[14]發(fā)現(xiàn)在哮喘患者的氣道中含有循環(huán)纖維細胞(CD45+/CD34+和Col I 為識別標記)，而且這些細胞隨著患者接觸過敏原增多而數(shù)量增多。一項獨立研究發(fā)現(xiàn)嚴重難治性哮喘患者的支氣管活檢樣本中支氣管壁中循環(huán)纖維細胞數(shù)量較正常組明顯升高，而外周血中的循環(huán)纖維細胞數(shù)量也明顯升高[8]。最近一項臨床研究也發(fā)現(xiàn)哮喘患者外周血中的循環(huán)纖維細胞數(shù)量與哮喘的嚴重程度呈正相關(guān)，可以作為臨床嚴重哮喘的生物學(xué)標志[15]。

SOCC是非興奮性細胞胞外Ca2+內(nèi)流的主要通道，參與了基因轉(zhuǎn)錄、細胞凋亡、肌肉收縮、炎癥和應(yīng)激等多種生理和病理生理過程。有研究表明ORAI1和STIM1兩種蛋白是構(gòu)成SOCE 通道的重要組成部分。ORAI是近年來發(fā)現(xiàn)的一種位于細胞膜上的4次跨膜離子通道蛋白，哺乳動物ORAI家族中有3 個成員：ORAI1、ORAI2和ORAI3，其中ORAI1是最重要的SOCE 的效應(yīng)蛋白。研究表明ORAI1可以和ORAI2、ORAI3復(fù)合體來介導(dǎo)SOCE[16]。STIM家族成員包括STIM1和STIM2 。在哺乳動物研究中發(fā)現(xiàn)STIM1是SOCC的重要調(diào)節(jié)分子，而STIM2主要與維持鈣庫的穩(wěn)定有關(guān)。STIM1是分子量為77 kD 的跨膜蛋白，主要位于ER 膜上,它具有感受鈣池充盈狀態(tài)并將感受信號通過不同蛋白作用機制傳遞給ORAI及TRPC通道的雙重功能，是共同介導(dǎo)SOCE 的關(guān)鍵分子[17]。我們的 mRNA 表達研究表明，體外培養(yǎng)的循環(huán)纖維細胞均表達這些 SOCC相關(guān)蛋白，其中以STIM1和ORAI1的表達最為豐富，提示STIM1和ORAI1是循環(huán)纖維細胞 SOCC的主要構(gòu)成分子和調(diào)節(jié)分子。

單核細胞是循環(huán)纖維細胞的前體，SOCC介導(dǎo)的鈣離子內(nèi)流參與單核細胞的激活、增殖、分化及細胞因子的分泌等多種生理過程[18]。我們的既往研究顯示，在單核細胞分化而來的巨噬細胞和樹突狀細胞[12,19]，SOCC發(fā)揮了重要功能，對樹突狀細胞的成熟和抗原遞呈等功能具有調(diào)節(jié)作用，并有可能參與哮喘氣道炎癥過程。循環(huán)纖維細胞同樣由單核細胞分化而來，因此，理論上SOCC同樣會發(fā)揮功能調(diào)控作用。我們的研究結(jié)果證實了SOCC調(diào)控循環(huán)纖維細胞的分化過程。成纖維細胞和肌成纖維細胞可由循環(huán)纖維細胞分化而來，其基因表達和炎癥介質(zhì)釋放等多種細胞功能調(diào)控與非選擇性的 SOCC密切相關(guān)[20-21]。因此，循環(huán)纖維細胞的分化以及其進一步的分化為成纖維細胞和肌成纖維細胞的過程均受到SOCC的影響，提示SOCC可以作為一個節(jié)點分子，調(diào)節(jié)循環(huán)纖維細胞參與的病理生理過程，比如慢性哮喘的氣道重塑過程。下一步我們將用體內(nèi)實驗進一步驗證SOCC抑制后對循環(huán)纖維細胞在慢性哮喘氣道重塑中的作用的影響。

本實驗結(jié)果顯示循環(huán)纖維細胞表達SOCC相關(guān)基因，并且SOCC的活性影響循環(huán)纖維細胞的分化，表明SOCC是循環(huán)纖維細胞功能的重要調(diào)節(jié)機制。

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(責(zé)任編輯： 林白霜， 羅森)

Expression and function of store-operated calcium channels in human circulating fibrocytes

ZHONG Jin-nan, LAN Lan, HE Guang-zhen, HUANG Ge, YANG Jiong, GAO Ya-dong

(DepartmentofRespiratoryMedicine,ZhongnanHospitalofWuhanUniversity,Wuhan430071,China.E-mail:gaoyadong@whu.edu.cn)

AIM: To investigate the expression and function of store-operated calcium channels (SOCC) in human circulating fibrocytes.METHODS: Peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) were isolated and cultured in serum-free media. After 7 d, the PBMCs differentiated into fibrocytes. RT-PCR and real-time PCR were performed to determine the mRNA expression of ORAI1-3 and STIM1-2 in the fibrocytes. SOCC inhibitor SKF-96365 was used to elucidate the role of SOCC in the differentiation of fibrocytes. RESULTS: The results of real-time PCR showed that the mRNA expression of ORAI1-3 and STIM1-2 was positive in cultured fibrocytes. SKF-96365 (10 μmol/L) significantly inhibited the differentiation of fibrocytes.CONCLUSION: SOCC-related proteins ORAI1-3 and STIM1-2 are abundantly expressed in the fibrocytes, and may play an important role in the differentiation of these cells.

Circulating fibrocytes; Store-operated calcium channels; ORAI1-3; STIM1-2

1000- 4718(2016)04- 0733- 06

2015- 09- 29

2016- 03- 14

國家自然科學(xué)基金資助項目(No. 81270069)

Tel: 027-67813277； E-mail: gaoyadong@whu.edu.cn

R587.1

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.04.025

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