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      甲氧基聚乙二醇-b-聚L-半胱氨酸兩親性嵌段共聚物的合成與表征

      2016-10-26 03:00:33華東理工大學(xué)材料科學(xué)與工程學(xué)院上海200237
      功能高分子學(xué)報 2016年2期
      關(guān)鍵詞:兩親性氫譜甲醚

      陳 洋, 肖 艷(華東理工大學(xué)材料科學(xué)與工程學(xué)院,上海200237)

      甲氧基聚乙二醇-b-聚L-半胱氨酸兩親性嵌段共聚物的合成與表征

      陳 洋, 肖 艷
      (華東理工大學(xué)材料科學(xué)與工程學(xué)院,上海200237)

      首先以聚乙二醇單甲醚(mPEG-OH)為單體,采用經(jīng)典的蓋布瑞爾伯胺合成法合成了端氨基聚乙二醇單甲醚(mPEG-NH2);然后以mPEG-NH2為引發(fā)劑,S-芐基L-半胱氨酸N-羧酸內(nèi)酸酐(BCys-NCA)為原料,通過N-羧酸內(nèi)酸酐(NCA)開環(huán)聚合反應(yīng)和液氨/鈉處理脫除側(cè)鏈上的保護(hù)基團(tuán),合成了兩親性嵌段共聚物甲氧基聚乙二醇-b-聚L-半胱氨酸(mPEG-b-PCys)。采用傅里葉變換紅外光譜、核磁共振氫譜對聚合物的結(jié)構(gòu)和組成進(jìn)行了表征。結(jié)果表明:成功制備了側(cè)鏈具有還原性巰基的兩親性嵌段共聚物mPEG-b-PCys,并且其聚合度可控性良好。

      聚乙二醇單甲醚;巰基;兩親性;嵌段共聚物

      生物醫(yī)用高分子材料作為高分子材料領(lǐng)域中的一大重要分支,因其在生物體診斷、治療,以及替換、修復(fù)或再生損傷組織和器官等方面的重要作用,得到了國內(nèi)外眾多研究機(jī)構(gòu)的廣泛關(guān)注[1]。與傳統(tǒng)生物醫(yī)用高分子材料相比,聚肽材料因其良好的生物相容性、生物可降解性以及獨特的二級構(gòu)象,在組織工程、細(xì)胞信號調(diào)節(jié)、生物診斷與治療、藥物運輸、藥物緩釋以及生物化學(xué)反應(yīng)催化等領(lǐng)域有著越來越廣泛的應(yīng)用[2-5]。但是大多數(shù)的聚肽材料由于嚴(yán)重的分子內(nèi)及分子間氫鍵作用,導(dǎo)致其在水中的溶解性差[6]。而聚乙二醇作為一種常用的生物醫(yī)用高分子材料,具有優(yōu)良的水溶性以及生物相容性,它無毒、無刺激性,與很多有機(jī)溶劑可以很好地相溶,因此被越來越多地用于改善疏水性聚合物的水溶性,制備具有自組裝行為的兩親性嵌段共聚物。

      近年來,將聚乙二醇引入到聚肽材料中,制備聚肽基兩親性嵌段共聚物已經(jīng)成為研究的熱點:林嘉平等[7]使用端氨基聚乙二醇單甲醚(mPEG-NH2)為引發(fā)劑,引發(fā)芐基L-谷氨酸N-羧酸內(nèi)酸酐(BLG-NCA)開環(huán)聚合,制備出含有親水性聚乙二醇嵌段和疏水性聚肽嵌段的刷型聚合物,并進(jìn)一步研究了該聚合物水溶液的自組裝行為;陳學(xué)思等[8]使用mPEG-NH2為引發(fā)劑,引發(fā)L-苯丙氨酸N-羧酸內(nèi)酸酐和L-胱氨酸N-羧酸內(nèi)酸酐開環(huán)聚合,成功制備出聚乙二醇-b-聚氨基酸共聚物。隨后他們將聚合物溶解在磷酸鹽緩沖溶液(PBS)中制成聚合物納米膠束,并將阿霉素(DOX)載入到膠束內(nèi)核中。由于胱氨酸的存在將二硫鍵(S-S)引入到了納米膠束的內(nèi)核中,因此該膠束在還原劑谷胱甘肽的作用下,內(nèi)核中的二硫鍵會斷裂,進(jìn)而使膠束解體,釋放出其中所包載的DOX,實現(xiàn)了藥物在還原劑刺激條件下的控制釋放。Carmen Scholz等[9]采用mPEG-NH2為引發(fā)劑,引發(fā)帶有保護(hù)性基團(tuán)的L-谷氨酸N-羧酸內(nèi)酸酐和L-半胱氨酸N-羧酸內(nèi)酸酐單體開環(huán)聚合,然后經(jīng)過脫保護(hù)反應(yīng)制備出聚乙二醇-b-聚L-谷氨酸-b-聚L-半胱氨酸(PEG-b-PGlu-b-PCys)三嵌段共聚物。因為聚L-半胱氨酸嵌段中的巰基容易與金反應(yīng)形成Au-S鍵,因此該聚合物在金表面修飾領(lǐng)域有著廣闊的應(yīng)用前景。

      本文采用端氨基聚乙二醇單甲醚(mPEG-NH2)為引發(fā)劑,引發(fā)S-芐基L-半胱氨酸N-羧酸內(nèi)酸酐(BCys-NCA)開環(huán)聚合制備出兩親性嵌段共聚物甲氧基聚乙二醇-b-聚S-芐基L-半胱氨酸(mPEG-b-PBCys)。然后經(jīng)過脫保護(hù)反應(yīng),脫除側(cè)鏈上的保護(hù)基團(tuán)(芐基),制備側(cè)鏈含有活潑性巰基的兩親性嵌段共聚物甲氧基聚乙二醇-b-聚L-半胱氨酸(mPEG-b-PCys)。因為側(cè)鏈巰基活性比較高,容易進(jìn)行多種巰基化學(xué)反應(yīng),因此本文為后續(xù)的功能化修飾研究奠定了良好的理論基礎(chǔ)。

      1 實驗部分

      1.1原料及試劑

      聚乙二醇單甲醚(mPEG-OH,Mw=2.0×103)、對甲苯磺酰氯、鄰苯二甲酰亞胺鉀:化學(xué)純,Sigma-Aldrich試劑公司;二氯甲烷、三乙胺、碳酸鈉:分析純,上海凌峰化學(xué)試劑有限公司;甲苯、丙酮、無水乙醚、重水、氘代二甲基亞砜:分析純,上海泰坦科技股份有限公司;BCys-NCA:化學(xué)純,上海晶純生化科技股份有限公司;鈉:分析純,內(nèi)蒙古蘭太實業(yè)股份有限公司。

      1.2原料的預(yù)處理

      (1)mPEG-OH的干燥:將mPEG-OH(30 g)溶解在30 m L甲苯中,120℃的油浴條件下使用油水分離器和球形冷凝管蒸餾除水,重復(fù)3次。然后置于80℃的油浴條件下抽真空干燥12 h,室溫下自然冷卻后保存待用。

      (2)對甲苯磺酰氯的純化:首先將對甲苯磺酰氯溶于一定比例的干燥過的甲苯-正己烷混合溶液中,然后將溶液置于60℃的油浴條件下加熱使其充分溶解,最后將其置于-20℃的冰箱中冷卻結(jié)晶,抽濾、真空干燥得到白色針狀固體產(chǎn)物。

      (3)N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、二氯甲烷(CH2Cl2):使用氫化鈣干燥48 h,蒸餾并密封保存。

      1.3實驗過程

      1.3.1mPEG-NH2的制備 準(zhǔn)確稱量20 g(11.8 mmol)mPEG-OH和4.5 g(23.6 mmol)對甲苯磺酰氯加入到80 m L無水二氯甲烷中,然后加入28 m L三乙胺作為縛酸劑,室溫下攪拌反應(yīng)12 h。然后用事先配好的鹽酸溶液(1 mol/L)對反應(yīng)液進(jìn)行洗滌,直至溶液為中性。最后用無水碳酸鈉干燥12 h,減壓蒸餾除去大約2/3的溶劑。抽濾,除去溶液中的固體顆粒后,將濾液用過量的無水乙醚沉降,抽濾得到中間產(chǎn)物甲氧基聚乙二醇-對甲苯磺酸酯(mPEG-OTs)。

      稱取10 g(5.9 mmol)上述反應(yīng)產(chǎn)物、1.85 g(11.8 mmol)鄰苯二甲酰亞胺鉀溶解于70 m L DMF中,120℃下攪拌反應(yīng)6 h后,減壓蒸餾除去DMF。然后再加入120 m L無水乙醇、10 m L 80%的水合肼回流反應(yīng)12 h。反應(yīng)液在大量無水乙醚中沉降、抽濾得到白色固體。將此白色固體溶解于CH2Cl2中,濾出不溶物,濾液用大量無水乙醚沉降,抽濾、真空干燥得到mPEG-NH2。

      1.3.2mPEG-b-PBCys的制備 稱取7.11 g(30 mmol)BCys-NCA、4 g(2 mmol)mPEG-NH2,加入到150 m L DMF中,在氮氣保護(hù)條件下,冰水浴中反應(yīng)72 h。反應(yīng)結(jié)束后,將反應(yīng)液用過量的無水乙醚沉降,離心、真空干燥得到白色固體產(chǎn)物即為嵌段共聚物mPEG-b-PBCys。

      1.3.3mPEG-b-PCys的制備 稱取5 g mPEG-b-PBCys加入到100 m L液氨中,切取少許鈉絲分批加入到反應(yīng)體系中(每一小塊Na加入后,反應(yīng)體系會呈深藍(lán)色,然后顏色逐漸退去,待深藍(lán)色消失后再補(bǔ)加金屬Na),干冰-丙酮浴條件下攪拌反應(yīng)8 h。反應(yīng)結(jié)束后揮發(fā)掉剩余的液氨,加入150 m L去離子水?dāng)嚢?0 min,抽濾得到澄清濾液。向濾液中滴加鹽酸至p H=5,然后將產(chǎn)物置于透析袋(截留分子量為1 000)中透析72 h。透析完成后將產(chǎn)物置于冷凍干燥機(jī)中干燥72 h,即可得到產(chǎn)物mPEG-b-PCys。

      1.4測試與表征

      核磁共振氫譜(1H-NMR)采用德國布魯克公司生產(chǎn)的Bruker 400 MHz核磁共振波譜儀測定,以重水(D2O)、氘代二甲基亞砜(DMSO)作為溶劑,四甲基硅烷(TMS)作為內(nèi)標(biāo)。通過質(zhì)子氫在譜圖上的各出峰位置、峰的相對面積積分比,確定聚合物的分子結(jié)構(gòu),通過參比基準(zhǔn)物對比計算出聚合物的聚合度、數(shù)均分子量;傅里葉變換紅外光譜(FT-IR)使用美國尼高力儀器公司Nicolet 5700型傅里葉紅外光譜儀測定,采用固體溴化鉀(KBr)壓片法制樣。

      2 結(jié)果與討論

      2.1合成路線

      考慮到均聚L-半胱氨酸(PCys)的溶解性非常差,本文旨在將親水性的mPEG-OH引入到聚合物主鏈中,制備兩親性嵌段共聚物mPEG-b-PBCys。然后通過脫保護(hù)操作,將巰基上的保護(hù)基(芐基)脫除,以暴露出具有高度反應(yīng)活性的巰基基團(tuán),為后續(xù)的修飾反應(yīng)提供反應(yīng)位點。具體的合成路線如圖1所示。

      圖1 mPEG-NH2和mPEG-b-PCys的合成路線Fig.1 Synthetic routes for mPEG-NH2and mPEG-b-PCys copolymers

      2.2 mPEG-NH2的結(jié)構(gòu)表征

      圖2(A)為mPEG-OTs的核磁共振氫譜,聚合物中所有氫的特征峰已經(jīng)在核磁共振氫譜中標(biāo)出。d峰(苯環(huán),7.23~7.76)和e峰(甲基,2.34)的出現(xiàn)說明末端羥基已經(jīng)成功轉(zhuǎn)變成了對甲苯磺酸酯基。圖2(B)為mPEG-NH2的核磁共振氫譜,與圖2(A)相比,聚合物在7.23~7.76(d峰)和2.34(e峰)處的吸收峰已經(jīng)全部消失,表明末端的對甲苯磺酰基已經(jīng)成功脫除,在1.83處出現(xiàn)了一個新的吸收峰,經(jīng)重水交換反應(yīng)驗證為末端氨基上活潑氫的吸收峰。因此,可以確定本文成功制備出了mPEG-NH2。

      圖2 mPEG-OTs(A)和mPEG-NH2(B)的核磁共振氫譜Fig.21H-NMR spectra of mPEG-OTs(A)and mPEG-NH2(B)

      2.3mPEG-b-PBCys的結(jié)構(gòu)表征

      圖3為mPEG-b-PBCys的核磁共振氫譜。從圖中可以看出產(chǎn)物中各個吸收峰都能找到相應(yīng)的歸屬。其中3.23處為mPEG嵌段中末端甲基的吸收峰(a峰),7.23~7.76處為PBCys嵌段中苯環(huán)的吸收峰(g峰),3.67處為與苯環(huán)相連的亞甲基的吸收峰(f峰)。根據(jù)a峰和g峰的面積比可以算出產(chǎn)物的實際聚合度為21,設(shè)計聚合度為20,實際聚合度與設(shè)計聚合度有一定的差別,推測原因是mPEG-NH2的活性較低,有少量引發(fā)劑未能成功引發(fā)聚合反應(yīng),所以造成實際聚合度略高于理論聚合度。

      圖4為mPEG-b-PBCys的紅外光譜,圖中1 630 cm-1和1 517 cm-1處為PBCys嵌段中羰基和仲胺的吸收峰,1 500~2 000 cm-1處鋸齒狀吸收峰為側(cè)鏈芐基吸收峰。綜合核磁和紅外結(jié)果可知,mPEG-b-PBCys被成功合成。

      圖3 mPEG-b-PBCys的核磁共振氫譜Fig.31H-NMR spectrum of mPEG-b-PBCys

      圖4 mPEG-b-PBCys的紅外光譜Fig.4 FT-IR spectrum of mPEG-b-PBCys

      2.4mPEG-b-PCys的結(jié)構(gòu)表征

      圖5為mPEG-b-PCys的核磁共振氫譜。從圖中可以看出:與mPEG-b-PBCys的核磁結(jié)果相比較,在7.23~7.76處的苯環(huán)的吸收峰和在3.67處與苯環(huán)相連的亞甲基的吸收峰(f峰)同時消失,其他吸收峰并沒有顯著變化,并且各個吸收峰都能找到相應(yīng)的歸屬。為了進(jìn)一步確定芐基脫除后是否成功暴露出了活潑的巰基,又對產(chǎn)物mPEG-b-PCys進(jìn)行了傅里葉變換紅外光譜表征(圖6),與mPEG-b-PBCys的結(jié)果相比,在1 500~2 000 cm-1處的鋸齒狀的吸收峰全部消失,在2 550 cm-1處出現(xiàn)了巰基的吸收峰。綜合核磁和紅外結(jié)果可知,本文成功制備出了兩親性嵌段共聚物mPEG-b-PCys。

      圖5 mPEG-b-PCys的核磁共振氫譜Fig.51H-NMR spectrum of mPEG-b-PCys

      圖6 mPEG-b-PCys的紅外光譜Fig.6 FT-IR spectrum of mPEG-b-PCys

      3 結(jié) 論

      (1)采用經(jīng)典的蓋布瑞爾伯胺合成法(Gabriel method),通過聚乙二醇單甲醚與對甲苯磺酰氯、鄰苯二甲酰亞胺鉀、水合肼反應(yīng),成功制備了大分子引發(fā)劑端氨基聚乙二醇單甲醚mPGE-NH2。

      (2)以mPGE-NH2為引發(fā)劑,引發(fā)BCys-NCA單體開環(huán)聚合,制備出兩親性嵌段共聚物mPEG-b-PBCys。

      (3)通過脫保護(hù)反應(yīng),成功將mPEG-b-PBCys側(cè)鏈上的芐基脫除,制備出兩親性嵌段共聚物mPEG-b-PCys。由于側(cè)鏈上的巰基化學(xué)性質(zhì)非常活潑,因此為后續(xù)反應(yīng)提供了反應(yīng)位點。

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      Synthesis and Characterization of Poly(ethylene glycol)-b-Poly(L-cysteine)Block Copolymer

      CHEN Yang, XIAO Yan
      (School of Materials Science and Engineering,East China University of Science and Technology,Shanghai 200237,China)

      Amine-terminated mPEG(mPEG-NH2)was first synthesized by Gabriel method using mPEG-OH as the monomer.Methoxy poly(ethylene glycol)-b-poly(L-cysteine)(mPEG-b-PCys)amphiphilic block copolymers were further synthesized by ring opening copolymerization of S-benzyl L-cysteine N-carboxyanhydride(BCys-NCA)initiated with the amine terminated mPEG and followed by the removal of the protected groups using liquid NH3/Na.The structures of the polymers were characterized by Nuclear Magnetic Resonance spectroscopy(1H-NMR)and Fourier Transform Infrared spectroscopy (FT-IR).Results showed that the amphiphilic block copolymers containing active thiol groups were synthesized successfully,and the degree of polymerization was controllable.

      poly(ethylene glycol);thiol group;amphiphilic;block copolymer

      TQ317

      A

      1008-9357(2016)02-0188-005DOI: 10.14133/j.cnki.1008-9357.2016.02.007

      2016-05-08

      陳 洋(1989-),男,山東濟(jì)寧人,碩士生,主要研究方向為功能化聚肽材料的合成及其性能研究。E-mail:ychen_ecust@163.com

      肖 艷,E-mail:yxiao@ecust.edu.cn

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