詹琳琳, 郭玉雙, 蔡健宇, 武曉云, 楊　靚

(1.浙江農(nóng)林大學(xué)農(nóng)業(yè)與食品科學(xué)學(xué)院，浙江 臨安 311300；2.貴州省煙草科學(xué)研究院，煙草行業(yè)分子遺傳重點實驗室，貴州 貴陽 550081；3.福建農(nóng)林大學(xué)植物保護學(xué)院，福建 福州 350002)

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NtMAP70基因在煙草抗馬鈴薯Y病毒過程中的作用

詹琳琳1, 郭玉雙2, 蔡健宇1, 武曉云1, 楊靚3

(1.浙江農(nóng)林大學(xué)農(nóng)業(yè)與食品科學(xué)學(xué)院，浙江 臨安 311300；2.貴州省煙草科學(xué)研究院，煙草行業(yè)分子遺傳重點實驗室，貴州 貴陽 550081；3.福建農(nóng)林大學(xué)植物保護學(xué)院，福建 福州 350002)

為了探明微管結(jié)合蛋白70(MAP70)在抗馬鈴薯Y病毒(PVY)中的作用機制，克隆了煙草NtMAP70基因的全長，并進行了生物信息學(xué)分析.利用實時熒光定量 PCR研究了該基因在煙草不同時期和不同部位中的表達水平，結(jié)果表明，NtMAP70在煙草的各個生長期均有表達，且在根中的表達量最高.構(gòu)建了基于雙生病毒衛(wèi)星誘導(dǎo)的煙草NtMAP70的沉默載體，以中國番茄黃化曲葉病毒(TYLCCNV)為輔助病毒在煙草中沉默了該基因.與對照相比，在NtMAP70基因沉默的煙草中PVY侵染速率明顯減緩，病毒含量顯著降低.

NtMAP70; 馬鈴薯Y病毒; 煙草； 抗性

馬鈴薯Y病毒(PotatovirusY, PVY)是馬鈴薯Y病毒科(Potyviridae)馬鈴薯Y病毒屬(Potyvirus)的典型成員，能侵染34個屬170余種植物，以茄科植物為主，藜科和豆科次之，危害嚴重的作物有馬鈴薯、煙草、番茄等[1].煙草是我國的重要經(jīng)濟作物之一，近幾年 PVY在我國煙區(qū)暴發(fā)成災(zāi)，并且存在逐年加重的趨勢.PVY感染煙草癥狀：病株葉脈變暗褐色至黑色壞死，葉片呈斑駁花葉狀、污黃褐色，有時壞死部分延伸至主脈和莖的韌皮部，病株根系發(fā)育不良，變褐腐爛.煙草的產(chǎn)量和品質(zhì)受到嚴重影響.許多研究者試圖尋找有效的防治途徑，包括選育優(yōu)良的抗病品種或篩選高效的防治藥劑，但仍未取得理想的防治效果[2].因此，明確 PVY與植物相互作用的分子機制，挖掘植物內(nèi)源的抗PVY基因，對于認識抗性本質(zhì)并進行科學(xué)的遺傳改良具有重要意義.

植物微管是一種具有極性的細胞骨架，于1963年首次被發(fā)現(xiàn)[3].隨后研究者利用免疫熒光顯微術(shù)和電鏡技術(shù)對微管進行的研究發(fā)現(xiàn)，植物中微管、微絲、中間纖維三者共同構(gòu)成了細胞質(zhì)中三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的骨架系統(tǒng).微管除了具有骨架功能外，還能對細胞壁構(gòu)建、極性確定、有絲分裂、胞質(zhì)流動等生理活動起作用.微管的這些功能不僅需要自身的微管蛋白，還需要微管結(jié)合蛋白(microtubule-associated proteins, MAPs)的參與[4-5].微管結(jié)合蛋白是經(jīng)過反復(fù)的聚合—解聚多次超速離心后仍然能聚集到微管上與之共純化的蛋白[6].MAP70是植物特有的與微管相互作用的蛋白[7-8].目前，有關(guān)MAP類基因是否參與植物對病原菌的抗性還未見報道.

在前期對煙草栽培品種“K326”感染PVY后轉(zhuǎn)錄組測序的研究中發(fā)現(xiàn)，煙草MAP70基因(http:∥www.solgenomics.net/, mRNA_84274)顯著被PVY誘導(dǎo).為了探明其在煙草抗PVY過程中的作用，同時為煙草的抗病育種提供依據(jù)，本研究首先克隆NtMAP70的全長，并進行生物信息學(xué)分析和表達模式研究；利用病毒介導(dǎo)的基因沉默技術(shù)，分析NtMAP70基因沉默情況下煙草對PVY抗性的變化.

1　材料與方法

1.1供試材料

煙草栽培品種“K326”、PVY脈壞死株系(PVYN)、大腸桿菌DH5α、農(nóng)桿菌EHA105感受態(tài)均由貴州省煙草科學(xué)研究院提供.T載體購自Promega公司，PCR相關(guān)試劑及限制性內(nèi)切酶購自TAKARA公司，T4連接酶購自NEB，質(zhì)粒提取試劑盒、膠回收試劑盒均購于TIANGEN公司，其他常用化學(xué)藥劑均為國產(chǎn)分析純.

1.2試驗方法

1.2.1樣品總RNA的提取取煙草的根、葉，分別加入液氮，研磨成粉，使用Trizol法提取總RNA，-80 ℃保存?zhèn)溆?參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書合成cDNA第一鏈.

表1　引物及其序列1)Table 1　Primers and sequences

1)GGATCC是BamHⅠ酶切位點；TCTAGA是XbaⅠ酶切位點.

1.2.2NtMAP70全長及保守片段的克隆(1)引物設(shè)計.采用Primer Premier 5軟件，根據(jù)MAP70基因序列設(shè)計全長及Real time檢測引物.設(shè)計基因沉默片段引物時，為了使克隆片段便于與載體2mDNA1相連，在NtMAP70基因引物中添加BamHⅠ、XbaⅠ的限制性酶切位點(表1).

(2)片段克隆及檢測.利用反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板進行PCR擴增.PCR反應(yīng)體系：10×Buffer 2.5 μL，2.5 nmol·L-1dNTPs 2 μL，Taq酶0.5 μL，引物各1 μL，DNA模板1 μL，用水補至25 μL，然后離心混勻.PCR擴增條件：先94 ℃預(yù)變性5 min，然后94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸3 min，循環(huán)35次后，于72 ℃延伸10 min.

使用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收擴增產(chǎn)物，與T-Vector連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，交由上海捷瑞生物工程有限公司測序.

1.2.3NtMAP70植物沉默載體的構(gòu)建參照Huang et al[9]建立的栽培煙草基因沉默體系,對測序正確的菌液進行質(zhì)粒提取，用BamHⅠ、XbaⅠ雙酶切并回收目的片段.將回收產(chǎn)物與同樣酶切的沉默載體2mDNA1-Vector連接，構(gòu)建沉默載體2mDNA1-NtMAP70.利用凍融法轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌菌株EHA105中.

1.2.4病毒接種將含有沉默載體2mDNA1-NtMAP70的農(nóng)桿菌與含有輔助病毒中國番茄黃化曲葉病毒(TomatoyellowleafcurlChinavirus, TYLCCNV)的農(nóng)桿菌以1∶1混合，通過注射接入煙草；以輔助病毒與空載體接種的煙草作為對照.

1.2.5病毒含量分析接種PVY 22 d后，分別取試驗組(轉(zhuǎn)入NtMAP70沉默載體)與對照組(轉(zhuǎn)入空載體)的發(fā)病葉片以及健康煙草葉片[陰性對照(N)]，使用Agdia公司的PVY PathoScreen Kit檢測不同處理中的病毒含量，并利用酶標儀測量并記錄D405 nm.若樣品D405 nm值與陰性對照D405 nm值的比值(D405 nm/N)≥1.5則可判斷樣品為PVY陽性(+);反之，D405 nm/N<1.5則判斷為陰性(-).3組生物學(xué)重復(fù).

1.2.6基因表達分析利用SYBR Green染料法在熒光定量Viia 7 PCR儀上反應(yīng)，以延伸因子EF-1-α(elongation factor 1-alpha 1 gene)作為內(nèi)參，定量分析NtMAP70基因的表達情況，引物設(shè)計見表1.PCR反應(yīng)體系：SYBR Green 10 μL，DNA模板1 μL，引物各1 μL，用水補至20 μL，然后離心混勻.PCR擴增條件：先94 ℃預(yù)變性5 min，然后94 ℃變性30 s，68 ℃退火30 s，循環(huán)35次后，于72 ℃延伸10 min.

2　結(jié)果與分析

2.1NtMAP70全長基因的克隆與序列分析

M.DL5000 marker;1.NtMAP70.圖1　NtMAP70全長基因的克隆Fig.1　Cloning of full-length NtMAP70

對NtMAP70全長基因進行PCR克隆，得到2 897 bp的片段(圖1)，經(jīng)測序,其與sol數(shù)據(jù)庫(http:∥www.solgenomics.net/)中mRNA_84274序列完全一致.用近鄰相接法(MEGA 4.0)對不同植物MAP70進行進化分析，表明MAP70廣泛存在于多種植物中，煙草NtMAP70與番茄、馬鈴薯親緣關(guān)系最近(圖2).

2.2NtMAP70基因的轉(zhuǎn)錄表達結(jié)果

實時熒光定量PCR檢測表明，NtMAP70基因在煙草的幼苗期、旺長期和成熟期的根和葉中均有表達，且根中的表達量均高于葉片(圖3)，這與MAP基因參與轉(zhuǎn)運物質(zhì)的生理功能相一致；根和葉中都是幼苗期的表達量最高，旺長期表達量最低，這可能由于幼苗期處于細胞生長旺盛階段，微管組織結(jié)構(gòu)大量合成，物質(zhì)運輸頻繁，而旺長期、成熟期微管組織結(jié)構(gòu)成熟，MAP70蛋白較幼苗期出現(xiàn)了大幅度減少.

圖2　煙草NtMAP70與其他植物MAP70基因的系統(tǒng)進化樹

圖3　NtMAP70基因在煙草不同時期、不同部位的表達水平

2.3基因沉默載體的構(gòu)建

用PCR擴增NtMAP70基因得到約500 bp的片段(圖4)，將回收的載體片段與T載體連接，測序，挑選正確的克隆用于下一步研究.將目的片段與2mDNA1-Vector連接，獲得重組質(zhì)粒2mDNA1-NtMAP70，用BamHⅠ、XbaⅠ雙酶切鑒定(圖5).將沉默載體2mDNA1-NtMAP70轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌EHA105中.

M.DL2000 marker;1.NtMAP70.

M.DL2000 marker;1.NtMAP70.

2.4基因表達分析

在接種30 d時分別選取沉默植株和接種2mDNA1空載體植株的葉片，用Trizol法提取這些葉片的總RNA，再用Oligo d (T) 18引物合成cDNA第一鏈.利用RT-qPCR檢測NtMAP70基因的表達水平，結(jié)果表明，與接種空載體植株中NtMAP70基因的表達量相比，接種沉默載體植株中目的基因的表達水平顯著下調(diào)，約為對照的15%.

2.5表型調(diào)查

圖6　接種PVY植株發(fā)病情況Fig.6　Incidence rate of PVY in tobacco inoculated with PVY

注射農(nóng)桿菌30 d后，摩擦接種PVY，1周后開始觀察并記錄發(fā)病情況，每5 d記錄一次.結(jié)果表明，NtMAP70基因沉默后，煙草的發(fā)病率明顯低于對照(圖6)，說明NtMAP70在煙草抗PVY的過程中具有負調(diào)控作用.選取接種22 d后的葉片，經(jīng)PVY檢測表明，對照組的平均D405 nm值為1.479，試驗組為0.659，陰性對照為0.214；對照組D405 nm/N為6.922，試驗組為3.083，兩者皆為PVY陽性.這說明沉默NtMAP70后，雖然煙草依舊發(fā)病，但發(fā)病癥狀延緩，且其中PVY的含量降低，表明PVY復(fù)制受到了抑制.

3　討論

在野生辣椒(Capsicumchinense)中克隆到一個與 PVY抗性有關(guān)的基因eIF4E-1，并證明該基因能與PVY的Vpg互作， 影響PVY在植物體內(nèi)的復(fù)制[10],從而減輕PVY的癥狀. 在野生馬鈴薯(Solanumchacoense,S.demissum, andS.etuberosum)中也克隆到了eIF4E-1的同源基因Eva1，并證明該基因也有類似的功能[11].由于植物對病毒的抗性機理極為復(fù)雜，大量的新的植物抗PVY基因及抗病機理值得進一步挖掘.

本試驗根據(jù)前期的研究結(jié)果，選取受PVY誘導(dǎo)的煙草微管結(jié)合蛋白NtMAP70作為研究對象，對其抗病毒作用進行了深入研究.通過病毒介導(dǎo)的基因沉默，在煙草中沉默了該基因，NtMAP70沉默后植株中PVY含量變少，發(fā)病慢，說明NtMAP70沉默在一定程度上抑制了PVY的復(fù)制并延緩了發(fā)病時間.由此可推測，NtMAP70對PVY侵染煙草有促進作用.其具體機理有待深入探究.

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(責(zé)任編輯:楊郁霞)

校園景色：

Role ofNtMAP70 in the resistance of tobacco to potato virus Y infection

ZHAN Linlin1, GUO Yushuang2, CAI Jianyu1, WU Xiaoyun1, YANG Liang3

(1.School of Agriculture and Food Science, Zhejiang A & F University, Lin′an, Zhejiang 311300, China; 2.Key Laboratory of Molecular Genetics, China National Tobacco Corporation, Guizhou Institute of Tobacco Science, Guiyang, Guizhou 550081,China; 3.College of Plant Protection, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou, Fujian 350002, China)

To elucidate the mechanism of microtubule-associated protein 70 (MAP70) on combatingPotatovirusY(PVY), full-lengthNtMAP70 was firstly isolated, and transcriptional expression levels ofNtMAP70 in different organs and growing periods were measured by real-time quantitative PCR. ThenNtMAP70 gene silencing vector, based on geminivirus satellite, was introduced intoAgrobacteriumtumefaciensstrain EHA105. AndAgrobecteriumharboring recombinant silencing vector andTomatoyellowleafcurlChinavirus(TYLCCNV) infectious clone were co-agroinoculated into tobacco plants. Results showed thatNtMAP70 was expressed in all organs and growing periods, among which the expression levels was highest in the root. Compared with the control, PVY infection rate was lower in tobacco plants that inoculated with silenced gene so as a reduced level of PVY. To summarize, silencedNtMAP70 gene is very likely to suppress the proliferation of PVY and retard its activity.

NtMAP70; PVY; tobacco; resistance

2015-11-22

2016-01-05

國家自然科學(xué)基金(31360431).

詹琳琳(1990-),女，碩士研究生.研究方向：植物分子生物學(xué).通訊作者郭玉雙(1981-),女,副研究員.研究方向：分子植物病理學(xué).Email:yshguo@126.com.

S435.72

A

1671-5470(2016)05-0556-05

10.13323/j.cnki.j.fafu(nat.sci.).2016.05.013