陳曄，陳榮,*，莫正平

廈門大學環(huán)境與生態(tài)學院，近海海洋環(huán)境科學國家重點實驗室，廈門361102

重金屬Cd、Pb對褐菖鲉肝臟組織中HSPs基因表達的影響

陳曄1，陳榮1,*，莫正平1

廈門大學環(huán)境與生態(tài)學院，近海海洋環(huán)境科學國家重點實驗室，廈門361102

為了解重金屬污染對海洋魚類熱休克蛋白(HSPs)基因表達的影響，將褐菖鲉(Sebastiscus marmoratus)分別暴露于1.6、8、40、200、500 μg·L-1Cd、Pb溶液中，用環(huán)介導等溫擴增技術(shù)（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）定量檢測褐菖鲉肝臟HSP60、HSP70、HSP90、HSC70 mRNA表達量。結(jié)果表明：Pb僅在40 μg·L-1時顯著抑制HSP60、HSP90、HSC70 mRNA表達量，8 μg·L-1時即可顯著抑制HSP70 mRNA表達量，并在40 μg·L-1時達到最小值；Cd對HSP60、HSP90、HSC70的誘導不明顯，但能顯著誘導HSP70，并在500 μg·L-1時達到最大值。相比之下，褐菖鲉肝HSP70基因?qū)χ亟饘貱d、Pb污染較為敏感，有潛力成為監(jiān)測海洋重金屬污染的預警分子。

Cd；Pb；褐菖鲉；肝臟；熱休克蛋白；HSPs；環(huán)介導等溫擴增

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近些年來，我國海洋經(jīng)濟發(fā)展迅速，海洋環(huán)境問題凸顯，其中海洋重金屬污染問題已經(jīng)引起各界的高度關(guān)注。國家環(huán)保部的一項調(diào)查顯示，我國近岸海域的海水采集樣品中，鉛的超標率高達62.9%，最大值超第一類海水標準49倍，鎘的超標率為25.9%。并且，我國重金屬排海量較大且呈逐年上升趨勢[1]。污染物的危害主要體現(xiàn)為對生物體的毒害作用，因此，利用生物體內(nèi)毒性傷害狀況監(jiān)測其所處的環(huán)境，可對污染總體效應(yīng)進行直觀、綜合的評價[2]。

研究表明，在嗅覺器官中，鎘的蓄積比其他器官要高得多，并且抑制了血漿皮質(zhì)醇濃度的升高。顯然，水環(huán)境中的鎘破壞了魚群對示警物質(zhì)的正常行為和生理反應(yīng)，改變了魚群的回避策略[3]。鎘離子也可以直接進入腦組織而發(fā)生影響，造成腦機能障礙，特別造成小腦機能障礙，使中毒魚失去平衡，引起側(cè)翻，甚至沉入水底[4]。鉛是一種神經(jīng)毒性物質(zhì)，能通過各種途徑進入水生生態(tài)系統(tǒng)中，造成許多生物體包括魚類的行為產(chǎn)生改變。在鉛的毒性作用下，魚類活動過度興奮，游泳行為出現(xiàn)異?；虺霈F(xiàn)環(huán)繞游動的不穩(wěn)定反應(yīng)[5]。但也有研究發(fā)現(xiàn)，鉛中毒后魚類的活動下降。鉛也會影響魚類的攝食行為使魚類的捕食能力下降，主要影響的方面是降低捕食的時間、增加捕食失誤的次數(shù)[6]。鉛還會干擾魚類對有害刺激的反應(yīng)能力，如降低其對電擊的躲避行為[7]。

1962年，Ritossa[8]首先在果蠅(Drosophila melanogaster)中發(fā)現(xiàn)HSPs，進一步的研究發(fā)現(xiàn)，從原核細胞到高等真核細胞的整個生物界中，都普遍存在著HSPs，熱休克基因家族是迄今為止發(fā)現(xiàn)的最為保守的家族[9]。后來Tisseres證實，熱休克反應(yīng)中合成的是一組特殊蛋白質(zhì)，命名為熱休克蛋白[10]。熱休克蛋白分為4個家族：HSP90家族(分子量為83～90 kDa)、HSP70家族(分子量為66～78 kDa)、HSP60家族以及小分子量的HSPs家族(12～43 kDa)。HSC70是HSP70家族中組成型的基因，主要參與蛋白質(zhì)的折疊、解折疊和組配[11]，并且能被外界刺激所誘導[12]。

目前對魚類HSPs的研究主要集中在分子克隆、組織表達方面，而涉及功能基因組學和HSPs表達變化的研究相對較少[13]。Airaksinen等[14]比較了斑馬魚(Danio rerio)在熱脅迫下的表達差異，發(fā)現(xiàn)在熱脅迫條件下，HSP70呈顯著升高。此外，國外一些科學家還進行了水域熱污染的研究，而我國對魚類HSPs的研究起步較晚，有關(guān)污染脅迫對魚體HSPs的影響研究較少。盛連喜等[15]發(fā)現(xiàn)鯉魚(Cyprinus carpio)HSP70的合成和溫度總體呈正相關(guān)關(guān)系。周鑫等[16]的研究表明，高濃度的亞硝酸鹽暴露后，草魚(Ctenopharyngodon idellus)HSP90的表達顯著上調(diào)。

環(huán)介導等溫擴增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)技術(shù)是Notomi等[17]建立的一種新穎的核酸擴增技術(shù)，具有高特異性、高效率、便捷等特點，在等溫條件下即可高效、快速地完成擴增反應(yīng)，可用于現(xiàn)場的快速檢測。自2000年開發(fā)以來，LAMP技術(shù)已廣泛應(yīng)用于細菌、病毒、寄生蟲等病原體的定性檢測及動物胚胎性別的鑒定[18-20]。本文將LAMP技術(shù)引入海洋環(huán)境監(jiān)測領(lǐng)域，研究不同濃度的重金屬Cd、Pb污染后褐菖鲉肝HSPs mRNA的表達量，從而為探索HSPs基因的生物功能以及其作為生物標志物監(jiān)測海洋重金屬污染的可行性研究提供依據(jù)。

1 材料與方法（Materials and methods）

1.1 儀器與試劑

主要儀器：凈化工作臺(SW-CJ-1FD，蘇州凈化設(shè)備工程有限公司)，恒溫金屬浴(CHB-A4-9602，杭州博日科技有限公司)，NanoDrop 2000 Spectrophotometer(Thermo Fisher公司)，LA-320C實時濁度儀(北京藍譜生物科技有限公司，精度±2%)，PCR儀(Bioer Serves Life公司)，5415R型冷凍離心機(Eppendorf公司)。

主要試劑：Bst DNA聚合酶(NEB公司)，瓊脂糖(西班牙Biowest公司)，MgCl2(Sigma公司)，betaine (Bio Basic公司)，SYBR Green qPCR Mix(廈門鷺隆生物科技有限公司)，dNTP和DS2000 DNA Marker (東盛生物公司)，Tris和EDTA(上海生物工程公司)，CdCl2和PbCl2均為國產(chǎn)分析純(Alfaaesar公司)。

1.2 實驗動物

褐菖鲉購自廈門市第八市場，平均體長(11.7± 1.2)cm，平均體重(24.79±5.8)g，雌雄不拘，先在清潔沙濾海水中暫養(yǎng)7 d，選取活力好的個體進行污染實驗。實驗過程中如有個體死亡，減少缸內(nèi)水量確保每只個體占據(jù)水體積2 L。

1.3 實驗方法

1.3.1 暴露實驗

實驗前，褐菖鲉先在清潔沙濾海水中暫養(yǎng)，馴養(yǎng)期間水溫嚴格控制在17～20℃，鹽度22‰～27‰，選取活力好的個體進行污染實驗。將褐菖鲉暴露于不同濃度重金屬(Cd、Pb)溶液中(實驗濃度見表1)。每濃度組10條魚，每組設(shè)2個平行，對照組50 L沙濾海水不含Cd、Pb。用充氣機連續(xù)進行充氣，并喂以人工餌料，每天采用靜態(tài)半置換法更新相應(yīng)濃度的含Cd、Pb海水溶液的50%。暴露5 d后取樣，將魚擊昏，迅速剖取肝臟，冰上采集后置于-80℃冰箱中保存至使用。

表1 污染物種類與濃度Table 1 Contaminant type and concentration

1.3.2 RNA提取及反轉(zhuǎn)錄

總RNA提取參照TaKaRa公司所提供的RNAiso Plus說明書進行，得到的RNA加入適量DEPC水使其濃度均為1000 ng·μL-1；反轉(zhuǎn)錄按照Thermo公司提供的ReverAid First Strand cDNA Synthesis Kit使用說明書進行，產(chǎn)物cDNA稀釋5倍，保存于-20℃冰箱待用。

1.3.3 LAMP引物設(shè)計

根據(jù)褐菖鲉HSP60基因(GeneBank序列號JX185808)、HSP70基因(GeneBank序列號JX185809)、HSP90基因(GeneBank序列號JX255674)和HSC70基因(GeneBank序列號JX255673)序列，利用在線引物設(shè)計軟件(http://primerexplorer.jp/elamp4.0.0/index.html)設(shè)計LAMP特異引物：FIP、BIP、F3和B3(表2)。

1.3.4 LAMP測定

LAMP反應(yīng)體系的設(shè)定參照Notomi等[17]的方法?？傮w積25 μL，經(jīng)優(yōu)化后體系內(nèi)各試劑含量為：0.4 mol·L-1Betaine，8 mmol·L-1Mg2+，1.4 mmol·L-1dNTPs，2.4 μmol·L-1內(nèi)引物，0.4 μmol·L-1外引物，1 ×ThermoPol Reaction Buffer，8 U Bst DNA聚合酶，2 μL模板DNA，5 μL dd H2O。反應(yīng)的溫度為64℃。反應(yīng)過程產(chǎn)生焦磷酸鎂乳白色沉淀的含量與DNA含量成正比，可利用濁度儀進行定量檢測。

表2 LAMP引物序列Table 2 Primers sequence of LAMP

LAMP標準曲線的測定：以F3和B3(表2)為引物進行PCR反應(yīng)，利用瓊脂糖凝膠電泳回收PCR產(chǎn)物，即可得到LAMP反應(yīng)的DNA標準品，利用NanoDrop 2000分光光度計測定其DNA濃度，根據(jù)公式計算拷貝數(shù)：

其中質(zhì)量，DNA標準品的質(zhì)量濃度，ng·μL-1；分子量，DNA標準品的平均分子量=堿基數(shù)×660道爾頓/堿基，g·mol-1；阿伏伽德羅常數(shù)，copies·mol-1。

10倍稀釋標準品，配制25 μL體系標準系列。利用LA-320C實時濁度儀測定。實時濁度儀每6 s自動測定一次濁度，以濁度達到0.1時作為陽性判定標準，記錄反應(yīng)所需時間。制作標準曲線。

Cd、Pb暴露5 d后，每個濃度組取6尾魚，解剖后取肝臟約0.1 g，提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄得到樣品cDNA。采用優(yōu)化后的LAMP反應(yīng)體系與反應(yīng)時間，用LA-320C實時濁度儀實時檢測。根據(jù)定量LAMP標準曲線換算得出樣品中HSPs(HSP60、HSP70、HSC70、HSP90)mRNA擴增拷貝數(shù)。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

LAMP檢測結(jié)果采用Microsoft Excel和SPSS 17.0軟件處理，采用單因素方差分析(One-Way ANOVA)，并用Origin 8.0軟件繪圖。所有結(jié)果均用6個平行樣的平均值±標準誤差表示，實驗組與對照組間數(shù)據(jù)的比較采用單尾t檢驗分析顯著性差異。P＜0.05為顯著差異；P＜0.01為極顯著差異。

2 結(jié)果（Results）

2.1 重金屬Cd、Pb影響HSP60基因表達的劑量-效應(yīng)關(guān)系

由圖1可見，Cd污染對褐菖鲉肝HSP60 mRNA含量基本無影響，雖然隨著Cd濃度的升高HSP60 mRNA含量有緩慢上升趨勢，但各組與對照組均無顯著性差異。Pb污染下褐菖鲉肝HSP60 mRNA含量僅在40 μg ·L-1濃度組時有顯著性抑制，約為對照組的0.05倍。其他濃度組與對照組之間無顯著性差異。

2.2 重金屬Cd、Pb影響HSP70基因表達的劑量-效應(yīng)關(guān)系

由圖2可見，8 μg·L-1Cd即可顯著誘導褐菖鲉肝HSP70 mRNA的表達，隨污染濃度增加，HSP70 mRNA含量也持續(xù)增加，在500 μg·L-1時達到最大值，為對照組的210.65倍。而8 μg·L-1Pb顯著抑制褐菖鲉肝HSP70 mRNA的表達，并在40 μg·L-1時達到最小值，為對照組的0.02倍，隨后逐漸恢復到對照水平。

圖1 Cd、Pb污染對褐菖鲉肝HSP60 mRNA表達量的影響

圖2 Cd、Pb污染對褐菖鲉肝HSP70 mRNA表達量的影響

2.3 重金屬Cd、Pb影響HSP90基因表達的劑量-效應(yīng)關(guān)系

由圖3可見，Cd污染對褐菖鲉肝HSP90 mRNA含量基本無影響，雖然隨著Cd濃度的升高HSP60 mRNA含量有緩慢上升趨勢，但各組與對照組均無顯著性差異。Pb污染下褐菖鲉肝HSP90 mRNA含量僅在40 μg·L-1濃度組時有顯著性抑制，為對照組的0.12倍，其他濃度組與對照組之間無顯著性差異。

2.4 重金屬Cd、Pb影響HSC70基因表達的劑量-效應(yīng)關(guān)系

由圖4可見，Cd對HSC70 mRNA表達量并無顯著影響，各濃度組與對照組相比總體呈上升趨勢，但均無顯著性差異。Pb污染下褐菖鲉肝HSC70 mRNA含量僅在40 μg·L-1濃度組時有顯著性抑制，約為對照組的0.05倍。其他濃度組與對照組之間無顯著性差異。

圖3 Cd、Pb污染對褐菖鲉肝HSP90 mRNA表達量的影響

圖4 Cd、Pb污染對褐菖鲉肝HSC70 mRNA表達量的影響

綜上所述，不同濃度Cd對褐菖鲉肝HSP60、HSP90、HSC70 mRNA的表達基本無顯著性影響，但可以顯著誘導HSP70 mRNA的表達，且誘導量隨著濃度的增加而增加，在500 μg·L-1時達到峰值。

不同濃度Pb影響褐菖鲉肝HSP60、HSP90、HSC70 mRNA的表達也不顯著，僅在40 μg·L-1組出現(xiàn)顯著性抑制，其他濃度組均無顯著性變化。HSP70 mRNA表達量在8～40 μg·L-1時顯著下降，而后逐漸回升，并在500 μg·L-1時恢復至對照組水平。

3 討論（Discussion）

LAMP技術(shù)已在病毒、細菌、寄生蟲等的定性檢測運用方面得到了較為廣泛的應(yīng)用，但在定量檢測方面的研究還較少?，F(xiàn)有的研究中對于HSPs的熱激響應(yīng)的研究較多，并有研究發(fā)現(xiàn)HSPs的表達量與溫度變化有很明顯的相關(guān)性，而在生物體抵御重金屬污染方面的研究卻較少[21]。在本研究中，將LAMP技術(shù)應(yīng)用于檢測海洋重金屬污染，從而定量檢測海洋中重金屬的污染情況。通過對Cd和Pb曝污后褐菖鲉肝臟中HSP60、HSP70、HSP90、HSC70基因的mRNA表達量進行檢測表明，在重金屬污染物暴露下，HSPs四種亞型基因?qū)?種污染物呈現(xiàn)不同趨勢的劑量效應(yīng)關(guān)系。

本文結(jié)果證實，Cd可以顯著誘導褐菖鲉肝HSP70 mRNA的表達，而HSP60、HSP90、HSC70 mRNA表達量在不同程度上也有所增加。這一結(jié)果與以往的許多研究結(jié)果相類似。例如，Cd能夠在短時間內(nèi)誘導虹鱒魚(Oncorhynchus mykiss)肝HSC70 mRNA的表達量的升高，但誘導并不顯著[22]。還有研究表明，Cd的滲透脅迫能夠在一定時間內(nèi)誘導輪蟲(rotifer)中HSP60 mRNA表達量升高[23]。Cd能夠誘導ROS的產(chǎn)生，而積累的ROS可迅速攻擊蛋白質(zhì)多肽鏈，尤其是其中的組氨酸、脯氨酸、精氨酸和賴氨酸，導致羰基基團的增加，而損傷或變性蛋白的積累又可進一步誘導HSPs基因的快速表達[24]。

但HSP70 mRNA的表達量不會無限增加，在達到峰值后表達水平將有所下降。相關(guān)研究表明，熱休克蛋白的表達對細胞的保護是有一定范圍的，它并不會無限制地持續(xù)增加[25]。雖然本研究中并未觀察到HSP70基因表達被抑制，若進一步增加污染物濃度或延長暴露時間，就有可能抑制HSP70基因的表達。

Pb污染后，HSPs四種基因?qū)b的反應(yīng)都表現(xiàn)為先抑制，然后再回復到對照組水平。這種蛋白表達水平波動變化的可能機制是，重金屬濃度較低時誘導細胞上調(diào)HSPs蛋白的保護性表達，然而在重金屬濃度持續(xù)升高的環(huán)境下，機體消耗的HSPs量也在不斷增加，結(jié)果導致了HSPs出現(xiàn)明顯的降低。這種表達量顯著降低的現(xiàn)象是生物體對前期積累產(chǎn)生的HSPs的一種消耗。類似的報道見于使用單倍或多倍劑量的阿司匹林會導致大鼠(Rattus norvegicus)胃組織中HSP90和相應(yīng)的mRNA逐漸降低，適應(yīng)后的胃臟中HSP90的表達量降低大約60%[26]。與之變化相類似的，500 μg·L-1的外源Pb即可顯著抑制蠶豆(Vicia fabaL.)幼苗葉片內(nèi)HSP60基因的表達[27]。HSPs被誘導表達是生物體克服不良環(huán)境和防止中毒的一種適應(yīng)性改變，而誘導量的下降則說明生物體可能因污染的毒性作用而產(chǎn)生了中毒反應(yīng)[28]。

本研究結(jié)果表明，與HSP60、HSP90、HSC70相比，HSP70對重金屬Cd、Pb污染響應(yīng)較為敏感，低濃度Cd即可顯著誘導，Pb則先抑制而后隨著濃度增加而升高。他人也有類似實驗結(jié)果。如Rajeshkumar等[29](2013)對印度Kaattuppalli島附近海域牛奶魚(Chanos chanos)的研究表明，重金屬Fe、Mn、Zn、Cu、Pb、Cd都會誘導HSP70的表達，其中以Fe的誘導最為明顯。重金屬Cd、Pb曝污能誘導淡水植物青萍(Lemna minor)中HSP70 mRNA表達量升高[30]，證實HSP70對重金屬污染有很好的敏感性，這些特性使得HSP70有望成為海洋重金屬污染的早期預警分子。但對海洋污染的監(jiān)測，不可能僅靠單一生物標志物，需要綜合分析單一和聯(lián)合暴露中多種生物標志物的表達情況。因此HSPs基因是否可用于海洋環(huán)境監(jiān)測，還需要更多的實驗研究。

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The Effects of Cd and Pb on the Levels of Hepatic HSPs mRNA in Sebastiscus marmoratus

Chen Ye1,Chen Rong1,*,Mo Zhengping1

State Key Laboratory of Marine Environmental Science,College of the Environment and Ecology,Xiamen University,Xiamen 361102, China

19 June 2015 accepted 17 September 2015

In order to understand the effects of heavy metal pollution on the gene expression of heat shock proteins (HSPs)in marine fish,Sebastiscus marmoratuswere exposed to different concentrations(i.e.,1.6,8,40,200,500 μg·L-1)of Cd or Pb for 5 days.A quantitative loop-mediated isothermal amplification(LAMP)method was used to analyze the hepatic mRNA levels of HSP60,HSP70,HSP90,and HSC70.Under the Pb exposure,the mRNA levels of hepatic HSP60,HSP90,HSC70 were not significantly reduced except in the 40 μg·L-1treatment,whereas the mRNA levels of HSP70 were significantly decreased by 8 μg·L-1Pb,and reached the minimum when Pb was 40 μg·L-1.Under the Cd exposure,the mRNA levels of hepatic HSP60,HSP90,HSC70 were not significantly affected;in contrast,mRNA levels of HSP70 were significantly increased and peaked at 500 μg·L-1Cd.In conclusion,the hepatic HSP70 was relatively more sensitive to heavy metal exposure than the other HSPs,and thus hadthe potential to be the early warning for heavy metal pollution in marine environment.

Cd;Pb;Sebastiscus marmoratus;liver;heat shock proteins;HSPs;loop-mediated isothermal amplification

2015-06-19 錄用日期：2015-09-17

1673-5897（2016）3-124-07

X171.5

A

10.7524/AJE.1673-5897.20150619001

簡介：陳榮(1974—)，男，環(huán)境科學博士，副教授，主要研究方向為海洋生態(tài)毒理學，發(fā)表學術(shù)論文30余篇。

海洋公益性項目"海洋污染生物效應(yīng)快速監(jiān)測與評價技術(shù)應(yīng)用示范"子任務(wù)-海洋污染效應(yīng)生物標志物技術(shù)集成與研發(fā)II (201005016)

陳曄(1991-)，女，碩士，研究方向為生態(tài)毒理學，E-mail:360321490@qq.com；

*通訊作者（Corresponding author），E-mail:chenrong@xmu.edu.cn