侯云，賈利興，段舜山

暨南大學水生生物研究中心，廣州510632

壬基酚在蛋白核小球藻和大型溞體內的富集與傳遞

侯云，賈利興，段舜山*

暨南大學水生生物研究中心，廣州510632

為探究壬基酚(nonylphenol,NP)在水生生物中的富集傳遞效應，選擇以蛋白核小球藻(Chlorella pyrenoidosa)和大型溞(Daphnia magna)為研究對象，開展蛋白核小球藻對NP的富集效應實驗，及NP在蛋白核小球藻和大型溞體內的傳遞效應實驗。研究結果表明，NP對蛋白核小球藻的96 h半數效應濃度(96 h-EC50)為3.13 mg·L-1，對蛋白核小球藻的生長和葉綠素含量的影響呈現明顯的劑量-時間效應。NP對大型溞的48 h半數效應濃度(48 h-LC50)為37.41 μg·L-1，屬于高毒類化合物。蛋白核小球藻暴露于0.05 mg·L-1NP 4 h后，其生物富集系數(BCF)為5 144.93，富集量為252.2 μg·g-1，在12 h內對NP的生物富集系數(BCF)最高達12 053.64，富集量為1 181.73 μg·g-1。以0.05 mg·L-1NP中暴露4 h后的蛋白核小球藻為餌料投喂大型溞7 d后，大型溞體內NP富集量最高達3.6 μg·g-1。0.05 mg·L-1NP直接暴露組大型溞暴露10 d后，大型溞體內NP富集量最高達4.02 μg·g-1。蛋白核小球藻對NP具有較強的富集能力，能夠通過攝食過程將NP傳遞到大型溞，經傳遞的NP能夠顯著抑制大型溞的生長、繁殖、攝食等生命活動。論文為評估NP在水生生態(tài)系統(tǒng)中的污染風險和富集傳遞效應提供了一定的參考依據。

壬基酚；蛋白核小球藻；大型溞；綜合毒性；富集傳遞效應

侯云,賈利興,段舜山.壬基酚在蛋白核小球藻和大型溞體內的富集與傳遞[J].生態(tài)毒理學報，2016,11(3):157-166

Hou Y,Jia L X,Duan S S.Bioaccumulation and transfer of nonylphenol inChlorella pyrenoidosaandDaphnia magna[J].Asian Journal of Ecotoxicology,2016,11(3):157-166(in Chinese)

壬基酚(nonylphenol,NP)為在水環(huán)境中廣泛存在的一種典型環(huán)境激素類物質，又稱壬基苯酚，是一種重要的中間體和精細化工原料[1]。據統(tǒng)計，全世界每年約有50萬t的NP進入水體或土壤。瑞士和加拿大城市生活污水處理廠處理后淤泥的檢測結果表明，每千克淤泥中NP含量可高達1 100 mg[2]。珠江三角洲地區(qū)作為改革開放的最前沿陣地，污染狀況也不容樂觀。據安太成等[3]報道，僅在過去的30年里，珠江口沉積物中NP的保守估計值為124 t。由此可見，NP在自然環(huán)境中分布廣泛，對水生生物和人類的健康具有潛在的威脅。NP對生物體具有較強的干擾效應，Staples等[4]研究表明，NP濃度超過44 μg·L-1時會對枝角類表現出顯著的胚胎毒性。Nice等[5]報道，NP對軟體動物、甲殼類、魚類等均表現出不同程度的內分泌干擾效應和生殖毒性。楊麗麗等[6]研究稱，NP能影響水生生物體內抗氧化相關酶的活性。

NP的親脂性特征及穩(wěn)定的化學結構使其存在較高的生物富集風險。微藻是水域生態(tài)系統(tǒng)中最主要的初級生產者，通過光合作用為浮游動物、底棲生物、魚類等提供氧氣和食物，是水域生態(tài)系統(tǒng)中物質循環(huán)和能量流動的主要環(huán)節(jié)，微藻的多樣性及初級生產力與水域生態(tài)系統(tǒng)結構的穩(wěn)定性息息相關[7]。浮游動物作為水域生態(tài)系統(tǒng)的初級消費者，以微藻為食，并為高營養(yǎng)級生物提供物質和能量，是水域生態(tài)系統(tǒng)食物網中的樞紐。因此，環(huán)境激素在微藻和浮游動物中的富集研究受到了一些研究人員的重視。Ahel等[1]研究發(fā)現，微藻對環(huán)境激素具有很強的富集作用，微藻的富集被認為是環(huán)境激素引入水域生態(tài)系統(tǒng)食物網的重要途徑之一。Zou等[8]研究表明，淡水團集剛毛藻(Cladophora glomerata)和一些底棲生物均能富集NP。Huang等[9]通過模擬水生生態(tài)系統(tǒng)研究環(huán)境激素多氯聯(lián)苯(PCBs)在微藻、蝦、蛤體內中的富集效應，發(fā)現多氯聯(lián)苯隨著食物鏈的傳遞具有明顯的生物放大現象。Ishihara等[10]報道了微藻與2種浮游動物混合培養(yǎng)構建的食物鏈能夠富集NP，培養(yǎng)基NP去除率可達到90%以上。目前，國內外有關研究主要關注NP對水生生物的急慢性毒性，雌激素效應等危害，但對NP在水生生物中的富集傳遞較少關注。

蛋白核小球藻(Chlorella pyrenoidosa)屬于綠藻門(Chlorophyta)，色球藻目(Chroococcales)，小球藻屬(Chlorella)，由于具有培養(yǎng)條件簡單、生長周期短、對毒物敏感等特點，被廣泛應用于評估環(huán)境污染物的毒性效應和生態(tài)風險，是海洋生態(tài)學、環(huán)境科學和生態(tài)毒理學研究領域的標準實驗藻種[7]。大型溞(Daphnia magna)屬于甲殼動物亞門(Crustacea)鰓足綱(Branchiopoda)，主要以微藻為食，是一種廣泛生活于自然水域的枝角類水生浮游動物。大型溞具有生活周期短、易于培養(yǎng)、繁殖快、對水環(huán)境中的多種化學物質的變化非常敏感等特性，并且身體透明，可在解剖鏡下觀察其生理狀況，因此是國際上通用的標準毒性試驗生物之一，廣泛應用于對污染物的生態(tài)毒理學研究[11]?；诖?，本研究以蛋白核小球藻、大型溞為研究對象，著重探究NP在水生生物中的富集和傳遞。研究結果能夠為揭示NP進入水生生態(tài)系統(tǒng)的過程和危害，科學評估生態(tài)系統(tǒng)中NP的長期生物學效應和污染風險提供一定的依據。

1 材料與方法（Materials and methods）

1.1 實驗藥品

壬基酚(C9H19C6H4OH)，分子量為220.36，色譜純，購于美國Sigma公司，保存于4℃冰箱中。二氯甲烷(CH2Cl2)和丙酮(CH3COCH3)，色譜純，購于上海安譜公司。

1.2 藻種的培養(yǎng)

蛋白核小球藻來自于暨南大學水生生物研究所藻種室。用BG-11培養(yǎng)基[12]保種，放入恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為：溫度(22±1)℃，光照強度60 μmol·m-2·s-1，光周期為12 L:12 D。試驗階段光照強度為80 μmol·m-2·s-1。定期鏡檢，確保藻種純正，無污染。

1.3 大型溞的培養(yǎng)

大型溞由香港科技大學提供，培養(yǎng)使用稀釋水培養(yǎng)基[13]。每天定時投喂蛋白核小球藻，培養(yǎng)溫度(22±1)℃，光照條件為自然光照。

1.4 實驗設計

1.4.1 NP對蛋白核小球藻的急性毒性研究

經預實驗分析得出丙酮的的無可觀察效應劑量濃度(no observed effect level,NOEL)為1%，以1%丙酮作為助溶劑配制NP溶液。實驗時設置6個組：0.1、0.2、0.4、0.8、1 mg·L-1和對照組(1%丙酮)，對照組為不添加NP的藻液。每組100 mL藻液，設置3個平行。光照強度為100 μmol·m-2·s-1，早晚搖勻藻液，取樣測量0、24、48、72、96 h的藻液OD值，并測量暴露96 h后藻細胞的葉綠素a含量。根據實驗數據，通過線性回歸分析計算NP對蛋白核小球藻的半效應濃度。

1.4.2 NP對大型溞的急性毒性研究

參照美國環(huán)保局標準方法(OECD)[14]，以1%丙酮作為助溶劑配制NP溶液，實驗時設置7個組：0.01、0.04、0.08、0.16、0.32、0.64 mg·L-1和對照組(1%丙酮)，對照組不添加NP。每個濃度設置3個平行，每支比色管中放入50 mL培養(yǎng)基和10只出生6 h～ 10 h的幼溞。實驗期間不飼喂餌料，不更換培養(yǎng)基，并于48 h之后觀察、記錄每管中溞的個體死亡數。根據實驗數據通過線性回歸分析計算出LC50。

1.4.3 NP對大型溞的慢性毒性研究

根據OECD標準方法，選取孤雌生殖的出生不超過6 h的幼溞進行試驗，NP濃度設置為0、0.1、1、5 μg·L-1，助溶劑丙酮最終體積1%以內。配制相應濃度的NP培養(yǎng)液并添加餌料微藻，控制餌料密度為1.3×105ind·mL-1～1.6×105ind·mL-1，實驗在25 mL玻璃管中進行，每管投放1只幼溞和20 mL培養(yǎng)液，每組10個平行，每天更換培養(yǎng)液并統(tǒng)計存活率和繁殖幼溞數。

1.4.4 NP在蛋白核小球藻中的富集

實驗共設5組，包括4個NP處理組，1個對照組(1%丙酮)，每組3個平行。接種對數期藻細胞到2 L培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至實驗所需的密度后，然后依次分裝100 mL到250 mL燒瓶中，NP處理組濃度據預實驗定為0.05、0.1、0.5、1 mg·L-1，對照組(1%丙酮)，對照組為不添加NP的藻液。在2、4、8、12、24 h時間點取樣使用高效液相色譜儀(1100，Agilent，USA)測定藻細胞內NP富集量。

1.4.5 NP在蛋白核小球藻和大型溞中的富集傳遞研究

實驗設置3個組，分為NP暴露藻液投喂組(投喂組)，NP直接暴露組(暴露組)，以及對照組(1%丙酮)，選取出生12 h內的大型溞進行試驗，用大燒杯裝400 mL的大型溞培養(yǎng)液，每400 mL中放入500只大型溞，一個大燒杯為一組，每組3個平行。NP暴露藻液投喂組：依據NP對大型溞的毒性研究和預實驗結果，綜合考慮大型溞對NP的耐受性，選取經0.05 mg·L-1NP處理4 h后的蛋白核小球藻藻液作為大型溞餌料，離心后定時投喂，投喂密度約為1.3×105ind·mL-1。NP直接暴露組：加入NP標準液，使培養(yǎng)液中NP濃度為0.05 mg·L-1，定時投喂未經暴露的蛋白核小球藻藻液，投喂密度與投喂組相同。對照組(1%丙酮)：大型溞培養(yǎng)液和餌料中均不含NP。在第3、5、7、10、15天，用篩網撈取30只大型溞，使用高效液相色譜儀(1100，Agilent，USA)測定大型溞的NP富集量。同時，取樣40 mL培養(yǎng)液，混勻后測定葉綠素a值，用于計算大型溞的攝食率。

1.4.6 觀測指標和測量方法

藻細胞密度：每隔24 h取藻液2 mL，在光學顯微鏡(CX-41，Olympus，Japan)下用血球計數板(3100，Hausser scientific，USA)進行計數，然后轉化為藻細胞密度，繪制藻類生長曲線，以藻細胞密度的變化反映藻細胞的生長情況。

葉綠素a含量的測定：采用葉綠素熒光儀(TD-700,TURANER DESIGNS,USA)測定，測定前遮光處理10 min。

蛋白核小球藻的生物富集系數BCF(bioconcentration factors)：參考Liu等[15]的研究，計算公式為BCF=Cc/(Ci/1020)，Cc為藻細胞富集壬基酚的量(mg·g-1，干重)；Ci為培養(yǎng)基中初始NP濃度(mg· L-1)，1020為溶液密度(g·L-1)。

大型溞存活率：通過計數大型溞死亡個體數來計算其存活率。

NP積累量：使用高效液相色譜儀(1100，Agilent，USA)測定。測量方法參考Correa-Reyes等[16]的研究。蛋白核小球藻的NP富集量以每克濕藻細胞所富集NP的微克數(μg·g-1，鮮重)表示。大型溞的NP富集量以每克大型溞所富集NP的微克數(μg ·g-1，鮮重)表示。

大型溞體長：測量大型溞從頭盔到殼刺部的長度。

大型溞的凈生殖率(R0)，平均世代歷期(T)，內稟增長率(r)：計算方法參考Dokster等[17]的研究，R0=∑lxmx；T=∑xlxmx/∑lxmx；r=lnR0/T，其中：x為日齡，lx為x齡的存活率，m為x齡的生殖數，r為內稟增長率。

大型溞攝食率：計算方法參考Wacke等[18]的研究。

1.4.7 數據處理和分析

實驗數據采用Excel 2003(Mcrosoft Inc.)整理和繪圖，相同時間不同處理組之間差異性檢驗使用SPSS軟件(SPSS Inc.)進行單因素方差分析(One-way ANOVA)和LSD多重比對，差異顯著性水平為P<0.05。

2 結果（Results）

2.1 NP對蛋白核小球藻的急性毒性研究

2.1.1 NP對蛋白核小球藻的半數效應濃度96 h-EC50

NP對蛋白核小球藻的96 h-EC50為3.13 mg·L-1，回歸方程為y=0.811x+0.76718，R2=0.989，根據水生生物毒性評價和分級[19]，NP屬于高毒類有機化合物。

2.1.2 NP對蛋白核小球藻生長的影響

如圖1所示，蛋白核小球藻在0 h～48 h內藻密度增加22.1%～101.7%，生長迅速。48 h～96 h，低濃度NP暴露組(0.05 mg·L-1，0.1 mg·L-1)和對照組的藻密度仍逐漸升高，高濃度NP暴露組(0.5 mg· L-1，1 mg·L-1)的藻密度與對照組相比顯著降低(P< 0.05)。說明高濃度NP對蛋白核小球藻的生長具有較強的抑制作用，鏡檢后發(fā)現細胞形態(tài)發(fā)生變化，部分細胞葉綠素解體，顏色發(fā)黃。

2.1.3 NP對蛋白核小球藻葉綠素含量的影響

蛋白核小球藻暴露于含有NP的培養(yǎng)液中96 h后，其藻細胞中葉綠素a含量變化如圖2所示，低濃度NP暴露組(0.05 mg·L-1，0.1 mg·L-1)的葉綠素a含量與對照組相比差異不顯著(P>0.05)，高濃度暴露組(0.5 mg·L-1，1 mg·L-1)的葉綠素a含量與對照組相比顯著下降(P<0.05)。0.5 mg·L-1NP處理組綠素a含量與對照組相比下降8.5%，1 mg·L-1NP處理組綠素a含量與對照組相比下降23.6%。

圖1 壬基酚對蛋白核小球藻生長的影響

圖2 壬基酚對蛋白核小球藻的葉綠素a含量的影響

2.2 NP對大型溞的急性毒性研究

NP對大型溞的48 h半數效應濃度48 h-LC50為37.4 μg·L-1，回歸方程為y=226.5x-306.1，R2= 0.997。按照水生生物毒性評價和分級[19]，NP對大型溞的急性毒性屬于極高毒。

2.3 NP對大型溞的慢性毒性研究

由表1可知，隨著NP暴露濃度的增加，大型溞的世代周期逐漸縮短，0.5 mg·L-1和1 mg·L-1NP暴露組大型溞的世代周期與對照組相比，縮短1 d～2 d，差異顯著(P<0.05)。同時，NP對大型溞的凈增殖率產生較強的抑制作用，對照組大型溞的凈增殖率為6.3%，0.5 mg·L-1和1 mg·L-1壬基酚暴露組大型溞的凈增殖率分別為2.3%和0.4%，與對照組相比差異顯著(P<0.05)。隨著NP濃度的遞增，大型溞的體長逐漸減小。尤其是1 mg·L-1NP暴露組，體長僅為2.52 mm，與對照組相比，呈現顯著性差異(P<0.05)。

大型溞種群內稟增長率是大型溞種群在最適條件下的最大瞬時增長率，是其種群增殖能力的一個綜合指標。如圖3所示，內稟增長率隨著NP濃度增加呈現低濃度(0.05 mg·L-1，0.1 mg·L-1)上升，高濃度(0.5 mg·L-1，1 mg·L-1)下降的趨勢，NP濃度為0.1 mg·L-1時，大型溞種群的內稟增長率最大，為0.235%。NP濃度為1 mg·L-1時，大型溞種群的內稟增長率為0.05%。

圖3 壬基酚對大型溞內稟增長率的影響

圖4 壬基酚在蛋白核小球藻中的生物富集系數

圖5 壬基酚在蛋白核小球藻中的富集量

表1 壬基酚對大型溞生長生殖狀況的影響Table 1 The growth and reproductive effects of different concentrations of NP toDaphina magna

圖6 大型溞體內的壬基酚富集量

2.4 NP在蛋白核小球藻中的富集效應研究

由圖4和圖5可知，蛋白核小球藻對NP具有極強的富集作用，低濃度NP暴露組(0.05 mg·L-1，0.1 mg·L-1)在2 h～12 h期間，生物富集系數(BCF)逐漸增大，暴露4 h后，BCF分別為5 144.93、7 387.9，4 h時藻細胞的富集量分別為252.2 μg·g-1、724.31 μg·g-1。在12 h時BCF達到最大，分別為8 343.03，12 053.64，富集量分別為408.97 μg·g-1、1 181.73μg·g-1。12 h～24 h，BCF開始下降，可能的原因是生物降解作用的增強。24 h時，BCF分別為5 604.18、6 971.94，與12 h的BCF相比，分別下降32.8%和42.2%。富集量分別為274.71 μg·g-1、683.52 μg·g-1。高濃度NP暴露組(0.5 mg·L-1，1 mg ·L-1)，在2 h～12 h，BCF逐漸增大，12 h達到最大，分別為1 614.03、953.44。富集量分別為791.19 μg· g-1和934.75 μg·g-1。12 h～24 h，BCF隨著暴露濃度增加而減小，原因可能是NP濃度較大，更大程度地抑制了藻細胞的生長。

2.5 NP在蛋白核小球藻和大型溞中的富集傳遞效應研究

2.5.1 NP在大型溞中的富集量

NP在大型溞中的富集量變化如圖6所示，根據預實驗，考慮大型溞對NP的耐受性，選取經0.05 mg·L-1NP暴露4 h后的蛋白核小球藻藻液作為餌料投喂大型溞(投喂組)，在投喂7 d后，NP富集量最大，為3.6 μg·g-1。3 d～7 d，富集量逐漸升高，7 d～ 15 d，富集量逐漸降低。可能的原因是，從第7天開始，一方面，大型溞對NP產生抗性和分解作用，另一方面，大型溞逐漸死亡，數目逐漸減少。NP直接暴露組大型溞(暴露組)，在暴露10 d后，體內NP富集量最大，為4.02 μg·g-1。

圖7 壬基酚對大型溞存活率的影響

圖8 壬基酚對大型溞攝食率的影響

2.5.2 NP對大型溞存活率的影響

NP暴露后的蛋白核小球藻投喂組大型溞存活率如圖7所示，1 d時的存活率為80%，15 d時的存活率僅為6.67%，對照組15 d時的存活率為20%，與對照組相比顯著下降(P<0.05)。NP直接暴露組大型溞存活率1 d時的存活率為96.7%，15 d時的存活率僅為3.33%，與對照組相比顯著下降(P<0.05)。

2.5.3 NP對大型溞攝食率的影響

大型溞攝食率如圖8所示，與對照組相比，隨著投喂時間的增加，大型溞攝食率顯著下降(P< 0.05)。1 d時，處理組的攝食率為2.42×104cells·h-1· ind-1，15 d時的攝食率為1.8×103cells·h-1·ind-1，遠小于對照組15 d時的攝食率7.7×103cells·h-1· ind-1。NP直接暴露組大型溞隨著暴露時間的延長，攝食率顯著降低(P<0.05)，1 d時，處理組的攝食率為2.26×104cells·h-1·ind-1，15 d時攝食率只有1.9× 103cells·h-1·ind-1，遠小于對照組攝食率。

3 討論（Discussion）

3.1 NP對蛋白核小球藻生長的影響

近年來，環(huán)境激素污染問題日益嚴重，對水生態(tài)系統(tǒng)造成嚴重危害。微藻是最主要的初級生產者，在水生食物鏈起到關鍵性的作用，研究微藻對外源污染物的響應，有助于評估污染物對整個食物鏈和水生生態(tài)系統(tǒng)的危害[20]。半數效應濃度EC50是評價污染物對水環(huán)境生態(tài)風險的基本參數，本實驗中，NP對蛋白核小球藻的96 h-EC50為3.13 mg·L-1，屬于高毒類有機化合物。部分學者進行過類似研究，劉霞等[21]研究表明，NP對中肋骨條藻(Skeletonema costatum)和旋鏈角毛藻(Chaetoceros curvisetus)的96 h-EC50分別為0.13 mg·L-1和0.22 mg·L-1。本研究中，蛋白核小球藻對NP具有較好的耐受性。微藻細胞密度和葉綠素含量是表征微藻生長狀況的重要指標[22]。本文研究表明，低濃度NP對蛋白核小球藻的生長呈現先抑制后促進的規(guī)律。這與聶湘平等[7]關于多氯聯(lián)苯對斜生柵藻(Scendesmus obliquus)生長影響的研究結果類似?？赡艿脑蚴菍嶒炛械鞍缀诵∏蛟鍖P的耐受性逐漸增強，生長和新陳代謝使藻細胞內的NP含量逐漸降低，從而呈現先抑制后促進的現象[23]。在高濃度NP處理組中，藻細胞密度逐漸減小，與對照組相比，葉綠素a含量顯著下降(P<0.05)?？赡艿脑蛞环矫媸牵琋P抑制了微藻體內相關酶的活性，從而抑制了微藻的新陳代謝和生長[24]。另一方面，NP通過抑制藻細胞內葉綠素a的合成，導致其生長和光合作用的抑制[25]。

3.2 NP對大型溞的急慢性干擾效應

大型溞屬于浮游甲殼類動物，廣泛地用于水生生物毒理試驗[26]。本實驗結果表明，NP對大型溞48 h-LC50為37.4 μg·L-1。郭匿春等[27]研究表明，NP對隆線溞(Daphnia carinata)和微型裸腹溞(Moina micrura)的48 h-LC50分別為126 μg·L-1和159 μg·L-1。大型溞對NP較為敏感，是很好的NP污染指示種。NP對大型溞的生長和繁殖均具有較強的慢性干擾效應，本實驗中，NP對大型溞凈生殖率的影響表現為雙效應曲線關系，李娜等[28]和邵蕾等[29]關于環(huán)境激素對浮游動物繁殖能力的影響研究也得到類似結果。低濃度的NP具有輕微刺激大型溞繁殖的作用，這可能與NP具有類雌性激素效應有關[30-31]。本實驗中，受高濃度NP的影響，大型溞齡期間隔延長，蛻皮次數減少，導致其平均體長明顯縮短，這與Nebeker等[32]和郭匿春等[27]的研究結果一致。內稟增長率是衡量種群增殖能力的一個重要指標[33]。本實驗中，隨著NP濃度的增大，內稟增長率逐漸減小。Leblanc等[34]和Hense等[35]研究表明，NP能夠對大型溞的生物代謝產生干擾作用，使大型溞體內代謝產物的清除速率發(fā)生變化，引起上游代謝產物的積累。這些大型溞在NP作用下產生的生理變化可能是內稟增長率發(fā)生改變的主要原因。

3.3 NP在蛋白核小球藻中的富集效應研究

微藻作為初級生產者，是淡水生態(tài)系統(tǒng)中重要的組成部分。有研究報道，微藻在污水處理應用過程中發(fā)揮著重要的作用，不僅能夠富集污水中的重金屬離子等無機物，而且能夠富集有機污染物，如壬基酚、辛基酚等[36]。Reyes等[37]研究表明，球等鞭金藻(Isochrysis galbana)具有很強的富集NP的能力，1 h內將0.1 mg·L-1的NP全部吸收。Gao等[38]研究表明，4種典型微藻在12 h內對1 mg·L-1NP的富集效率可達70%。本文研究發(fā)現，蛋白核小球藻在12 h內對NP的生物富集系數(BCF)最高達12 053.64，富集量為1 181.73 μg·g-1，對NP具有較強的富集能力。李金娟等[39]研究表明，微藻對有機污染物的生物富集系數主要由污染物本身的疏水性和其辛醇-水分配系數決定。本實驗初期(2 h～12 h)，NP疏水性大，在培養(yǎng)基中更易進入藻細胞，水相中NP含量逐漸減小，因而生物富集系數逐漸增大。本實驗后期(12 h～24 h)，蛋白核小球藻對NP的生物富集系數趨于平衡，而在24 h時出現減小趨勢。Fogg等[40]研究表明在生長后期和營養(yǎng)條件缺乏的情況下，微藻會不斷向周圍環(huán)境釋放代謝產物，增加了水環(huán)境中溶解性有機碳(DOC)的含量。Sijm等[41]研究發(fā)現水環(huán)境中溶解性有機碳(DOC)的存在增大了疏水性化合物的水溶解度。本實驗后期，蛋白核小球藻對NP的生物富集系數減小，可能的原因是微藻釋放到培養(yǎng)基中的溶解性有機碳(DOC)干擾了NP在藻細胞和水相中的分配，增加了NP在水中的溶解度。

3.4 NP在蛋白核小球藻和大型溞中的富集傳遞效應研究

針對各地湖泊和水庫等水環(huán)境中各營養(yǎng)級生物的調查結果顯示，污染物的生物富集和食物鏈傳遞在水域生態(tài)系統(tǒng)中普遍存在[42]。Rasmussen等[43]發(fā)現多氯聯(lián)苯能夠通過的微藻-大型溞-魚食物鏈進行傳遞。Rioboo等[44]報道，經去草凈(terbutryn)暴露后的普通小球藻(Chlorella vulgaris)投喂臂尾輪蟲(Brachionus)，能夠顯著影響臂尾輪蟲的存活，攝食，生長和繁殖。微藻對許多污染物都具有很強的富集能力，大型溞主要以微藻為食物來源，是淡水生態(tài)系統(tǒng)中重要的初級消費者之一[45-46]。本文研究發(fā)現，蛋白核小球藻對NP的富集能力較強，并能夠通過攝食過程將NP傳遞到大型溞。同時，大型溞也能從水環(huán)境中富集少量NP。這與Juei等[47]關于高濃度的多氯聯(lián)苯經食物鏈從浮游植物傳遞到水生動物的研究結論一致。污染物的生物累積程度取決于多種因素，如：污染物的濃度，消費者對有毒餌料的攝食率和吸收率，消費者對毒物的排泄、代謝能力和生理狀態(tài)；此外環(huán)境因素的影響也十分重要，如溫度、水質和與污染物的接觸時間等都可能影響消費者對污染物的富集量[48]。本實驗中，蛋白核小球藻富集的NP含量顯著高于大型溞體內的NP含量，且經蛋白核小球藻傳遞到大型溞的NP對大型溞的存活率和攝食率產生了顯著的抑制作用。這與Reyes等[37]關于NP在球等鞭金藻和鹵蟲(Artemia)中的富集研究和孫紅文等[49]關于三苯基錫和三丁基錫對大型溞的毒性作用研究結果類似?？赡艿脑蛞环矫媸谴笮蜏袛z食率受到NP的抑制，對餌料微藻具有選擇性，一定程度上排斥攝取有毒餌料微藻，導致大型溞體內NP含量較低。Mohamed等[50]也報道了水蚤(Daphnia)對有毒藍藻銅綠微囊藻(Microcystis aeruginosa)的選擇性攝食作用。另一方面是由于大型溞對污染物具有顯著的排泄能力、代謝能力和恢復機制[51]。本實驗中NP暴露后的蛋白核小球藻投喂組大型溞在7 d～15 d內富集的NP含量顯著下降，也證明了上述觀點。本文研究結果對于評估NP的生態(tài)風險及其在水生生物中的富集和傳遞效應提供了一定的參考依據。

（References）：

[1] Ahel M,Giger W,Schaffner C.Behaviour of alkylphenol polyethoxylate surfactants in the aquatic environment-II. Occurrence and transformation in rivers[J].Water Re-search,1994,28(5):1143-1152

[2] 范奇元,金泰,將學之,等.我國部分地區(qū)環(huán)境中壬基酚的檢測[J].中國公共衛(wèi)生,2002,18(11):1372-1373

Fan Q Y,Jin T,Jiang X Z,et al.Detection of nonylphenol in some regions of China[J].China Public Health,2002, 18(11):1372-1373(in Chinese)

[3] 安太成,陳嘉鑫,傅家謨,等.珠三角地區(qū)POPs農藥的污染現狀及控制對策[J].生態(tài)環(huán)境,2005,14(6):981-986

An T C,Chen J X,Fu J M,et al.The pollution situation and control strategy of persistent organic pollutants in the Pearl River Delta,China[J].Ecology and Environment, 2005,14(6):981-986(in Chinese)

[4] Staples C A,Weeks J,Hall J F,et al.Evaluation of aquatic toxicity and bioaccumulation of C8and C9-alkylph enolethoxylates[J].Environmental Toxicology and Chemistry, 1998,17(12):2470-2480

[5] Nice H E,Morrit D,Crane M,et al.Long-term and transgenerational effects of nonylphenol exposure at a key stage in the development ofCrassostrea gigas,possible endocrine disruption[J].Marine Ecology Progress Series, 2003,256(1):293-300

[6] 楊麗麗,方展強.雌二醇,壬基酚,多氯聯(lián)苯,鎘和鋅暴露對唐魚體內超氧化物歧化酶活性的影響[J].中國實驗動物學報,2012,20(1):38-46

Yang L L,Fang Z Q.Effects of estradiol,nonylphenol, polychlorinated biphenyls,cadmium and zinc on the activity of superoxide dismutase inTanichthys albonubes[J]. Acta Laboratorium Animalis Scientia Sinica,2012,20(1): 38-46(in Chinese)

[7] 聶湘平,藍崇宇,林里,等.多氯聯(lián)苯對蛋白核小球藻和斜生柵藻生長影響的研究[J].中山大學學報：自然科學版,2002,41(1):66-71

Nie X P,Lan C Y,Lin L,et al.The effects of aroclor1254 on the growth ofChlorella pyrenoidosaandScenedesmus obliquus[J].Acta Scientiarum Naturalium Aturalium Universitatis Sunyatseni,2002,41(1):66-71(in Chinese)

[8] Zou E.Current status of environmental endocrine disruption in selected aquatic invertebrates[J].Acta Zoologica Sinica,2003,49(5):551-565

[9] Huang S F,Li Z Y,Wang X Q,et al.Cerium caused life span shortening and oxidative stress resistance inDrosophila melanogaster[J].Ecotoxicology and Environmental Safety,2010,73(1):89-93

[10] Ishihara K,Nakajima N.Improvement of marine environmental pollution using eco-system:Decomposition and recovery of endocrine disrupting chemicals by marine phyto-and zooplanktons[J].Journal of Molecular Catalysis B, 2003,23(s2-6):419-424

[11] 葉偉紅,劉維屏.大型溞毒理試驗應用與研究進展[J].環(huán)境污染治理技術與設備,2004,5(4):4-7

Ye W H,Liu W P.Application and study progress of toxicity test ofDaphnia magna[J].Techniques and Equipment Environment Pollution Control,2004,5(4):4-7(in Chinese)

[12] 蔡卓平,段舜山,朱紅惠.3種典型海洋微藻的細胞增殖特性研究[J].廣東藥學院學報,2012,28(4):392-395

Cai Z P，Duan S S，Zhu H H.Cell proliferation characteristics of three typical marine microalgae[J].Journal of Guangdong Pharmaceutical University,2012,28(4):392-395(in Chinese)

[13] 胡雪雷,周靜韻,段舜山.壬基酚與壬基酚聚氧乙烯醚對多刺裸腹溞的復合毒性效應[J].生態(tài)環(huán)境學報, 2011,20(11):1725-1730

Hu X L，Zhou J Y，Duan S S.Synergistic toxic effects of nonylphenol and nonylphenol ethoxylate onMoina macrocopa[J].Ecology and Environmental Sciences,2011,20 (11):1725-1730(in Chinese)

[14] OECD.Standard number No.TG 211.Daphnia magnareproduction test[S].Paris:OECD 1998

[15] Liu Y,Guan Y T,Gao Q T,et al.Cellular responses,biodegradation and bioaccumulation of endocrine disrupting chemicals in marine diatomNavicula incerta[J].Chemosphere,2010,80(5):592-599

[16] Correa-Reyes G,Viana M T,Marquez-Rocha F J,et al. Nonylphenol algal bioaccumulation and its effect through the trophic chain[J].Chemosphere,2007,68(4):662-670

[17] Dokster A,Vijvetherg J.The effect of food and temperature regimes on life-history responses to fish kairomones inDaphnia hyaline-galeata[J].Hydrobiology,2001,442 (1):207-214

[18] Wacker A,Elert E V.Polyunsaturated fatty acids:Evidence for non-substitutable biochemical resources in Daphnia geleala[J].Ecology,2001,82(9):507-520

[19] 國家環(huán)保局《水生生物監(jiān)測手冊》編委會.水生生物監(jiān)測手冊[M].南京:東南大學出版社,1993:192-202

[20] 田斐,何寧,段舜山.三種環(huán)境激素對四種藻的急海洋微性毒性效應研究[J].生態(tài)科學,2013,32(4):401-407

Tian F,He N,Duan S S.Acute toxic effects of environmental hormones on marine microalgae[J].Ecological Science,2013,32(4):401-407(in Chinese)

[21] 劉霞,趙靜,但麗霞,等.壬基酚對膠州灣典型微藻的毒性效應[J].海洋環(huán)境科學,2012,31(5):667-673

Liu X,Zhao J,Dan L X,et al.Toxic effects of nonylphenol on dominant microalgae species in Jiaozhou Bay[J]. Marine Environmental Science,2012,31(5):667-673(inChinese)

[22] 荊國華,卓靜,李小林,等.表面活性劑CTAC和STAB對四尾柵藻的毒性效應[J].生態(tài)學雜志,2010,29(8): 1573-1577

Jing G H,Zhuo J,Li X L,et al.Toxic effects of surfactants CTAC and STAB on Scenedesmus quadricauda[J]. Chinese Journal of Ecology,2010,29(8):1573-1577(in Chinese)

[23] 沈宏,周培疆.環(huán)境有機污染物對藻類生長作用的研究進展[J].水生生物學報,2002,26(5):529-535

Shen H,Zhou P J.Advance in the studies on effect of environmental organic pollutants on the algae growth[J]. Acta Hydrobiologica Sinica,2002,26(5):529-535(in Chinese)

[24] 王莉,唐麗雅,魏晨曦,等.鄰苯二甲酸二(2-乙基)己酯對斜生柵藻的生態(tài)毒性作用[J].生態(tài)毒理學報,2009,4 (3):452-456

Wang L,Tang L Y,Wei C X,et al.Ecological toxicity of di-(2-ethylhexyl)phthalate onScenedesmus obliquus[J]. Asian Journal of Ecotoxicology,2009,4(3):452-456(in Chinese)

[25] 沈國光,嚴國安,余新,等.奈及其衍生物對普通小球藻的毒性效應[J].水生生物學報,1999,23(5):460-468

Shen G X,Yan G X,Yu X,et al.The toxic effects of naphthalene and its derivants onChlorella vulgaris[J]. Acta Hydrobiologica Sinica,1999,23(5):460-468(in Chinese)

[26] Sarma S,Nandini S,Gulati R D.Life history strategies of cladocerans:Comparisons of tropical and temperate taxa [J].Hydrobiologia,2005,542(1):315-333

[27] 郭匿春,謝平.雙酚A和壬基酚對隆線溞和微型裸腹溞的毒性[J].水生生物學報,2009,33(3):492-497

Guo N C,Xie P.The toxic effects of BPA and NP onD. carinataandM.micrura[J].Acta Hydrobiologica Sinica, 2009,33(3):492-497(in Chinese)

[28] 李娜,聶湘平,黎華壽,等.多氯聯(lián)苯(PCB153與PCB28)對大型溞的毒性效應研究[J].農業(yè)環(huán)境科學學報,2012,31(5):891-897

Li N,Nie X P,Li H S,et al.Toxicity effects of PCB153 and PCB28 onDaphnia magna[J].Journal of Agro-Environment Science,2012,31(5):891-897(in Chinese)

[29] 邵蕾,黃建國,袁玲.重金屬鎘對三種水溞繁殖能力的影響[J].西南大學學報：自然科學版,2010,32(3):102-106

Shao L,Huang J G,Yuan L.The effect of cadmium on reproductive ability of three species ofDaphnia[J].Journal of Southwest University:Natural Science Edition, 2010,32(13):102-106(in Chinese)

[30] Nikula H,Talonpoika T,Kaleva M,et al.Inhibition of HCG-stimulated steroidogenesis in cultured mouse Leydig tumor cells by bisphenol A and octylphenols[J].Toxicology and Applied Pharmacology,1999,157(3):166-173

[31] Barata C,Barid D J,Soaers A M,et al.Biochemical factors contributing toxicity difference among resistant and sensitive clones ofDaphnia magnato ethyl parathion[J]. Ecotoxicology and Environmental Safety,2001,49(2): 155-163

[32] Nebeker A V,Puglisi F A,DeFoe D L.Effects of polychlorinated biphenyl compounds on survival and reproduction of the fathead minnow and flagfish[J].Transactions of American Fisheries Society,1974,103(3):562-568

[33] Barry M J.Endosulfan-enhanced crest induction inDaphnia longicephala:Evidence of cholinergic innervation of kairomone receptors[J].Joumal of Lankton Research, 1998,20(7):1219-1231

[34] Leblanc G A,Rider C,Kast-Hutcheson K,et al.Development toxicity of testosterone and chemicals that inhibitsteroid clearance in daphnids:The elusive mechanism[C]. SETAC 20th Annual Meeting,Philaldelphia,P A,November14-18,1999

[35] Hense B A,Jttner I,Welzl G,et al.Effects of 4-nonylphenolon phytoplankton and periphyton in aquatic microcosms[J].Environmental Toxicology and Chemistry,2003, 22(11):2727-2732

[36] Zhou G J,Peng F Q,Zhang L J,et al.Biosorption of zinc and copper from aqueous solutions by two freshwater green microalgaeChlorella pyrenoidosaandScenedesmus obliquus[J].Environmental Science and Pollution Research,2012,19(7):2918-2929

[37] Reyes G C,Viana M T,Rocha F J M,et al.Nonylphenol algal bioaccumulation and its effect through the trophic chain[J].Chemosphere,2007,68(4):662-670

[38] Gao Q T,Wong Y S,Tam N F Y.Removal and biodegradation of nonylphenol by differentChlorellaspecies[J]. Marine Pollution Bulletin,2011,63(s5-12):445-451

[39] 李金娟.天然水體中普通小球藻對酞酸酯的富集與降解特性[D].天津：天津大學,2006

Li J J.Accumulation and biodegradation of phthalate acid esters byChlorella vulgarisin aqueous environment[D]. Tianjin:Tianjin University,2006(in Chinese)

[40] Fogg G E.Nitrogen nutrition and metabolic patterns in algae[J].Symposia of the Society for Experimental Biology,1959,13:106-125

[41] Sijm D T H M,Middelkoop J,Vrisekoop K.Algal density-dependent bioconcentrationfactorsofhydrophobicchemicals[J].Chemosphere,1995,31(9):4001-4012

[42] Hense B A,Welzl G,Severin G F,et al.Nonylphenol induced changes in trophic web structure of plankton analysed by multivariate statistical approaches[J].Aquatic Toxicology,2005,73(2):190-209

[43] Rasmussen J B,Rowan D J,Lean D R S,et al.Food chain structure in Ontario lakes determines PCB levels in lake trout(Salvelinus namaycush)and other pelagic fish [J].Canadian Journal of Fisheries Aquatic Science,1990, 47(10):2030-2038

[44] Rioboo C,Prado R,Herrero C,et al.Population growth study of the rotiferBrachionussp.fed with triazine-exposed microalgae[J].Aquatic Toxicology,2007,83(4): 247-253

[45] 段菁春,陳兵,麥碧嫻,等.洪季珠江三角洲水系烷基酚污染狀況研究[J].環(huán)境科學,2004,25(3):48-52

Duan J C,Chen B,Mai B X,et al.Survey of alkylphenols in aquatic environment of Zhujiang Delta[J].Environmental Science,2004,25(3):48-52(in Chinese)

[46] 高文寶,朱琳,孫紅文,等.大型溞對柵藻攝食行為及影響因素的研究[J].農業(yè)環(huán)境科學學報,2006,25(4): 1041-1044

Gao W B,Zhu L,Sun H W,et al.Grazing behavior and influencing factors ofDaphnia magnaonScenedesmus [J].Journal of Agro-Environment Science,2006,25(4): 1041-1044(in Chinese)

[47] Juei S W,Hong N C,Jin J F,et al.Uptake and transfer of high PCBs concentrarions from phytoplankton to aquatic biota[J].Chemosphere,1998,26(6):1201-1210

[48] Yokoyama A,Park H.Mechanism and prediction for contamination of freshwater bivalves(Unionidae)with the cyanobacterial toxin microcystin in hypereutrophic Lake Suwa[J].Japanese Journal Environmental Toxicology, 2002,17(5):424-433

[49] 孫紅文,黃國蘭,李書霞,等.三苯基錫和三丁基錫對大型溞(Daphnia magna)的毒性作用研究[J].環(huán)境化學, 2000,19(3):235-239

Sun H W,Huang G L,Li S X,et al.Study on toxic effects of triphenyltin and tributyltin onDaphnia magna [J].Environmental Chemistry,2000,19(3):235-239(in Chinese)

[50] Mohamed Z A.Accumulation of cyanobacterial hepatotoxins by daphnia in some Egyptian irrigation canals[J].Ecotoxicology and Environmental Safety,2001,50(1):4-8

[51] DeMott W R,Zhang Q X,Carmichael W W.Effects of toxic cyanobacteria and purified toxins on the survival and feeding of a copepod and three species of daphnia[J].Limnology and Oceanography,1991,36(7):1346-1357◆

Bioaccumulation and Transfer of Nonylphenol in Chlorella pyrenoidosa and Daphnia magna

Hou Yun,Jia Lixing,Duan Shunshan*

Institute of Hydrobiology,Jinan University,Guangzhou 510632,China

28 January 2016 accepted 3 April 2016

Nonylphenol(NP)is a typical environmental endocrine disruptor.Its bioaccumulation and transfer in the freshwater green algaeChlorella pyrenoidosaand the freshwater cladoceranDaphnia magnawere investigated in this study.The results show that the 96 h median effective concentration(96 h-EC50)of NP forC.pyrenoidosais 3.13 mg·L-1,and there exist clear dose and time effects in the influence of NP on the cell density and chlorophyll content ofC.pyrenoidosa.In the toxicity test of NP onD.magna,the 48 h median lethal concentration(48 h-LC50) forD.magnais 37.41 μg·L-1,indicating that NP is a highly toxic substance.NP poses adverse effects on the growth and reproduction ofD.magna.The bioconcentration factor(BCF)ofC.pyrenoidosafor NP was 5 144.93after 0.05 mg·L-1NP exposure for 4 h,and the accumulation amount reached 252.2 μg·g-1.After 12 h NP exposure,the BCF ofC.pyrenoidosafor NP reached 12 053.64,and the accumulation amount was 1 181.73 μg·g-1. However,the accumulation amount of NP in theD.magnawas 3.6 μg·g-1after it was fed withC.pyrenoidosapreviously exposed to 0.05 mg·L-1NP for 7 days.The accumulation amount inD.magnaexposed to 0.05 mg·L-1NP for 10 days was 4.02 μg·g-1.These results demonstrate thatC.pyrenoidosahas a high ability to accumulate NP rapidly,and NP in the body ofD.magnais mainly from the feeding ofC.pyrenoidosaexposed to NP,which significantly inhibit the growth,reproduction and feeding ofD.magna.This study suggests NP has adverse effects on aquatic organisms,which is useful for evaluating the long-term ecological risk of NP in the aquatic ecosystem.

nonylphenol;Chlorella pyrenoidosa;Daphnia magna;comprehensive toxicity;bioaccumulation

2016-01-28 錄用日期：2016-04-03

1673-5897（2016）3-157-10

X171.5

A

10.7524/AJE.1673-5897.20160128001

簡介：段舜山(1955—)，男，教授，博士生導師，主要從事藻類生理生態(tài)學研究，發(fā)表學術論文200多篇。

國家自然科學基金(41176104,41476099)；國家自然科學聯(lián)合基金資助項目(U1133003)

侯云(1990-)，男，碩士研究生，研究方向為藻類生理學，E-mail:cloudhou2015@163.com;

*通訊作者（Corresponding author），E-mail:tssduan@jnu.edu.cn