陳曉雯，趙建亮，劉有勝，蔣宇霞，楊愿愿，應光國,#

1.中國科學院廣州地球化學研究所有機地球化學國家重點實驗室，廣州510640

2.中國科學院大學，北京100049

長江中下游環(huán)境激素效應的污染特征及生態(tài)風險

陳曉雯1,2，趙建亮1,*，劉有勝1，蔣宇霞1,2，楊愿愿1,2，應光國1,#

1.中國科學院廣州地球化學研究所有機地球化學國家重點實驗室，廣州510640

2.中國科學院大學，北京100049

生活污水和養(yǎng)殖廢水排放導致受納水環(huán)境中激素類物質(zhì)的污染，對水生生物產(chǎn)生不利影響。分別利用嵌入雌激素受體和雄激素受體的基因重組酵母菌測定了長江中下游流域不同時期水體和沉積物中4種環(huán)境激素效應，即雌激素效應、抗雌激素效應、雄激素效應和抗雄激素效應。結(jié)果表明，雌激素效應污染最為普遍，在地表水和沉積物中檢出率均超過50%，水體和沉積物的最高濃度分別為2.05 ng·L-1雌二醇當量(EEQ)和0.43 ng EEQ·g-1。其他3種激素效應在水體和沉積物介質(zhì)中的檢出率均低于雌激素效應，按總體檢出率來看：抗雄激素效應>雄激素效應>抗雌激素效應，3種激素效應在水體中最大檢出濃度分別為144 μg·L-1氟他胺當量(FEQ)、37.9 ng·L-1二氫睪酮當量(DEQ)和103 μg·L-1他莫西芬當量(TEQ)，在沉積物中分別為53.6 μg FEQ·g-1、12.0 ng DEQ·g-1和51.5 μg TEQ·g-1。環(huán)境激素效應的濃度分布在水體中均呈現(xiàn)季節(jié)性的差異，雌激素效應的區(qū)域性高值位于武漢段、鄱陽湖口和蕪湖-南京段，其他3種激素效應沒有明顯的高污染區(qū)域。環(huán)境激素效應與當?shù)厝丝跀?shù)量、有機質(zhì)、氨氮等呈現(xiàn)一定相關(guān)性，表明環(huán)境激素效應與人類活動排放密切相關(guān)。雌激素效應僅在鄱陽湖口點位具有高風險，其他區(qū)域為中等風險，雄激素效應無高風險區(qū)域。研究結(jié)果有助于認識長江中下游區(qū)域的環(huán)境激素效應污染態(tài)勢，為相關(guān)污染控制提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

環(huán)境激素效應；雌激素效應；長江流域；內(nèi)分泌干擾；生態(tài)風險

陳曉雯,趙建亮,劉有勝,等.長江中下游環(huán)境激素效應的污染特征及生態(tài)風險[J].生態(tài)毒理學報，2016,11(3):191-203

Chen X W,Zhao J L,Liu Y S,et al.Occurrence and ecological risks of hormonal activities in the middle and lower reaches of Yangtze River[J].Asian Journal of Ecotoxicology,2016,11(3):191-203(in Chinese)

環(huán)境激素(也稱內(nèi)分泌干擾物)是一類典型外源性污染物，進入生物體后可模仿內(nèi)源性激素的生理、生化作用，與體內(nèi)荷爾蒙受體結(jié)合，干擾機體內(nèi)分泌系統(tǒng)正常代謝，從而產(chǎn)生內(nèi)分泌干擾效應[1]。隨著我國城市化和現(xiàn)代化的快速發(fā)展，產(chǎn)生了大量的生活污水、工業(yè)廢水和養(yǎng)殖廢水，其中含有的外源性環(huán)境激素物質(zhì)、以及人類和動物排放的內(nèi)源性激素物質(zhì)在廢水處理過程中并不能完全去除，最終隨出水排放到自然環(huán)境，對水生生物產(chǎn)生不利的環(huán)境激素效應[2-3]。研究發(fā)現(xiàn)，在污水處理廠排放口附近的野生魚體存在異常的雌性化或雄性化現(xiàn)象及生殖、發(fā)育系統(tǒng)紊亂特征[4-8]。因此，采用快速的離體方法檢測河流水體和沉積物中的環(huán)境激素效應的污染程度，有助于評估水生生物的健康風險。目前，關(guān)于水環(huán)境中環(huán)境激素的報道主要集中在雌激素效應及雌激素活性物質(zhì)的檢測方面[9-12]。此外，環(huán)境中也存在具有雄激素、抗雄激素、抗雌激素效應的化學物質(zhì)[13-16]，其性質(zhì)、來源、歸趨及對各級生物產(chǎn)生的危害應引起人們的重視，但目前關(guān)于這些物質(zhì)及其引起的效應在我國河流環(huán)境中污染狀況的研究相對較少[17-18]。

長江是我國境內(nèi)第一大河、也是我國文明的重要發(fā)源地之一，流經(jīng)重慶、湖北、湖南、安徽、江蘇、上海等多個人口較密集的省區(qū)和直轄市。隨著人口的增長和人們生活水平的提高，更多具有激素效應的物質(zhì)可能經(jīng)污水處理廠排放、養(yǎng)殖廢水排放和地表徑流等途徑進入長江水域中，從而對水體中的生物造成影響。已有的研究表明長江河口等區(qū)域可檢測到雌激素物質(zhì)的污染[19-20]，但目前關(guān)于其各種環(huán)境激素效應污染狀況的報道還較少[21]。本研究選取長江中下游河段人口密度較大的地區(qū)開展研究，分別利用嵌入雌激素受體和雄激素受體的基因重組酵母菌，運用離體方法測定了長江中下游流域中4種環(huán)境激素效應(雌激素、抗雌激素、雄激素、抗雄激素效應)，分析其時空污染特征，探討其與多種環(huán)境因子的相關(guān)性，并進行生態(tài)風險評估，為長江流域的環(huán)境激素污染控制提供依據(jù)。

1 材料與方法（Materials and methods）

1.1 材料

1.1.1 主要儀器及試劑

儀器：酶標儀(BMG Labtech FLUOstar Omega,德國)、臥式恒溫振蕩搖床(SKY-211BG)、生化培養(yǎng)箱(Yamato IC113C)、潔凈工作臺、冰箱、高壓滅菌鍋等。

試劑：氯酚紅-β-D-半乳糖苷(Chlorophenolred-β-D galactopyranoside,CPRG，Sigma公司)；(NH4)2SO4、KH2PO4、Fe2(SO4)3、KOH、MgSO4、CuSO4、L-亮氨酸、L-組氨酸、腺嘌呤、L-精氨酸-HCL、L-甲硫氨酸、L-酪氨酸、L-異亮氨酸、L-賴氨酸-HCL、L-苯基丙氨酸、L-纈氨酸、L-谷氨酸、L-絲氨酸、L-天冬氨酸、L-蘇氨酸、維生素B1、維生素B6、泛酸、肌醇、D-(+)-葡萄糖、甘油等配制培養(yǎng)基所用試劑均來自Sigma公司；17β-雌二醇(17β-estradiol,E2)、5α-二氫睪酮(5α-dihydrotestosterone,DHT)，他莫西芬(tamoxifen,TAM)，氟他胺(flutamide,FLU)等化學標準品均來自Sigma公司，純度>97%。甲醇、二氯甲烷、正乙烷等樣品溶劑和化學提取試劑均來自默克公司。

實驗過程所用的玻璃器皿使用前經(jīng)重鉻酸鉀/硫酸洗液洗滌，自來水沖洗3次，超純水沖洗2次，烘干后置于馬弗爐(400℃)中焙燒4 h。過濾水樣的濾膜為Whatman GF/F(直徑47 mm，0.7 μm孔徑)，使用前于馬弗爐中經(jīng)400℃烘烤4 h；濃縮后樣品過濾所使用的濾膜均為有機相微孔濾膜(直徑13 mm，0.22 μm孔徑)。固相萃取柱為Waters Oasis HLB柱(6 cc，500 mg吸附劑)。

1.1.2 試驗菌株

本試驗所用菌種分別為重組雌激素和雄激素受體基因的酵母菌，均由英國Dr.J.P.Sumpter提供(Brunel University,Uxbridge,UK)。

1.2 方法

1.2.1 樣品采集

本研究選取的調(diào)查范圍為長江中下游流域，從湖北省三峽水庫到上海市入?？谔幑?4個采樣點，分別于2013年7月、2013年12月采集了豐水期和枯水期的地表水及沉積物樣品，采樣點位置分布如圖1，名稱如下：C1(三峽水庫)、C2(宜昌)、C3(荊州)、C4 (洪湖)、C5(洞庭湖口)、C6(武漢前)、C7(武漢)、C8(東湖)、C9(漢江口)、C10(武漢后)、C11(黃石)、C12(九江)、C13(鄱陽湖口)、C14(大通)、C15(蕪湖)、C16(馬鞍山)、C17(南京前)、C18(南京)、C19(南京后)、C20(鎮(zhèn)江)、C21 (淮河口)、C22(揚中)、C23(南通)、C24(上海)。

分別采集了水樣和沉積物樣品。每個采樣點于同一斷面(水平面下約0.5 m)多方位采集1 L的混合水樣，用棕色玻璃瓶收集，每個采樣點采集2個平行樣。采集后的水樣立即加入50 mL色譜純甲醇用于抑制微生物降解，并加入400 μL 4 mol·L-1H2SO4調(diào)節(jié)pH至3.0，樣品存放于4℃冰盒中運回實驗室，并于48 h內(nèi)進行前處理(見1.2.2)。以抓斗采樣器采集表層沉積物，分別采集所在截面的左中右等份樣，混合后取1 L左右沉積物于玻璃瓶中，立即加入1 g疊氮鈉，混勻后于4℃冰盒中運回實驗室，保存于-18℃，并盡快將沉積物于-50℃進行冷凍干燥，凍干后的沉積物過20目(孔徑1.1 cm)篩，保存于4℃冷庫中待提取凈化。

圖1 長江中下游流域24個采樣點分布圖

1.2.2 樣品前處理

采集的樣品，水樣需要進行固相萃取進行濃縮，沉積物樣品凍干后需進行超聲提取并進行硅膠柱凈化和濃縮，濃縮后的樣品于-18℃保存。

水樣采用固相萃取法提?。簩⒉杉? L水樣過GF/F濾膜，HLB固相萃取柱分別用10 mL甲醇和10 mL Milli-Q水進行活化，然后樣品以3～5 mL· min-1的流速過HLB柱；完畢后，以2×50 mL 5%甲醇的水溶液潤洗采樣瓶，并過HLB柱，再分別往每根柱上加入2×5 mL Milli-Q水，抽干2 h；先后以7 mL甲醇和5 mL二氯甲烷洗脫，合并洗脫液，于氮氣下吹干，以1 mL甲醇定容，過0.22 μm有機相濾膜并轉(zhuǎn)移至2 mL的棕色小瓶中，樣品測試前于-18℃保存。

沉積物采用超聲提取-硅膠柱凈化法：分別稱取2份平行的5 g凍干后沉積物于30 mL玻璃離心管中。加入10 mL乙酸乙酯:甲酸(50:1,V/V)混合液，渦旋振蕩2 min，然后超聲提取15 min，于2 500 r· min-1離心10 min；用膠頭滴管將上層溶劑輕輕吸至100 mL梨形燒瓶中；分別再加入10 mL和5 mL乙酸乙酯:甲酸(50:1,V/V)的混合液，重復上述提取步驟，合并提取液，于氮氣下吹干。稱取1 g硅膠于直徑約6 mm的玻璃柱內(nèi)，加入約0.5 cm厚無水Na2SO4，輕敲柱子使其勻?qū)嵑螅群笠? mL甲醇、6 mL乙酸乙酯和6 mL正己烷活化硅膠柱；以2 mL正己烷溶解吹干的樣品，并加載到凈化柱中，重復2次，棄去流出液(正己烷相)；再用2 mL乙酸乙酯溶解樣品，過柱，重復3次，收集流出液(乙酸乙酯相)，于氮氣下吹干，加入1 mL甲醇重新溶解定容，過0.22 μm有機相濾膜并轉(zhuǎn)移至2 mL棕色小瓶中，樣品測試前于-18℃保存。

1.2.3 樣品的環(huán)境激素效應測試

經(jīng)固相萃取濃縮的水樣和超聲提取濃縮的沉積物樣品分別采用嵌入雌激素受體(下文簡稱YES酵母菌)和雄激素受體(下文簡稱YAS酵母菌)的酵母菌進行雌激素效應篩選(yeast estrogen screening, YES)、抗雌激素效應篩選(yeast anti-estrogen screening,YAES)、雄激素效應篩選(yeast androgen screening,YAS)和抗雄激素效應篩選(yeast anti-androgen screening,YAAS)。其基本原理如下：將雌/雄激素受體基因嵌入酵母主染色體中，環(huán)境中的激素物質(zhì)能夠與之結(jié)合形成活性受體，引起報告基因Lac-Z的表達，產(chǎn)生β-半乳糖苷酶并從酵母細胞內(nèi)分泌到胞外介質(zhì)中，促使黃色的底物CPRG轉(zhuǎn)變?yōu)榧t色的產(chǎn)物，此產(chǎn)物在540 nm具有強烈的可見光吸收，吸光度值越大則激素效應強度越大，從而可以通過測量吸光度定量檢測環(huán)境樣品的激素效應強度。樣品的4種環(huán)境激素效應測試方法參照文獻報道[22]的操作進行，主要步驟如下。

菌種培養(yǎng)：2種實驗菌株的培養(yǎng)方法基本一致。取125 μL 10倍濃縮的YES/YAS酵母菌液于50 mL生長培養(yǎng)基中，28℃恒溫振蕩培養(yǎng)約24 h，待其620 nm下吸光度約為1.0時可進行暴露測試。其中，YES酵母菌用于雌激素和抗雌激素效應測試，YAS酵母菌用于雄激素和抗雄激素效應測試。

樣品準備：經(jīng)固相萃取濃縮的水樣、超聲提取濃縮的沉積物樣品、及陽性對照樣品測試前需從起始濃度進行等倍梯度稀釋，以便獲得合適的劑量-效應曲線，稀釋過程在96孔板上進行，步驟如下。YES (YAS)實驗以E2(DHT)作為陽性控制，以0.2 μmol· L-1E2(2 μmol·L-1DHT)為初始濃度，甲醇為稀釋劑，于96孔板上按2倍梯度依次稀釋12個濃度，同時純甲醇作為陰性對照。樣品的稀釋方法類似陽性控制，小瓶內(nèi)的樣品依次按2倍進行8個濃度梯度稀釋。取10 μL稀釋后的樣品移至另外一個96微孔板上相應的孔內(nèi)，于超凈臺內(nèi)使甲醇揮發(fā)干。YAES (YAAS)實驗以TAM(FLU)作為陽性控制和標準曲線，以2 mmol·L-1TAM(2 mmol·L-1FLU)為初始濃度，純甲醇作為陰性對照，按照上述YES(YAS)實驗的方法稀釋標準品和樣品后，于超凈臺內(nèi)晾干后每個孔再加入10 μL 0.005 μmol·L-1低劑量的E2(10 μL 0.15 μmol·L-1DHT)作為誘導拮抗劑，再次晾干。稀釋完畢后，將孔板密封冷藏保存，并盡快進行測試。

暴露及測試：菌液濃度培養(yǎng)達到要求后，按接種量約為2 mL(原培養(yǎng)菌液)/50 mL生長培養(yǎng)基(新配培養(yǎng)基)的比例，再加入一定體積的10 mg·mL-1的CPRG，使之最終濃度為0.1 mg·mL-1，加入200 μL混合后的培養(yǎng)液于已加入樣品的孔內(nèi)。微孔板以封口膜密封好，并以錫紙完全包好，于微孔板振蕩器上1 000 r·min-1震蕩2 min，使樣品與酵母細胞溶液完全混合，然后置于32℃恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)約24 h，再次震蕩2 min，YES和YAS實驗繼續(xù)培養(yǎng)48 h，YAS和YAAS實驗需轉(zhuǎn)移至28℃繼續(xù)恒溫培養(yǎng)24 h。最終以酶標儀在620 nm和540 nm分別測定菌液濃度和CPRG底物的吸光度，測得的數(shù)據(jù)匯總后進行數(shù)據(jù)分析(見1.4)。

1.3 化學分析

采集的水樣和沉積物樣品分別測定了主要的水質(zhì)和沉積物性質(zhì)參數(shù)。水質(zhì)參數(shù)有pH值、溶解氧(DO)值、生物需氧量(BOD5)、化學需氧量(COD)、總磷(TP)、總氮(TN)、氨氮(NH3-N)含量，沉積物參數(shù)有總有機碳(TOC)、TP、TN、NH3-N含量。同時還對水體和沉積物中的雌激素物質(zhì)含量進行了測定，測試方法按照實驗室已建立的分析方法進行[23]：水樣采用HLB固相萃取，沉積物采用超聲提取+硅膠柱凈化的方法萃取，萃取物經(jīng)五氟芐基酰氯衍生化后，以GC-MS(Gas Chromatography-Mass Spectrometer)測定辛基酚(4-t-OP)、壬基酚(4-NP)、雙酚A(BPA)、雌酮(E1)、雌二醇(E2)、乙炔基雌二醇(EE2)、乙烯雌酚(DES)、三氯生(TCS)共8種雌激素物質(zhì)的含量。

1.4 數(shù)據(jù)分析

1.4.1 樣品的當量效應濃度計算

陽性對照或樣品的激素效應與濃度符合標準的“S”型劑量-效應關(guān)系。因此，對陽性對照的吸光度值和濃度進行l(wèi)og-logistic方程擬合，得到相應的標準曲線，樣品則根據(jù)標準曲線擬合得到的方程進行當量效應濃度計算，過程如下。

先通過吸光度計算濁度，計算公式如式1：

其中，Ax是x孔計算出的相對吸光度；Ax,540是x孔在540 nm處的絕對吸光度；Ax,620是x孔在620 nm處的絕對吸光度；A—0,620是甲醇在620 nm處的平均吸光度；A—0,540是甲醇在540 nm處的平均吸光度。上式計算可扣除由于濁度引起的吸光度的偏差，再扣除由空白引起的吸光度偏差，其結(jié)果為CPRG變色所得到的吸光度變化。

各個標準物質(zhì)的曲線采用Origin 9.0軟件進行l(wèi)og-logistic模型擬合，模型方程如式2：

其中，Amax為曲線所達到的最大值；Amin為曲線所達到的最小值；p為斜率；C為對應標準品的濃度，單位為ng·L-1或μg·L-1；EC50是50%效應濃度，單位同C。樣品的當量效應濃度根據(jù)測得的吸光度值，通過式2逆運算推導得到。

表1 風險評價使用的4種激素效應陽性對照的PNEC值Table 1 PNEC values of the four reference compounds for ecological risk assessment of hormonal effects

1.4.2 生態(tài)風險評估方法

采用風險商(RQ,risk quotient)法評估地表水中4種環(huán)境激素效應的生態(tài)風險。RQ計算公式如式3：

其中，測定的環(huán)境激素效應為各效應的陽性對照當量濃度，PNEC(predicted no effect concentrations)為各效應陽性對照的預測無效應濃度。RQ<0.1為低風險；0.1≤RQ<1為中等風險；RQ≥1為高風險。

對于PNEC值，通過搜集了各陽性對照的生態(tài)毒理數(shù)據(jù)，采用評價因子(assessment factor,AF)法，并根據(jù)毒性數(shù)據(jù)類別選取合適的評價因子推導[24]，即PNEC=最小NOEC/AF。其中17β-雌二醇直接使用文獻中已報道的PNEC值。5α-二氫睪酮和他莫西芬的PNEC值根據(jù)生物慢性NOEC(no observed effect concentration，最大無影響濃度)數(shù)據(jù)，AF取100得到；氟他胺的PNEC值選取最小NOEC，AF取50得到。4種激素效應陽性對照的PNEC值見表1。

1.4.3 環(huán)境激素效應與環(huán)境因子的相關(guān)性分析

表2 長江中下游地表水和沉積物中4種環(huán)境激素效應的分布特征Table 2 Distribution of four hormonal activities in river water and sediment from the middle and lower reaches of Yangtze River

為進一步分析激素效應在環(huán)境中分布差異的原因，本研究參照文獻選取了環(huán)境介質(zhì)中通常關(guān)注的幾種環(huán)境因子，包括常見雌激素物質(zhì)的含量、水質(zhì)參數(shù)和沉積物參數(shù)、以及人口數(shù)量、GDP等，將其與激素效應采用約束性排序方法(constrained ordination methods)進行統(tǒng)計分析：先通過降趨對應分析(detrended correspondence analysis,DCA)確定變量符合的模型(單峰還是線型模型)和對應的分析方法，本研究響應變量組為4種激素效應濃度，解釋變量組為各個環(huán)境因子數(shù)據(jù)，所有原始數(shù)據(jù)均進行l(wèi)g(x+1)轉(zhuǎn)換，變量的顯著性經(jīng)過499次的蒙特卡羅(Monte Carlo)檢驗。結(jié)果表明，本研究沉積物和地表水中的激素效應均適合用典范對應分析(canonical correspondence analysis,CCA)，通過條件檢驗，選取p值小于0.5，即貢獻因子較大的指標繪制分析圖。CCA是一種針對單峰模型的直接梯度分析方法，從統(tǒng)計學的角度來評價一組變量與另一組多變量數(shù)據(jù)之間的關(guān)系，并且獨立保持各個變量對響應變量的貢獻率。上述統(tǒng)計分析均在軟件CANOCO 4.5中運行。

圖2 長江中下游地表水和沉積物中4種激素效應季節(jié)分布

2 結(jié)果（Results）

2.1 環(huán)境激素效應的污染特征

2.1.1 環(huán)境激素效應的整體分布

離體生物測試結(jié)果顯示長江中下游地區(qū)地表水和沉積物中4種環(huán)境激素效應都有不同程度的檢出，其整體分布特征見表2。雌激素效應的污染最為顯著，在地表水和沉積物中檢出率均超過50%。水體雌激素效應在兩季整體檢出率為93.8%，其中豐水期高達100%，地表水豐水期和枯水期的最高濃度分別為2.05和1.07 ng EEQ·L-1；沉積物中兩季整體檢出率為60.4%，其中豐水期為66.7%，豐水期和枯水期最高濃度分別為0.07和0.43 ng EEQ·g-1?？勾萍に匦獧z出情況明顯低于雌激素效應，地表水中兩季的檢出率均低于25%，在豐水期和枯水期最大濃度分別為67.7和103 μg TEQ·L-1，沉積物中在兩季的檢出率略高于水體，但都低于34%，在豐水期和枯水期最大濃度分別為39.6和51.5 μg TEQ·g-1。

雄激素效應在地表水中枯水期檢出率為83%，顯著高于豐水期(8%)，在豐水期和枯水期最大濃度分別為8.86和37.9 ng DEQ·L-1，沉積物中雄激素效應在枯水期未檢出，在豐水期中檢出率僅為8%，最大濃度為12.0 ng DEQ·g-1?？剐奂に匦乇硭菟跈z出率為17%以外，地表水豐水期和沉積物兩季的檢出率都處于60%～80%，地表水豐水期和枯水期的最高濃度分別為144和50.9 μg FEQ· L-1，沉積物豐水期和枯水期的最高濃度分別為36.6和53.6 μg FEQ·g-1。

2.1.2 環(huán)境激素效應的空間分布和季節(jié)變化

4種環(huán)境激素效應在長江中下游24個采樣點位的空間分布和季節(jié)變化如圖2所示。對于檢出頻率最高的雌激素效應，地表水中豐水期濃度整體上高于枯水期濃度，豐水期平均濃度(0.64 ng EEQ· L-1)約為枯水期平均濃度(0.33 ng EEQ·L-1)的2倍左右(圖2a)。從空間分布來看，中部地區(qū)的采樣點位(C7～C18)雌激素效應濃度較高，其中最高點位于豐水期的C13點位(鄱陽湖口處)。沉積物中兩季的平均濃度則差異不大(豐水期和枯水期分別為0.03和0.04 ng EEQ·g-1)，但有些在豐水期沒有檢出的點位在枯水期時有檢出，且濃度超過0.1 ng EEQ·g-1，如C8～C9武漢段、C12～C13九江段(圖2b)。對于抗雌激素效應，雖在水體環(huán)境中檢出率不高，但兩季水體中均可在武漢市及周邊采樣點(C7～C8)檢測到，如武漢東湖(C8)水體枯水期濃度達81.6 μg TEQ· L-1，鄱陽湖口處(C13)也出現(xiàn)區(qū)域性高值，葉家洲附近(C10)地表水枯水期最高濃度達到103 μg TEQ· L-1(圖2c)。而沉積物污染則分布較零散，檢出點位多位于湖北境內(nèi)，豐水期和枯水期平均濃度分別為7.84和8.08 μg TEQ·g-1，季節(jié)性差異不大(圖2d)。

對于雄激素效應，多數(shù)點位的效應強度較弱，或基本未檢出，但地表水中枯水期的污染程度明顯較高(圖2e)，平均濃度達到17.1 ng DEQ·L-1，而豐水期僅武漢東湖(C8)和漢江口處(C9)檢出雄激素效應，平均濃度僅為0.65 ng DEQ·L-1。沉積物中兩季僅在豐水期的南通(C22)和上海市靠近入?？谔?C23)檢出雄激素效應，濃度分別為12.0和10.7 ng DEQ· g-1(圖2f)。抗雄激素效應在地表水中的檢出率與雄激素效應差別不大，但在沉積物中則明顯大于雄激素效應，抗雄激素效應兩季的效應強度也具有較大差異：地表水枯水期中平均濃度為4.13 μg FEQ· L-1，豐水期卻高達63.7 μg FEQ·L-1(圖2g)，約高出14倍。沉積物中抗雄激素的季節(jié)變化則相對較小，但整個采樣區(qū)域的兩季樣品中均可零散檢測出該效應，豐水期和枯水期的平均濃度分別為7.78和13.1 μg FEQ·g-1(圖2h)。

2.2 環(huán)境激素效應的影響因素

水環(huán)境是城市和農(nóng)村面源污染物的重要“匯”，河流中的環(huán)境激素物質(zhì)主要來源于城市和農(nóng)村人口排放的生活污水、養(yǎng)殖場禽畜排放的廢水[2,14]，因此其環(huán)境激素效應可能與研究區(qū)域內(nèi)的人口數(shù)量(Pop)、當?shù)亟?jīng)濟狀況(即國內(nèi)生產(chǎn)總值GDP)、生活污水排放量等密切相關(guān)。本研究搜集了三類環(huán)境因子，包括：(1)各采樣點位所處區(qū)域的Pop、GDP的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，其中因武漢市范圍內(nèi)有4個點位分布，東湖C8點處于武漢市中心，其范圍與其他3個點位有重復，為方便人口數(shù)量的統(tǒng)計，C8點不納入統(tǒng)計范圍；(2)與水體和沉積物相關(guān)的環(huán)境參數(shù)(TN、TP、NH3-N、水體的pH、DO、COD、BOD5及沉積物的TOC)；(3)代表性的環(huán)境激素物質(zhì)含量(E1、E2、EE2、4-NP、4-OP、BPA、DES、TCS)。然后選取這些環(huán)境因子與4種激素效應的關(guān)系進行統(tǒng)計分析，篩選相關(guān)性較強(p<0.5)的環(huán)境因子繪圖，如圖3所示。

通過CCA統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)，環(huán)境中的激素效應濃度與多個環(huán)境指標具有相關(guān)性。地表水相關(guān)分析圖中第一、第二軸的特征值分別為0.722和0.147，共解釋了激素效應數(shù)據(jù)組累計方差值的86.9%。環(huán)境激素效應中檢出較多的雌激素、抗雄激素效應，與該地區(qū)基質(zhì)中總磷含量的指標以及4-NP和TCS的含量呈正相關(guān)，同時當?shù)氐娜丝跀?shù)量和GDP也是影響這2種激素效應的重要因子，隨著人口數(shù)量的增加和GDP的增長，激素物質(zhì)排放量將逐漸增加，出現(xiàn)激素效應的風險亦隨之增加，而DO、COD、TN等化學指標與這2種激素效應卻呈現(xiàn)較弱的相關(guān)性?？梢钥闯?，這2類檢出較多的激素效應存在一些共同影響因素。

表3 與其他地區(qū)水環(huán)境中激素效應的污染情況比較Table 3 Summarized data of hormonal activities in water environment reported in different countries and regions

與地表水不同，沉積物的相關(guān)分析表明上述水體中影響環(huán)境激素效應的因子不足以影響4種激素效應的強度。相應地，沉積物中2個特征軸(0.246和0.059)解釋的變量累計方差較小，僅為30.5%，可能是由于存在其他相關(guān)的未知因子未列入統(tǒng)計范圍所致。從各變量分布看，YAAS與Pop和GDP有一定的相關(guān)性，表明人為排放對抗雄激素效應有重要影響；YAES與DES、4-NP、TN、TOC等多種化合物含量相關(guān)性較強，這些可能引起激素效應的化合物含量對激素效應的貢獻較大，而與之相比，YAS和YES與各環(huán)境因子的相關(guān)性則較弱，可能與納入分析的環(huán)境因子有限有關(guān)。

3 討論（Discussion）

3.1 長江環(huán)境激素效應的污染趨勢及與其他地區(qū)比較

4種激素效應在我國長江中下游地表水和沉積物中均有不同程度的檢出，其中雌激素效應檢出率在2種介質(zhì)中均較高，都大于60%(表2)，最高效應強度在地表水和沉積物中分別達到2.05 ng EEQ· L-1和0.43 ng EEQ·g-1，表明長江中下游的雌激素效應污染較為普遍，需引起足夠的重視。目前，國內(nèi)外學者對環(huán)境中的雌激素效應研究較多(表3)。本研究中，長江中下游的雌激素效應濃度范圍為ND～2.05 ng EEQ·L-1，與Jiang等[30]對我國松花江、淮河、遼河、珠江等水源地的雌激素活性監(jiān)測結(jié)果(0.08～2.40 ng EEQ·L-1)較為接近，但明顯低于天津河流的濃度[31]，最大值也明顯低于珠江水系報道的最大值[17]。與國外的研究相比，長江中下游的雌激素活性水平與法國和意大利的河流較為接近[35,36]，但明顯低于美國、韓國和日本報道的河流中的雌激素活性水平[32-34]。其他幾種環(huán)境激素效應的研究較少，英國河流中報道的雄激素活性水平為幾個ng DEQ ·L-1，意大利的河流中報道的抗雄激素活性水平為數(shù)百μg FEQ·L-1[36]，這些研究結(jié)果與本研究結(jié)果接近。此外，對于沉積物中的環(huán)境激素效應，德國Galluba等[37]調(diào)查了海塞州河流中沉積物的雌激素和雄激素效應污染情況，其檢出率分別為66%和68%，平均濃度分別為7.78 ng EEQ·kg-1和32.0 ng TEQ· kg-1(TEQ:testosterone equivalents，睪酮當量活性)，高于長江中下游沉積物中的雌激素效應水平。

河流是多種污染源的重要受納環(huán)境。有報道指出我國長江多個沿江城市，如南京、武漢等地污水處理廠最終出水中也可檢出雌激素效應污染[38-39]，這些生活污水最終排放到長江支流或干流，導致太湖、淮河、長江下游段也不同程度檢出激素效應[40]，因此城市排放的生活污水可能是長江水環(huán)境中雌激素效應的重要污染源，這與統(tǒng)計分析結(jié)果顯示人口數(shù)量與雌激素效應具有很強的相關(guān)性是一致的(圖3)。本研究還發(fā)現(xiàn)長江九江段附近區(qū)域(C12～C13)也具有較高的雌激素效應，可能由于該區(qū)域地處江西省禽畜和水產(chǎn)養(yǎng)殖漁業(yè)密集區(qū)，禽畜、水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)等排放的廢水中也含有大量雌激素物質(zhì)，從而易出現(xiàn)區(qū)域性雌激素效應污染[41]。此外，季節(jié)性變化也導致各地區(qū)的環(huán)境激素效應產(chǎn)生一定的差異，如雌激素效應在豐水期總體高于枯水期(圖2a)，可能由于豐水期地表徑流量大，城市面源排放的雌激素類污染物易隨地表徑流進入長江水體。相對而言，抗雌激素、雄激素效應和抗雄激素效應在國內(nèi)外的研究相對較少。已有的研究表明雄激素效應也可能與城市污水處理廠、畜禽養(yǎng)殖場、以及水產(chǎn)養(yǎng)殖廢水排放有關(guān)，特別是造紙廠廢水中發(fā)現(xiàn)大量雄激素物質(zhì)，是受納環(huán)境中雄激素效應的重要來源[41]。抗雄激素活性在長江流域水體和沉積物2種環(huán)境介質(zhì)中的檢出率也較高，統(tǒng)計結(jié)果顯示與人口數(shù)據(jù)等環(huán)境因子相關(guān)(圖3)。

總的來說，長江干流的環(huán)境激素效應與其他地區(qū)相比處于中等偏下水平。但長江是我國第一大河，長江中下游干流靠近入海處水流量在豐水期和枯水期可分別高達41 400和13 000 m3·s-1[42]，其入海雌激素效應排放通量在豐水期和枯水期分別達到2.4×10-2kg EEQ·s-1和1.3×10-3kg EEQ·s-1，大于珠江廣州段的入海通量(豐水期和枯水期分別為8.7× 10-3kg EEQ·s-1和3.0×10-4kg EEQ·s-1)[25]和黃河的入海通量(<1×10-4kg EEQ·s-1)[11]。且隨著長江中下游區(qū)域城市經(jīng)濟的快速發(fā)展，人口數(shù)量也逐漸增加，生活污水排放量逐年增加，使得長江干流環(huán)境激素效應污染態(tài)勢有加重趨勢，亟待關(guān)注和采取相關(guān)控制手段。

圖4 長江中下游流域環(huán)境激素效應的生態(tài)風險

3.2 水體中環(huán)境激素效應的生態(tài)風險

根據(jù)RQ風險商評價法評估了我國長江中下游地區(qū)水體環(huán)境中兩季環(huán)境激素效應的生態(tài)風險水平，如圖4所示。生態(tài)風險評價結(jié)果表明長江流域雌激素效應風險多數(shù)處于中等風險水平(RQ<0.8)，僅鄱陽湖口(C13)為高風險，該區(qū)域可能是由于周邊生活污染的匯入有關(guān)，雖然鄱陽湖匯入長江后雌激素風險由于上游來水稀釋作用而降低，但應加大污染區(qū)域的生活污水排放控制力度。長江流域雄激素效應的RQ值都低于1，大部分在0.1～1，表明雄激素效應的生態(tài)風險為中等。抗雌激素效應和抗雄激素效應雖檢出率不高，但在檢出點位均為高風險，可能對河流水體中的生物產(chǎn)生內(nèi)分泌干擾效應。不過，由于目前對于抗雌激素和抗雄激素這類內(nèi)分泌干擾物對生物體往往表現(xiàn)為生殖繁殖障礙，尚無法推導抗激素對生殖繁殖系統(tǒng)影響的閾值，因此本研究單純用RQ風險商評價法得出的高風險結(jié)論只能作為指示和參考，亟待借助更多毒理學實驗手段探索抗雌激素和抗雄激素這類物質(zhì)對生殖系統(tǒng)障礙的影響，以便更全面進行生態(tài)風險評價?？傮w來說，通過環(huán)境激素效應的生態(tài)風險評價，有助于我們認識長江中下游區(qū)域的環(huán)境激素效的污染態(tài)勢，為環(huán)境管理部門采取應對措施提供依據(jù)。

致謝：感謝中國地質(zhì)大學(武漢)祁士華教授、江蘇省農(nóng)業(yè)科學院劉賢金研究員和余向陽研究員在樣品采集過程中給予的幫助。

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Occurrence and Ecological Risks of Hormonal Activities in the Middle and Lower Reaches of Yangtze River

Chen Xiaowen1,2,Zhao Jianliang1,*,Liu Yousheng1,Jiang Yuxia1,2,Yang Yuanyuan1,2,Ying Guangguo1,#

1.State Key Laboratory of Organic Geochemistry,Guangzhou Institute of Geochemistry,Chinese Academy of Sciences,Guangzhou 510640,China
2.University of Chinese Academy of Sciences,Beijing 100049,China

16 June 2015 accepted 17 August 2015

Discharge of domestic sewage and livestock wastewater results in the pollution of endocrine disrupting chemicals in the aquatic environment,which may cause adverse effects on aquatic organisms.This study aimed to evaluate four kinds of environmental hormone effects including estrogenic activity,anti-estrogenic activity,andro-genic activity and anti-androgenic activity in surface water and sediment of the middle and lower reaches of the Yangtze River during different seasons by using recombinant yeast screening assays.The results showed widespread detection of estrogenic activity in the river,with the detection frequencies higher than 50%in both surface water and sediment.The highest estrogenic activity was up to 2.05 ng·L-1estradiol equivalents(EEQ)in surface water and 0.43 ng EEQ·g-1in sediment.In contrast,the detection frequencies of the other three hormonal activities were generally lower than that of estrogen activity in the river.The overall detection frequencies of those three hormonal activities ranked as follows:anti-androgenic activity>androgenic activity>anti-estrogenic activity,with the maximum detected concentrations of 144 μg·L-1flutamide equivalents(FEQ),37.9 ng·L-1dihydrotestosterone equivalents(DEQ)and 103 μg·L-1tamoxifen equivalents(TEQ)in surface water,and 53.6 μg FEQ·g-1,12.0 ng DEQ·g-1and 51.5 μg TEQ·g-1in sediments.Seasonal variations were observed for the four hormonal activities in surface water.Sites with relatively higher estrogenic activity were located at Wuhan,Nanjing-Wuhu sections and the outlet of Poyang Lake.However no obvious regional differences were observed for the other three hormonal activities.The hormonal activities in the river were positively correlated to the general environmental parameters such as local population,organic matter,and ammonia nitrogen,suggesting that environmental hormones are mainly originated from the wastewater discharge due to human activities.A preliminary risk assessment showed a high estrogenic risk level at the site of Poyang Lake,with medium risk levels in the rest sites.For the all study sites,no high androgenic risks were found in surface water.The results of this study provide better understanding of the pollution characteristics of those chemicals with hormonal activities in the middle and lower reaches of Yangtze River, which can help take proper control measures.

hormonal activities;estrogenic activity;Yangtze River;endocrine disruption;ecological risk assessment

2015-06-16 錄用日期：2015-08-17

1673-5897（2016）3-191-13

X171.5

A

10.7524/AJE.1673-5897.20150616001

簡介：趙建亮(1979—)，男，環(huán)境科學博士，副研究員，主要研究方向新型污染物化學及其生態(tài)毒理，發(fā)表學術(shù)論文70余篇。

應光國(1964—)，男，環(huán)境科學博士，研究員，主要研究方向為新型環(huán)境污染物化學、污染物生態(tài)毒理、水質(zhì)提高技術(shù)、以及流域污染與風險管控技術(shù)的研究，發(fā)表學術(shù)論文150余篇。

國家水體污染控制與治理科技重大專項(2014ZX07206-005)；廣州市環(huán)保局污染防治新技術(shù)新工藝開發(fā)項目

陳曉雯(1991-)，女，碩士，研究方向為環(huán)境新型有機污染物的生態(tài)毒理學效應，E-mail:chen_xiaowen@foxmail.com；

*通訊作者（Corresponding author），E-mail:zhaojianliang@gig.ac.cn

#共同通訊作者（Co-corresponding author），E-mail:guang-guo.ying@gig.ac.cn