蘇連水，楊桂玲，吳聲敢，皮天星，王強(qiáng),*

1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院農(nóng)藥系，南京210095

2.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究所，杭州310021

三唑磷和氯氟氰菊酯對(duì)蚯蚓的聯(lián)合毒性效應(yīng)

蘇連水1,2，楊桂玲2，吳聲敢2，皮天星2，王強(qiáng)2,*

1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院農(nóng)藥系，南京210095

2.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究所，杭州310021

近年來(lái)農(nóng)藥復(fù)配使用成為普遍現(xiàn)象，它對(duì)生態(tài)的危害是否有別于農(nóng)藥單獨(dú)使用？采用OECD人工土壤法，通過(guò)急性毒性、回避行為及抗氧化酶(CAT、POD、SOD)活性3個(gè)生態(tài)響應(yīng)水平，研究三唑磷和氯氟氰菊酯對(duì)蚯蚓的聯(lián)合毒性效應(yīng)。結(jié)果表明：三唑磷對(duì)蚯蚓7 d和14 d的半數(shù)致死濃度(LC50)分別為331.1 mg·kg-1和122.0 mg·kg-1；氯氟氰菊酯對(duì)蚯蚓7 d LC50和14 d LC50分別為897.9 mg·kg-1和656.7 mg·kg-1。2種農(nóng)藥按毒性比1:1復(fù)配，表現(xiàn)為協(xié)同作用。三唑磷和氯氟氰菊酯對(duì)蚯蚓48 h的半數(shù)回避濃度(AC50)分別是41.6 mg·kg-1和6.0 mg·kg-1，兩者亦表現(xiàn)為協(xié)同作用。經(jīng)2種農(nóng)藥單獨(dú)處理，蚯蚓體內(nèi)CAT活性呈現(xiàn)輕微上升后下降，而POD和SOD活性無(wú)明顯變化；復(fù)配導(dǎo)致POD活力顯著上升，而CAT和SOD活力則顯著下降。研究表明：三唑磷和氯氟氰菊酯復(fù)配呈現(xiàn)協(xié)同作用，增強(qiáng)彼此對(duì)蚯蚓的毒性作用，增大土壤生態(tài)危害風(fēng)險(xiǎn)；聯(lián)合效應(yīng)的產(chǎn)生與其阻斷神經(jīng)傳導(dǎo)這一共同靶標(biāo)有關(guān)。

三唑磷；氯氟氰菊酯；次子愛(ài)勝蚓；急性毒性；聯(lián)合毒性；抗氧化酶活性

蘇連水,楊桂玲,吳聲敢,等.三唑磷和氯氟氰菊酯對(duì)蚯蚓的聯(lián)合毒性效應(yīng)[J].生態(tài)毒理學(xué)報(bào)，2016,11(3):294-301

Su L S,Yang G L,Wu S G,et al.The single and joint toxicity of tiazophos and cyhalothrin to earthworm[J].Asian Journal of Ecotoxicology,2016,11 (3):294-301(in Chinese)

農(nóng)藥混合污染聯(lián)合效應(yīng)廣泛存在，傳統(tǒng)意義只關(guān)注單一毒性效應(yīng)而忽視聯(lián)合毒性效應(yīng)的評(píng)價(jià)，低估了污染物危害風(fēng)險(xiǎn)和潛在威脅。許多研究表明，重金屬與重金屬，農(nóng)藥與重金屬，農(nóng)藥與農(nóng)藥之間對(duì)魚(yú)類[1]、蚤類[2]、蚯蚓[3]及哺乳類[4]等生物具有明顯的聯(lián)合毒性效應(yīng)。研究生產(chǎn)常見(jiàn)混配農(nóng)藥間聯(lián)合作用效應(yīng)，正確評(píng)估多種污染物同時(shí)存在的生態(tài)健康風(fēng)險(xiǎn)得到越來(lái)越多的關(guān)注。

現(xiàn)階段，通常依據(jù)農(nóng)藥對(duì)一系列生態(tài)系統(tǒng)中的代表性動(dòng)物來(lái)評(píng)估農(nóng)藥的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)。蚯蚓是土壤生物量最大的無(wú)脊椎動(dòng)物，在土壤物理性質(zhì)的改良以及植物營(yíng)養(yǎng)循環(huán)方面具有重要作用[5]。利用蚯蚓指示土壤污染狀況，已經(jīng)成為土壤污染生態(tài)毒理診斷的一個(gè)重要指標(biāo)[6]。目前大多數(shù)研究只考慮急性暴露條件下污染物對(duì)蚯蚓的致死效應(yīng)[7-8]，但是污染物在非致死條件下對(duì)蚯蚓的亞急性毒性效應(yīng)，如行為、抗氧化酶、繁殖等[9-12]更接近實(shí)際生態(tài)系統(tǒng)中低劑量污染物對(duì)蚯蚓的長(zhǎng)期毒性效應(yīng)，然而目前這方面研究還比較薄弱，在農(nóng)藥生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估上應(yīng)用很少。

擬除蟲(chóng)菊酯農(nóng)藥是土壤中普遍殘留的典型內(nèi)分泌干擾物(EDCs)[13-14]，EDCs對(duì)人類健康和生態(tài)系統(tǒng)的危害在國(guó)際上日益受到關(guān)注[15]，在我國(guó)菜地土壤中檢出率高達(dá)60%[16-17]；有機(jī)磷農(nóng)藥在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)占農(nóng)藥使用量60%～70%[18]。擬除蟲(chóng)菊酯和有機(jī)磷的二元混配是常見(jiàn)的混配方式，在混合農(nóng)藥中占有重要地位[19]。目前還沒(méi)有三唑磷和氯氟氰菊酯對(duì)蚯蚓的毒性效應(yīng)相關(guān)研究報(bào)道。

本文選用赤子愛(ài)勝蚓(Eisenia foetida)為供試生物，研究三唑磷和氯氟氰菊酯對(duì)蚯蚓的急性毒性、回避行為及抗氧化活性聯(lián)合效應(yīng)。通過(guò)不同的實(shí)驗(yàn)對(duì)2種農(nóng)藥的聯(lián)合毒性效應(yīng)進(jìn)行比較全面的評(píng)估，旨在了解農(nóng)藥復(fù)配后對(duì)蚯蚓的毒性影響的變化，對(duì)復(fù)合生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法（Materials and methods）

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

赤子愛(ài)勝蚯蚓(Eisenia foetida)，購(gòu)買于浙江大學(xué)動(dòng)物科學(xué)院蚯蚓養(yǎng)殖場(chǎng)。先預(yù)養(yǎng)一段時(shí)間，再挑選2月齡以上，環(huán)帶明顯，體重300～400 mg的健康蚯蚓作為供試生物。

試劑：85%三唑磷原藥，95%氯氟氰菊酯原藥，由浙江新農(nóng)化工農(nóng)藥有限公司提供。3種抗氧化酶試劑盒及蛋白定量測(cè)試盒，購(gòu)自于南京建成生物研究所。

儀器：紫外分光光度計(jì)(TU-1810PC，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司)；水浴鍋(Hestion，TEC 2601，常州思琳醫(yī)用儀器有限公司)；攪拌機(jī)(ISO-679，無(wú)錫市建工試驗(yàn)儀器設(shè)備有限公司)；超聲波清洗器(KQ2200，昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 人工土壤法

人工土壤根據(jù)OECD guideline 207提供方法配制[20]。將藥劑用丙酮和吐溫溶解后拌于10 g石英砂中，待丙酮完全揮發(fā)后與490 g人工土壤混勻，加入蒸餾水，使土壤含水量為35%左右。將上述含藥劑的土壤放入500 mL標(biāo)準(zhǔn)玻璃瓶中，再向玻璃瓶中加入10條在未經(jīng)農(nóng)藥處理的人工土壤中馴養(yǎng)1 d的蚯蚓。用塑料薄膜封住玻璃瓶瓶口，然后用解剖針把塑料薄膜扎孔后置于(20±1)℃，濕度為80%～ 85%的恒溫箱中連續(xù)光照培養(yǎng)(光照強(qiáng)度為400～ 800 lx)。每種藥劑設(shè)6個(gè)濃度，每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)重復(fù)，同時(shí)設(shè)1個(gè)不含藥劑的空白對(duì)照組。試驗(yàn)第7天和14天各計(jì)數(shù)1次，記錄死亡數(shù)及中毒癥狀，以蚯蚓前尾部對(duì)機(jī)械刺激無(wú)反應(yīng)視為死亡。

1.2.2 回避行為實(shí)驗(yàn)法

將容器中放置一隔板，將其分為2部分。在其中一側(cè)加入清潔土壤500 g(干重)，另一側(cè)加入含有已知濃度的含藥劑處理的土壤500 g(干重)，加入蒸餾水混勻，使土壤含水量為35%左右，抽去隔板，將15條蚯蚓放入原隔板處，以薄膜封頂防止蚯蚓逃出反應(yīng)容器，用解剖針把薄膜扎孔，48 h后將隔板插入原位置，阻止蚯蚓進(jìn)一步逃逸，手動(dòng)挑出兩側(cè)土壤中蚯蚓。在48 h內(nèi)，蚯蚓反應(yīng)體系溫度保持在(20± 1)℃，光照強(qiáng)度為400～800 lx。

1.3 聯(lián)合毒性評(píng)價(jià)方法

按改進(jìn)的Marking聯(lián)合效應(yīng)的相加指數(shù)法(Additional Index)進(jìn)行評(píng)定[21]。根據(jù)公式求S：S=Am/Ai+Bm/Bi，式中，S為各毒物的毒性相加之和；Ai，Bi為單一農(nóng)藥的LC50；Am，Bm為復(fù)配農(nóng)藥中各單一農(nóng)藥的LC50。當(dāng)S≦1時(shí),AI=1/S-1.0；當(dāng)S>1時(shí),AI= 1.0-S。用相加指數(shù)(AI)評(píng)價(jià)農(nóng)藥的聯(lián)合效應(yīng)：AI> 0.25時(shí)為協(xié)同作用；AI<-0.2時(shí)為頡抗作用；當(dāng)-0.2< AI<0.25時(shí)為相加作用。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用DPS7.05軟件處理急性毒性試驗(yàn)的7 d LC50、14 d LC50和回避試驗(yàn)48 h AC50；采用SPSS 19.0軟件對(duì)抗氧化酶活性毒性試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，對(duì)處理組和對(duì)照組進(jìn)行One-way ANOVA檢驗(yàn)差異性分析。

2 結(jié)果（Results）

2.1 蚯蚓急性毒性試驗(yàn)

單一及聯(lián)合急性毒性的LC50分別如表1和表2所示。2種農(nóng)藥對(duì)蚯蚓的急性毒性隨暴露濃度增大和暴露時(shí)間延長(zhǎng)，死亡率呈上升態(tài)勢(shì)。14 d實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)土壤中三唑磷濃度大于506.45 mg·kg-1時(shí)，蚯蚓死亡率達(dá)到100%，土壤農(nóng)藥濃度63.30、126.61、253.22 mg·kg-1對(duì)應(yīng)死亡率分別為15%、50%、90%。死亡蚯蚓于燒杯內(nèi)壁，發(fā)生糜爛降解；未死亡蚯蚓，體重下降，體長(zhǎng)變短，呈卷曲、僵硬、消瘦癥狀，身體表皮有黃色貼液體滲出，對(duì)外界刺激敏感度很低(圖1-a)；當(dāng)土壤中氯氟氰菊酯濃度大于1 439.80 mg·kg-1時(shí)，蚯蚓死亡率達(dá)到100%，土壤農(nóng)藥濃度359.95、719.90 mg·kg-1各自的死亡率分別為20%和40%。未死亡蚯蚓呈體重下降、變細(xì)長(zhǎng)癥狀(圖1-b)，對(duì)外界刺激敏感度相對(duì)較高。三唑磷和氯氟氰菊酯按毒性比1:1復(fù)配增大農(nóng)藥對(duì)蚯蚓的急性毒性，其中三唑磷7 d和14 d的半致死濃度由單劑的331.10和122.00 mg·kg-1下降為23.17和5.94 mg·kg-1,毒性增大14.3和20.5倍；氯氟氰菊酯的LC50由單劑的897.90和656.70 mg·kg-1下降為138.15和35.41 mg ·kg-1，毒性增大6.5和18.5倍。7 d和14 d相加指數(shù)AI分別為3.55和9.00(>0.25為協(xié)同作用)，判定三唑磷和氯氟氰菊酯的聯(lián)合作用方式為協(xié)同作用。

2.2 蚯蚓回避行為試驗(yàn)

圖1 蚯蚓受三唑磷（a）和氯氟氰菊酯（b）暴露后的形態(tài)

表1 三唑磷和氯氟氰菊酯對(duì)蚯蚓急性毒性效應(yīng)Table 1 The acute toxicity of tiazophos and cyhalothrin to earthworm

表2 三唑磷和氯氟氰菊酯蚯蚓的聯(lián)合毒性效應(yīng)Table 2 The combined acute toxicity of tiazophos and cyhalothrin to earthworm

三唑磷和氯氟氰菊酯對(duì)蚯蚓的回避行為結(jié)果如圖2。隨著各個(gè)處理藥液濃度的增大，蚯蚓回避率都顯著增大，其中混配三唑磷和混配氯氟氰菊酯處理濃度達(dá)到79.06和12.24 mg·kg-1時(shí)，回避率達(dá)到100%。從表3得知，三唑磷和氯氟氰菊酯48 h的半數(shù)回避濃度AC50分別是41.60和6.02 mg·kg-1；混劑-三唑磷和混劑-氯氟氰菊酯的AC50分別是7.16和1.13 mg·kg-1。聯(lián)合作用致使回避毒性分別增大了5.8倍和5.3倍。相加指數(shù)AI為1.78，表明三唑磷和氯氟氰菊酯對(duì)蚯蚓具有協(xié)同回避毒性效應(yīng)。

圖2 三唑磷和氯氟氰菊酯對(duì)蚯蚓的回避毒性效應(yīng)

2.3 三唑磷和氯氟氰菊酯對(duì)蚯蚓抗氧化酶活性影響

2.3.1 三唑磷和氯氟氰菊酯對(duì)蚯蚓CAT酶活性影響

三唑磷和氯氟氰菊酯對(duì)蚯蚓的CAT酶活性影響如圖3。圖3-a為三唑磷對(duì)蚯蚓CAT酶活性影響，蚯蚓酶活性整體隨時(shí)間延長(zhǎng)而降低。其中第2天處理組酶活性有所上升，但無(wú)明顯的濃度-效應(yīng)關(guān)系；第7天處理組酶活性明顯下降，11.16和44.63 mg· kg-1處理組蚯蚓酶活性顯著下降(P<0.05)；第14天處理組蚯蚓(2.79，11.16和44.63 mg·kg-1)酶活性極顯著下降(P<0.01)。圖3-b為氯氟氰菊酯對(duì)蚯蚓CAT酶影響，蚯蚓酶活性整體隨時(shí)間延長(zhǎng)變化不大，其中第2天，處理組酶活性受誘導(dǎo)上升，第7天處理組酶活都(21.80，87.21和348.84 mg·kg-1)顯著上升(P<0.05)。圖3-c為聯(lián)合暴露對(duì)蚯蚓CAT酶活性影響，酶活性總體隨時(shí)間延長(zhǎng)變化不大，第2天處理組(11.16+87.21)mg·kg-1和(44.63+348.84)mg·kg-1酶活性顯著及極顯著誘導(dǎo)上升，第7天該2個(gè)處理組酶活性則都極顯著誘導(dǎo)上升。CAT酶活性影響試驗(yàn)表明：亞致死濃度暴露下，三唑磷和氯氟氰菊酯對(duì)蚯蚓體內(nèi)CAT酶活性具有明顯的影響作用，三唑磷抑制蚯蚓體內(nèi)酶活性，氯氟氰菊酯起誘導(dǎo)作用。聯(lián)合作用與單劑作用比較結(jié)果發(fā)現(xiàn)氯氟氰菊酯對(duì)三唑磷聯(lián)合效應(yīng)隨時(shí)間(2-7-14 d)變化為：協(xié)同-拮抗-拮抗，三唑磷對(duì)氯氟氰菊酯聯(lián)合效應(yīng)隨時(shí)間(2-7-14 d)變化為：協(xié)同-協(xié)同-協(xié)同。

2.3.2 三唑磷和氯氟氰菊酯對(duì)蚯蚓POD酶活性影響

圖3 三唑磷（a）和氯氟氰菊酯（b）單獨(dú)及聯(lián)合（c）作用下蚯蚓體內(nèi)CAT酶活性變化

表3 三唑磷和氯氟氰菊酯對(duì)蚯蚓的回避毒性效應(yīng)Table 3 The avoidance toxicity of tiazophos and cyhalothrin to earthworm

三唑磷和氯氟氰菊酯對(duì)蚯蚓POD酶活性活性影響如圖4。圖4-a為三唑磷對(duì)蚯蚓POD酶活性的影響，不同實(shí)驗(yàn)時(shí)期對(duì)照組和處理組蚯蚓酶活性并無(wú)明顯差異。圖4-b為氯氟氰菊酯對(duì)蚯蚓POD酶活性的影響，其中第2天處理組蚯蚓受藥液影響，酶活性有所上升，第7天則輕微下降。圖4-c為三唑磷和氯氟氰菊酯聯(lián)合暴露對(duì)蚯蚓POD酶活性影響，隨著暴露濃度上升，酶活性受到明顯誘導(dǎo)，第2天的處理組(44.63+348.84)mg·kg-1和第7天的(11.16+ 87.21)mg·kg-1、(44.63+348.84)mg·kg-1酶活性都極顯著誘導(dǎo)上升。POD酶活性影響試驗(yàn)表明：亞致死濃度暴露下，三唑磷和氯氟氰菊酯對(duì)蚯蚓體內(nèi)POD酶影響不大，聯(lián)合暴露顯著誘導(dǎo)蚯蚓體內(nèi)POD酶活性上升。

圖4 三唑磷（a）和氯氟氰菊酯（b）單獨(dú)及聯(lián)合（c）作用下蚯蚓體內(nèi)POD酶活性變化

圖5 三唑磷（a）和氯氟氰菊酯（b）單獨(dú)及聯(lián)合（c）作用下蚯蚓體內(nèi)SOD酶活性變化

2.3.3 三唑磷和氯氟氰菊酯對(duì)蚯蚓SOD酶活性影響三唑磷和氯氟氰菊酯對(duì)蚯蚓SOD酶活性影響如圖5。圖5-a為三唑磷對(duì)蚯蚓SOD酶活性影響，三唑磷抑制蚯蚓體內(nèi)SOD酶活性。圖5-b為氯氟氰菊酯對(duì)蚯蚓SOD酶活性影響，處理組氯氟氰菊酯濃度87.21和348.84 mg·kg-1顯著誘導(dǎo)SOD酶活性上升。圖5-c為聯(lián)合暴露對(duì)蚯蚓SOD酶活性影響，第2天處理組酶活受到抑制，第7天處理組酶活性為負(fù)值，可能是由于農(nóng)藥對(duì)蚯蚓產(chǎn)生重度脅迫影響，導(dǎo)致體內(nèi)SOD酶系統(tǒng)失去平衡。SOD酶活性影響試驗(yàn)表明：亞致死濃度暴露下，三唑磷抑制蚯蚓體內(nèi)SOD酶活性，氯氟氰菊酯誘導(dǎo)SOD酶活性，聯(lián)合暴露導(dǎo)致的蚯蚓體內(nèi)SOD酶系統(tǒng)失調(diào)紊亂。

3 討論（Discussion）

本研究通過(guò)致死和亞致死兩方面探討三唑磷和氯氟氰菊酯對(duì)蚯蚓的單一及聯(lián)合毒性效應(yīng)。急性毒性效應(yīng)實(shí)驗(yàn)(表1)中蚯蚓死亡率與三唑磷和氯氟氰菊酯暴露濃度呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，死亡率適合作為兩者土壤殘留量的定量表征。三唑磷和氯氟氰菊酯協(xié)同作用的實(shí)驗(yàn)結(jié)果與某些類似的研究結(jié)果有異同之處，趙玉琴等[22]發(fā)現(xiàn)氰戊菊酯和辛硫磷混配在24 h和48 h對(duì)鰱魚(yú)的毒性效應(yīng)為協(xié)同作用，在72 h和96 h卻表現(xiàn)為拮抗作用，而其他的有機(jī)磷及氯氟氰菊酯都為拮抗作用，農(nóng)藥間的聯(lián)合效應(yīng)方式與多方面有關(guān)：1)農(nóng)藥的種類，不同種類農(nóng)藥的結(jié)構(gòu)不同，對(duì)生物顯示不同的作用機(jī)理；2)生物種類，不同生物對(duì)外源性毒物代謝方式表現(xiàn)有差異；3)作用時(shí)間，復(fù)配農(nóng)藥在體內(nèi)在不同時(shí)間段具有不同的聯(lián)合效應(yīng)，一方面是因?yàn)檗r(nóng)藥在體內(nèi)代謝先后順序有關(guān)，不同時(shí)間段農(nóng)藥在體內(nèi)的殘留量不同，導(dǎo)致聯(lián)合作用方式也不同；另一方面是因?yàn)椴煌瑫r(shí)間段生物對(duì)外源性毒物的抗毒能力有差別；4)復(fù)配濃度，復(fù)配濃度影響作用強(qiáng)度和進(jìn)入機(jī)體的速度。本文按1:1的等毒性當(dāng)量復(fù)配證明2種農(nóng)藥具有協(xié)同作用，但是不能肯定其他配比是否相似結(jié)果，當(dāng)配比差足夠大的情況下，可能就表現(xiàn)為相加作用了。

回避實(shí)驗(yàn)是利用生物體趨利避害行為作為實(shí)驗(yàn)原理。通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，只有達(dá)到一定的暴露濃度才會(huì)產(chǎn)生比較明顯的回避行為。一方面跟農(nóng)藥本身的氣味性和揮發(fā)程度有關(guān)，另一方面與蚯蚓個(gè)體對(duì)農(nóng)藥氣味的承受力有關(guān)，因此導(dǎo)致回避率與暴露濃度間未呈良好的線性關(guān)系?；乇軐?shí)驗(yàn)表明三唑磷和氯氟氰菊酯具有協(xié)同作用。

抗氧化酶(CAT、POD、SOD)常作為環(huán)境污染檢測(cè)的分子生物標(biāo)志物，眾所周知不同類型的農(nóng)藥混合可以促進(jìn)農(nóng)藥對(duì)生物體內(nèi)氧化系統(tǒng)應(yīng)激的刺激效應(yīng)[23]。正常生理?xiàng)l件下生物體內(nèi)活性氧與抗氧化酶防御系統(tǒng)處于動(dòng)態(tài)平衡，當(dāng)抗氧化防御系統(tǒng)不能消除機(jī)體產(chǎn)生的活性氧時(shí)，則導(dǎo)致氧化應(yīng)激。從蚯蚓抗氧化酶(CAT、POD、SOD)對(duì)三唑磷和氯氟氰菊酯的動(dòng)態(tài)響應(yīng)試驗(yàn)中可以發(fā)現(xiàn)(圖3，圖4，圖5)，不同類型抗氧化酶對(duì)不同農(nóng)藥的氧化脅迫具有不同的響應(yīng)方式。CAT酶在抗氧化機(jī)制中發(fā)揮著關(guān)鍵的作用，它將過(guò)氧化氫(H2O2)轉(zhuǎn)化為氧氣(O2)和水(H2O)[10]。CAT酶隨著三唑磷濃度的升高，酶受到抑制活力下降，隨著氯氟氰菊酯濃度升高，酶受到誘導(dǎo)活力上升；蚯蚓受外來(lái)干擾物刺激，產(chǎn)生超出正常范圍內(nèi)的過(guò)氧化氫，CAT為了維持動(dòng)態(tài)平衡，酶活性增強(qiáng)，消除過(guò)量的H2O2，但隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，H2O2的不斷積累，導(dǎo)致CAT酶受到抑制下降。有研究表明蚯蚓經(jīng)過(guò)受甲基嘧啶磷和溴氰菊酯單獨(dú)污染的土壤暴露后，體內(nèi)的CAT酶在第1天酶活性受誘導(dǎo)上升，在3、6、10、15、21、28 d都受到抑制[24]，這與本文研究結(jié)果具有相似之處。過(guò)氧化物酶POD一般被認(rèn)為是與過(guò)氧化氫酶CAT具有相似的存在意義，本文研究發(fā)現(xiàn)該酶活性對(duì)三唑磷和氯氟氰菊酯未表現(xiàn)出明顯的響應(yīng)反應(yīng),這可能與受試農(nóng)藥的濃度有關(guān)，因?yàn)椴煌拿傅难趸瘧?yīng)激平衡受外來(lái)脅迫的能力不同；超氧化物歧化酶SOD是消除氧自由基，合成過(guò)氧化物的金屬酶，研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)對(duì)三唑磷和氯氟氰菊酯的響應(yīng)類型與CAT酶類似，酶活力受三唑磷抑制下降，而受氯氟氰菊酯誘導(dǎo)上升，但SOD酶更加敏感。這些結(jié)果與某些學(xué)者研究具有類似之處[3]。因?yàn)槊妇哂胁环€(wěn)定性和生物代謝復(fù)雜性，所以很難確定具體的聯(lián)合作用效應(yīng)，有待結(jié)合基因表達(dá)進(jìn)行深入探討研究。

農(nóng)藥聯(lián)合作用效應(yīng)的產(chǎn)生是由于2種或2種以上藥物間在物理化學(xué)、生理生化、藥效(或生物活性)等方面的相互影響，包括穿透和運(yùn)輸、代謝過(guò)程、貯存過(guò)程、對(duì)靶標(biāo)的聯(lián)合作用。三唑磷和氯氟氰菊酯有共同的作用靶標(biāo)器官(神經(jīng))但作用機(jī)理不同。三唑磷通過(guò)抑制腦突觸體膜上的腺苷三磷酸酶(ATPase)，使突觸膜上的乙酰膽堿酯酶等神經(jīng)遞質(zhì)大量聚集，從而引起乙酰膽堿酯酶被抑制，造成靶標(biāo)生物過(guò)度興奮而死[25]。氯氟氰菊酯主要作用靶標(biāo)是神經(jīng)細(xì)胞膜上鈉離子通道，干擾鈉離子通道的門控動(dòng)力學(xué)，在膜去極化期間減緩失活，延長(zhǎng)鈉離子電流，引起重復(fù)后放和神經(jīng)傳導(dǎo)的阻斷[26]。有研究表明有機(jī)磷殺蟲(chóng)劑與擬除蟲(chóng)菊酯對(duì)桃蚜和棉蚜有協(xié)同作用，主要機(jī)制在于前者能抑制羧酸酯酶的活性，而羧酸酯酶能夠水解擬除蟲(chóng)菊酯[27]。本文認(rèn)為，三唑磷和氯氟氰菊酯對(duì)蚯蚓的協(xié)同作用與其阻斷神經(jīng)傳導(dǎo)這一共同靶標(biāo)有關(guān)。

本文從急性毒性、回避行為、抗氧化酶活性三方面探討農(nóng)藥聯(lián)合作用對(duì)生態(tài)的風(fēng)險(xiǎn)影響，只是針污染物對(duì)受試生物個(gè)體水平表觀影響，但生態(tài)環(huán)境健康與群體關(guān)聯(lián)更緊密，因此后續(xù)工作將研究農(nóng)藥對(duì)蚯蚓的繁殖毒性影響。蚯蚓常作為土壤生態(tài)污染的指示生物，但是評(píng)價(jià)污染物對(duì)生態(tài)的影響不能只局限于一種生物，通過(guò)選取水生生物(如斑馬魚(yú)、大型溞，藻類等)進(jìn)行藥效研究可能會(huì)更全面的反應(yīng)農(nóng)藥的聯(lián)合作用效應(yīng)。

綜上所述，結(jié)果表明：(1)三唑磷和氯氟氰菊酯按等毒比復(fù)配對(duì)蚯蚓具有協(xié)同作用，彼此增大毒性。(2)蚯蚓的死亡率與農(nóng)藥濃度呈現(xiàn)良好的劑量-效應(yīng)關(guān)系，適合作為兩者土壤殘留量的定量表征終點(diǎn)，回避率與濃度沒(méi)有良好的線性關(guān)系，不適合作為定量表征終點(diǎn)。(3)三唑磷和氯氟氰菊酯復(fù)配可能增大生態(tài)危害風(fēng)險(xiǎn)，農(nóng)業(yè)生產(chǎn)過(guò)程中應(yīng)合理使用。

（References）：

[1] 孟順龍,宋超,徐跑.農(nóng)藥滅多威和辛硫磷對(duì)羅非魚(yú)的聯(lián)合毒性研究[J].農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào),2014,33(2):257-263

Meng S L,Song C,Xu P.Joint toxicity of pesticides methomyl and phoxim to tilapia(Oreochromis niloticus) [J].Journal of Agro-Environment Science,2014,33(2): 257-263(in Chinese)

[2] 張融,范文宏.水體中重金屬鎘和鋅對(duì)大型蚤聯(lián)合毒性效應(yīng)的初步研究[J].生態(tài)毒理學(xué)報(bào),2008,3(3):286-290

Zhang R,Fan W H.A preliminary study on joint toxic effects of Cd and Zn onDaphnia magna[J].Asian Journal of Ecotoxucology,2008,3(3):286-290(in Chinese)

[3] 劉文麗,徐冬梅.異丙甲草胺對(duì)蚯蚓體重及酶活性的影響[J].環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào),2007,27(12):2025-2031

Liu W L,Xu D M.Effect of metolachlor on the weight and enzyme activities of earthworms[J].Acta Science Circumstantiae,2007,27(12):2025-2031(in Chinese)

[4] 盧春鳳,王以美.2,3,7,8-四氯二苯并二噁英和Aroclor 1254對(duì)大鼠睪丸的單獨(dú)和聯(lián)合毒性效應(yīng)[J].生態(tài)毒理學(xué)報(bào),2009,4(1):63-68

Lu C F,Wang Y M.The alone and combined toxic effects of 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin and aroclor 1254 on tests of rats[J].Asian Journal of Ecotoxicology,2009, 4(1):63-68(in Chinese)

[5] Cortez J,Bouche M.Decomposition of mediterranean leaf litters byNicodrilus meridionalis(Lumbricidae)in laboratory and field experiments[J].Archives of Environmental Contamination and Toxicology,2001,15(5):17-23

[6] Chang L W,Meier J R.Application of plant and earthworm bioassays to evaluate remediation of a lead contaminated soil[J].Archives of Environmental Contamination and Toxicology,1997,32(2):166-171

[7] 左海根,林玉鎖,龔瑞忠.土壤中呋喃丹殺蟲(chóng)雙p’p-DDT對(duì)蚯蚓的單一及復(fù)合毒性的研究[J].農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào),2005,24:861-864

Zuo H G,Lin Y S,Gong R Z.Single and binary-combined toxicology of carbofuran,dimehypo and p’p-DDT on earthworms[J].Journal of Agro-Environment Science, 2005,24:861-864(in Chinese)

[8] Rombke J,Garcia M,Scheffczyk A.Effect of the fungicide benomyl on earthworms in laboratory tests under tropical and temperate conditions[J].Archives of Environmental Contamination and Toxicology,2007,53:590-598

[9] Helling B,Reinecke S A,Reinecke A J.Effect of the fungicide copper oxychloride on the growth and reproduction ofEisenia fetida(Oligochaeta)[J].Ecotoxicology and Environmental Safety,2000,46:108-116

[10] Ribera D,Narbonne J F,Arnaud C.Biochemical responses of the earthwormEisenia fetida andreiexposed to contaminated artificial soil,effects of carbaryl[J].Soil Biology&Biochemistry,2001,33:1123-1130

[11] Capowiez Y,Bastardie F,Costagliola G.Sublethal effects of imidacloprid on the burrowing behaviour of two earthworm species:Modifications of the 3D burrow systems in artificial cores and consequences on gas diffusion in soil [J].Soil Biology and Biochemistry,2006,38:285-293

[12] Reinecke S A,Reinecke A J.Biomarker response and biomass change of earthworms exposed to chlorpyrifos in microcosms[J].Ecotoxicology and Environmental Safety, 2007,66:92-101

[13] Casida J E,Gammon D W,Glickman A H,et al.Mechanisms of selective action of pyrethroid insecticides[J]. Annual Review of Pharmacology and Toxicology,1983, 23(1):413-438

[14] Moore A,Waring C P.The effect of a synthetic pyrethroid pesticide on some aspects of resproduction in Atllantic salmon(Salmo salarL.)[J].Aquatic Toxicology,2011,52 (1):1-12

[15] Vomsaal F S,Timms B G,Montano M M,et al.Prostate enlargement in mice due to fetal exposure to low doses of estradiol or diethylstilbestrol and opposite effect at high doses[J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America,1997,94(5):2056-2061

[16] 吳曉晨,安瓊,董元華.蘇南某市春季蔬菜中農(nóng)藥殘留調(diào)查[J].農(nóng)村生態(tài)環(huán)境,2004,20(3):49-52

Wu X C,An Q,Dong Y H.Residues of pesticides in spring vegetables in southern Jiangsu,China[J].Rural Eco-Environment,2004,20(3):49-52(in Chinese)

[17] 尹可鎖,張雪燕,徐漢虹.滇池周邊農(nóng)田中擬除蟲(chóng)菊酯農(nóng)藥殘留研究[J].西南農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),2011,24(4):1367-1371

Yin K S,Zhang X Y,Xu H H.Study on characteristics of pyrethroid pesticides residues in Dianchi lakeshed[J]. Southwest China Journal of Agricultural Sciences,2011, 24(4):1367-1371(in Chinese)

[18] 王心如.擬除蟲(chóng)菊酯與有機(jī)磷農(nóng)藥的聯(lián)合毒性與毒理學(xué)機(jī)制研究[D].南京:南京農(nóng)業(yè)大學(xué),2000

Wang X R.Studies on the joint action and poisoning mechanism of the organophosphorus and pyrethroid pesti-cides[D].Nanjing:Nanjing Agricultural University,2000 (in Chinese)

[19] 朱魯生,樊德方.辛硫磷、甲氰菊酯及其混劑對(duì)蚯蚓的毒性及安全性評(píng)價(jià)[J].浙江農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),1999,25(1): 77-80

Zhu L S,Fan D F.Toxicity and evaluation of phoxim, fenpropathhrin and their mixture to earthworm[J].Journal of Zhejiang Agricultural University,1999,25(1):77-80 (in Chinese)

[20] Organization for Economic Cooperation and Development (OECD).Test 207:Earthworm,Acute Toxicity Tests[R]. Paris:OECD,1984

[21] Marking L L.An approach for additive toxicity of chemical mixtures[M]//Mayor L L,Hamelink J L.eds.Aquatic toxicology and hazard evaluation.Philadelphia:American Society for Testing and Materials,1977

[22] 趙玉琴,李麗娜,李建華.常見(jiàn)擬除蟲(chóng)菊酯和有機(jī)磷農(nóng)藥對(duì)魚(yú)類的急性及其聯(lián)合毒性研究[J].環(huán)境污染與防治,2008,30(11):53-57

Zhao Y Q,Li L N,Li J H.Study of acute and joint toxicity of common pyrethroid and organophosphate pesticides to fish[J].Environmental Pollution and Control,2008,30 (11):53-57(in Chinese)

[23] Banerjee B D,Seth V,Ahmed R S.Pesticide-induced oxidative stress:Perspectives and trends[J].Reviews on Environmental Health,2001,16(1):1-40

[24] Velki M,Hackenberger B K.Biomaker responses in earthwormEisenia andreiexposed to pirimiphos-methyl and deltamethrin using different toxicity test[J].Chemosphere,2013,90(3):1216-1226

[25] Cassee F R.Toxicological evaluation and risk assessment of chemical mixtures[J].Critical Reviews in Toxicology, 1998,8(1):73-101

[26] Tang Z H,Li W M.Molecular biology of resistance evolution in insects[M].Beijing:Chinese Agricultural Press, 1996

[27] Tang J X,Liste H H.Chemical assays of availability to earthworm of polyclic aromatic hydrocarbons in soil[J]. Chemosphere,2002,48(l):35-42◆

The Single and Joint Toxicity of Tiazophos and Cyhalothrin to Earthworm

Su Lianshui1,2,Yang Guiling2,Wu Shenggan2,Pi Tianxing2,Wang Qiang2,*

1.College of Plant Protection,Nanjing Agricultural University,Nanjing 210095,China
2.Institite of Quality Standards for Agro-products,Zhejiang Academy of Agricultural Sciences,Hangzhou 310021,China

9 December 2015 accepted 26 January 2016

The usage of pesticide mixture has been a common method for agriculture which may have many differences with the single use of pesticide.The joint toxicity effect of tiazophos and cyhalothrin to earthworm were studied using OECD artificial soil method.Acute toxicity,adviodance behavior and antioxidant enzyme activities (CAT,POD,SOD)were observed.The result indicated that 7 d-LC50and 14 d-LC50of tiazophos are 331.1 mg· kg-1and 122.0 mg·kg-1in acute toxicity test;7 d-LC50and 14 d-LC50of cyhalothrin are 897.9 mg·kg-1and 656.7 mg·kg-1.The mixture with the ratio of 1:1 of toxic unit showed synergistic effect.The medium concentration for avoidance behavior(AC50)of tiazophos is 41.6 mg·kg-1and of cyhalothrin is 6.0 mg·kg-1in adviodance behavior experiment.The mixture showed synergistic effect.Enzyme activities test indicated that CAT activity rose after decreased whenEisenia foetidawas exposed to two pesticide singly.The POD activity increased in the joint expo-sure.The CAT and SOD activities decreased in the joint exposure.It is concluded that joint exposure can strengthen toxicity toE.foetida.Joint toxicity effect of tiazophos and cyhalothrin is related to blocking the nerve transduction.

tiazophos;cyhalothrin;Eisenia foetida;acute toxicity;autioxidant enzyme activities

2015-12-09 錄用日期：2016-01-26

1673-5897（2016）3-294-08

X171.5

A

10.7524/AJE.1673-5897.20151209001

簡(jiǎn)介：王強(qiáng)(1963-)，男，博士，研究員，主要研究方向?yàn)檗r(nóng)藥毒理與應(yīng)用。

浙江省重大招標(biāo)項(xiàng)目(2014C02002)

蘇連水(1990-)，男，碩士研究生，研究方向?yàn)樯鷳B(tài)毒理學(xué)，E-mail:13340116335@163.com

*通訊作者（Corresponding author），E-mail:wq13575733860@126.com