吳麗華，陳燕飛，陳鵬，儀慧蘭

1.太原師范學(xué)院生物系，太原030031

2.山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，太原030006

亞砷酸鈉對酵母細(xì)胞抗氧化酶活性和脂質(zhì)過氧化的影響

吳麗華1，陳燕飛1，陳鵬1，儀慧蘭2,*

1.太原師范學(xué)院生物系，太原030031

2.山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，太原030006

以模式生物釀酒酵母為材料，研究亞砷酸鈉對細(xì)胞生長、抗氧化酶活性、丙二醛(MDA)含量及胞內(nèi)活性氧(ROS)水平的影響。結(jié)果顯示，加入亞砷酸鈉(終濃度0.1～0.6 mmol·L-1)后，培養(yǎng)液在600 nm處的光密度值(OD600值)低于對照組，并呈濃度依賴性降低。經(jīng)亞砷酸鈉處理12 h后，酵母細(xì)胞中過氧化物酶(POD)、過氧化氫酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)和總抗氧化能力(T-AOC)活性均增高，但胞內(nèi)ROS水平和MDA含量與對照組無顯著差異。砷處理24 h后，POD在0.2 mmol·L-1砷處理組中活性最高，而CAT、SOD和T-AOC活性呈濃度依賴性增高；胞內(nèi)ROS水平和MDA含量在高濃度砷組(0.4和0.6 mmol·L-1)顯著增高。結(jié)果表明，亞砷酸鈉可抑制酵母細(xì)胞生長，改變細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶活性，較高濃度時可引起細(xì)胞氧化損傷。

亞砷酸鈉；酵母菌；抗氧化物酶；丙二醛；ROS

吳麗華,陳燕飛,陳鵬,等.亞砷酸鈉對酵母細(xì)胞抗氧化酶活性和脂質(zhì)過氧化的影響[J].生態(tài)毒理學(xué)報，2016,11(3):302-307

Wu L H,Chen Y F,Chen P,et al.Sodium arsenite exposure affects the levels of antioxidant enzymes and lipid peroxidation inSaccharomyces cerevisiae [J].Asian Journal of Ecotoxicology,2016,11(3):302-307(in Chinese)

砷是環(huán)境中常見的、具有毒性作用的類金屬元素，其分布范圍及濃度除了受地質(zhì)條件、地球化學(xué)條件、水文地質(zhì)條件等多種環(huán)境因素的影響外，由于砷還廣泛應(yīng)用于工、農(nóng)、醫(yī)藥等行業(yè)及含砷廢水、廢渣的不合理排放，從而導(dǎo)致部分地區(qū)環(huán)境中砷含量超標(biāo)，嚴(yán)重威脅著生態(tài)系統(tǒng)和人類的身體健康[1]。氧化應(yīng)激機(jī)制是目前被廣泛認(rèn)可的砷毒性機(jī)制之一，砷化物進(jìn)入植物或動物體后，機(jī)體內(nèi)抗氧化物酶活性升高，以維持胞內(nèi)氧化還原平衡，從而達(dá)到解毒作用[2-3]；當(dāng)體內(nèi)累積砷濃度過高，細(xì)胞內(nèi)超氧陰離子(O2·-)、羥基自由基(·OH)和過氧化氫(H2O2)等活性氧自由基大量產(chǎn)生而無法被及時清除時，則會影響機(jī)體生理功能，抑制細(xì)胞生長，誘導(dǎo)細(xì)胞死亡[4-5]。

酵母細(xì)胞是目前公認(rèn)的研究真核生物細(xì)胞學(xué)機(jī)制的模式生物，且具有生長周期短、易培養(yǎng)等特點(diǎn)。本課題組已有研究證明，亞砷酸鈉可通過誘導(dǎo)胞內(nèi)活性氧(reactive oxygen species,ROS)升高而誘導(dǎo)酵母細(xì)胞死亡[6]，但砷對酵母細(xì)胞氧化損傷機(jī)理還不清楚。因此，本實(shí)驗通過分析亞砷酸鈉對酵母細(xì)胞生理生化指標(biāo)的影響，研究砷化物的氧化損傷效應(yīng)，進(jìn)一步探討砷化物的毒性作用機(jī)制。

1 材料與方法（Materials and methods）

1.1 實(shí)驗材料

釀酒酵母購于中國科學(xué)院微生物研究所菌種保藏中心。酵母細(xì)胞接種于YPD液體培養(yǎng)中，28℃，180 r·min-1振蕩培養(yǎng)至對數(shù)期后用于毒性實(shí)驗。

1.2 藥物處理及生長曲線測定

取對數(shù)期細(xì)胞至含有不同濃度亞砷酸鈉(0、0.1、0.2、0.4和0.6 mmol·L-1)的液體培養(yǎng)基中，使各處理組培養(yǎng)液在600 nm處的初始光密度值(OD600)相等且小于0.1，28℃，180 r·min-1振蕩培養(yǎng)，每隔2 h以培養(yǎng)基為對照測定培養(yǎng)液OD600，繪制生長曲線；培養(yǎng)24 h后檢測抗氧化物酶活性、MDA含量及ROS水平，每個處理設(shè)置3個重復(fù)。

1.3 抗氧化酶的測定

1.3.1 細(xì)胞酶液的提?。?］

將酵母細(xì)胞懸浮于預(yù)冷的細(xì)胞裂解液中，加入一定體積的酸性玻璃珠，高速震蕩10 min(每震蕩2 min冰浴1 min)后，冰浴15 min。11 500 r·min-1低溫離心10 min，取上清液即為酶提取液。

1.3.2 抗氧化酶活性和MDA含量測定

過氧化物酶(POD)活力測定用POD測定試劑盒；超氧化物歧化酶(SOD)活力測定用T-SOD測定試劑盒；過氧化氫酶(CAT)活力測定用CAT測定試劑盒；總抗氧化能力(T-AOC)測定用T-AOC測定試劑盒；丙二醛(MDA)含量參照[8]方法測定。

1.4 胞內(nèi)ROS水平測定

收集酵母細(xì)胞，洗滌并懸浮于終濃度為5 μmol ·L-1的二氯熒光黃雙乙酸酯(DCFH-DA)中，30℃避光孵育30 min后，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞熒光水平。

1.5 統(tǒng)計分析

計算每組3個重復(fù)實(shí)驗的平均值和標(biāo)準(zhǔn)誤(Mean±SD)，采用SPSS 18.0和Duncan方法對實(shí)驗結(jié)果進(jìn)行F檢驗并多重比較，分析各處理組之間的差異顯著性(檢驗標(biāo)準(zhǔn)為P<0.05)。

2 結(jié)果（Results）

2.1 亞砷酸鈉對酵母細(xì)胞生長的影響

圖1 亞砷酸鈉對酵母細(xì)胞生長的影響

由圖1可知，在初始OD600相同的情況下培養(yǎng)24 h后，各處理組培養(yǎng)液OD600均明顯低于對照組，且隨著處理濃度的增加而逐漸降低。在0.6 mmol· L-1處理組中酵母細(xì)胞幾乎完全停止生長。結(jié)果說明，亞砷酸鈉可抑制酵母細(xì)胞生長和分裂，并具有一定的濃度依賴性。

2.2 亞砷酸鈉對酵母細(xì)胞抗氧化酶活性的影響

酵母細(xì)胞抗氧化酶活性如圖2所示。與對照組相比，酵母細(xì)胞經(jīng)亞砷酸鈉脅迫12 h后，抗氧化酶活性隨濃度增高而逐漸升高，高濃度處理組(0.4和0.6 mmol·L-1)中酶活性均顯著高于對照組，其中POD活性在0.2 mmol·L-1處理組中與對照組間已具顯著差異，說明酵母POD對亞砷酸鈉脅迫相對敏感。

酵母細(xì)胞經(jīng)亞砷酸鈉脅迫24 h后，CAT活性隨處理濃度升高而增強(qiáng)，在0.4和0.6 mmol·L-1處理組中明顯增加，均與對照組具有顯著差異；SOD活性在處理濃度范圍內(nèi)與砷濃度顯著正相關(guān)(r=0.99)，說明SOD活性在一定程度上能反映環(huán)境中砷污染程度；POD活性則呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，0.2 mmol·L-1處理組中，POD活性達(dá)到最高，高濃度組中，POD活性下降，可能與亞砷酸鈉脅迫后酵母胞內(nèi)的氧自由基濃度有關(guān)，低濃度時可激活機(jī)體抗氧化防御系統(tǒng)[9]，而濃度過高時，對酵母細(xì)胞造成嚴(yán)重傷害，抗氧化物酶系統(tǒng)受到破壞，POD活性下降；TAOC活性在0.1 mmol·L-1處理組中略低于對照組，但無顯著差異；在0.2～0.6 mmol·L-1處理組中其活性顯著高于對照組。結(jié)果表明，亞砷酸鈉脅迫后，酵母細(xì)胞中抗氧化物酶在逆境生理中發(fā)揮了重要作用。

2.3 亞砷酸鈉對酵母細(xì)胞ROS水平的影響

圖2 亞砷酸鈉對酵母細(xì)胞抗氧化酶活性的影響

本實(shí)驗采用流式細(xì)胞術(shù)檢測酵母細(xì)胞ROS水平，發(fā)現(xiàn)酵母細(xì)胞經(jīng)不同濃度亞砷酸鈉脅迫后，胞內(nèi)ROS水平隨處理濃度的升高和處理時間延長而逐漸增加，并具有一定的濃度效應(yīng)和時間效應(yīng)(圖3)。經(jīng)亞砷酸鈉脅迫12 h后，各處理組胞內(nèi)ROS水平與對照組之間均無顯著差異；經(jīng)0.2～0.6 mmol·L-1亞砷酸鈉脅迫24 h后，酵母胞內(nèi)ROS水平顯著高于對照組，這可能是因為砷濃度較低或作用時間較短時，機(jī)體內(nèi)抗氧化物酶可有效降低由砷脅迫產(chǎn)生的氧自由基；當(dāng)砷濃度升高或作用時間較長時，機(jī)體內(nèi)抗氧化物防御系統(tǒng)與過多的氧自由基失去動態(tài)平衡，導(dǎo)致ROS水平顯著增高。

圖3 亞砷酸鈉對酵母細(xì)胞ROS水平的影響

圖4 亞砷酸鈉對酵母細(xì)胞MDA含量的影響

2.4 亞砷酸鈉對酵母細(xì)胞MDA含量的影響

從圖4可看出，酵母細(xì)胞經(jīng)亞砷酸鈉脅迫后MDA含量隨砷濃度的升高和時間延長而逐漸增加。酵母細(xì)胞經(jīng)亞砷酸鈉脅迫12 h或經(jīng)低濃度(0.1和0.2 mmol·L-1)亞砷酸鈉脅迫24 h后，各處理組中MDA含量均與對照組無顯著差異；經(jīng)高濃度(0.4和0.6 mmol·L-1)亞砷酸鈉處理24 h后，MDA含量顯著升高，與對照組相比分別增加了107.07%和386.17%。研究結(jié)果說明，低濃度砷或短時間的砷脅迫不會對酵母細(xì)胞造成嚴(yán)重的氧化損傷；隨著砷濃度升高，活性氧增多，導(dǎo)致細(xì)胞脂質(zhì)過氧化程度加劇，MDA含量升高，引起酵母細(xì)胞氧化損傷。

3 討論（Discussion）

眾所周知，砷是一種廣泛存在于自然界中的環(huán)境誘變劑，對植物、動物和微生物均可產(chǎn)生毒害作用[6,10-11]。Wu等[12]研究發(fā)現(xiàn)，砷化物可抑制骨髓瘤細(xì)胞生長。本實(shí)驗以模式生物釀酒酵母為材料研究砷化物的毒性作用，發(fā)現(xiàn)亞砷酸鈉可抑制酵母細(xì)胞生長，并隨著砷濃度的提高抑制作用增強(qiáng)，說明亞砷酸鈉對酵母細(xì)胞具有一定的毒性作用。

大量研究表明，氧化應(yīng)激機(jī)制是砷毒性作用機(jī)制之一，那么砷對酵母細(xì)胞的毒性作用是否與氧化應(yīng)激有關(guān)？正常情況下，當(dāng)機(jī)體受到外源物質(zhì)脅迫時，即可誘導(dǎo)細(xì)胞抗氧化物酶表達(dá)以清除脅迫產(chǎn)生的過量ROS，從而使細(xì)胞內(nèi)ROS等自由基的產(chǎn)生與清除處于動態(tài)平衡狀態(tài)；當(dāng)體內(nèi)ROS等氧自由基增加過多或抗氧化系統(tǒng)能力下降時，機(jī)體則會發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)，胞內(nèi)ROS水平升高，從而引起細(xì)胞發(fā)生氧化損傷[13]。SOD、POD和CAT是生物體內(nèi)抗氧化酶系中最重要的酶類，其活性可在一定程度上反映細(xì)胞的抗氧化能力；ROS是氧在細(xì)胞內(nèi)不能被完全還原而生成的產(chǎn)物的總稱，包括·、·OH及H2O2等，其水平能反應(yīng)細(xì)胞內(nèi)氧化系統(tǒng)情況；MDA含量是反映細(xì)胞膜脂損傷的重要指標(biāo)，可間接反映細(xì)胞發(fā)生氧化損傷的情況，常用來評價環(huán)境污染物的潛在毒性[14]。因此，我們進(jìn)一步檢測了酵母抗氧化酶活性、胞內(nèi)ROS水平及MDA含量。

本研究結(jié)果顯示，酵母細(xì)胞經(jīng)亞砷酸鈉脅迫12 h后，抗氧化酶活性隨著處理濃度的升高而逐漸增強(qiáng)，胞內(nèi)ROS水平和MDA含量與對照組相比均無顯著差異。這說明較短時間的砷脅迫可激活抗氧化物酶活性以清除酵母體內(nèi)過量的氧自由基，抑制胞內(nèi)ROS水平升高，此時亞砷酸鈉并不會對酵母造成氧化脅迫，這是酵母對逆境環(huán)境的適應(yīng)性反應(yīng)。酵母細(xì)胞經(jīng)亞砷酸鈉處理24 h后，SOD活性隨處理濃度升高而增強(qiáng)，說明SOD在整個實(shí)驗中將超氧陰離子催化生成H2O2的能力逐漸增強(qiáng)。CAT和POD可將H2O2轉(zhuǎn)變?yōu)檠鯕夂退?，從而消除H2O2對細(xì)胞造成的毒性作用。在本研究中，酵母細(xì)胞經(jīng)亞砷酸鈉脅迫24 h后，CAT活性隨處理濃度升高而增強(qiáng)；在高濃度處理組中，POD活性呈下降趨勢，胞內(nèi)ROS水平顯著高于對照組水平。這有可能是因為低濃度砷即可快速激活抗氧化酶活性以清除酵母細(xì)胞內(nèi)氧自由基，而砷濃度較高時，POD活性下降，細(xì)胞清除H2O2的能力減弱；雖然CAT和SOD活性持續(xù)增加，但胞內(nèi)產(chǎn)生的氧自由基超過了抗氧化酶的清除能力，自身氧化還原系統(tǒng)平衡遭到破壞，使胞內(nèi)ROS水平升高。

總之，在亞砷酸鈉脅迫下，酵母細(xì)胞內(nèi)SOD、POD和CAT活性發(fā)生改變，ROS水平升高，MDA含量增加，表明砷脅迫引起酵母細(xì)胞內(nèi)活性氧的產(chǎn)生和清除失衡，細(xì)胞發(fā)生氧化損傷，最終引起酵母細(xì)胞的生理代謝紊亂，細(xì)胞生長受到抑制。

研究結(jié)果表明，0.1～0.6 mmol·L-1的亞砷酸鈉能夠誘導(dǎo)酵母細(xì)胞內(nèi)ROS水平升高，抗氧化酶活性增強(qiáng)，從而提高酵母細(xì)胞對逆境的適應(yīng)能力，但胞內(nèi)ROS水平超過一定閾值無法被及時清除時，就會導(dǎo)致膜脂過氧化水平加劇，MDA含量升高，從而對酵母細(xì)胞造成氧化損傷。

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Sodium Arsenite Exposure Affects the Levels of Antioxidant Enzymes and Lipid Peroxidation in Saccharomyces cerevisiae

Wu Lihua1,Chen Yanfei1,Chen Peng1,Yi Huilan2,*

1.Department of Biology,Taiyuan Normal University,Taiyuan 030031,China
2.School of Life Science,Shanxi University,Taiyuan 030006,China

5 November 2015 accepted 29 January 2016

Arsenic is a high toxic metalloid widely distributed in the environment.However,the underlying mechanisms of arsenic toxicity are not yet well understood.Saccharomyces cerevisiaeas a model organism was selected as the materials to investigate the toxic mechanism of sodium arsenite(As).The results showed that cell culture density(OD600)of yeast cells was lower in all As-treatment groups(in the concentration range of 0.1-0.6 mmol· L-1)than in the control group.The values of OD600decreased in a concentration-dependent manner.The activities of antioxidant enzymes such as superoxide dismutase(SOD),peroxidase(POD),catalase(CAT)and total antioxidant capacity(T-AOC)increased with increasing arsenic concentrations after yeast cells were exposed to sodium arsenite for 12 h,but no significant difference in intracellular reactive oxygen species(ROS)level or malondialdehyde(MDA)content was found between the control and As-treatment group.After 24 h of exposure,the activitiesof CAT,POD,SOD and T-AOC increased also in a concentration-dependent manner,however POD reached its peak in 0.2 mmol·L-1As-treatment group.And both intracellular ROS levels and MDA contents significantly increased in yeast cells after they were exposed to 0.4 mmol·L-1or 0.6 mmol·L-1sodium arsenite.These results suggested that sodium arsenite can induce cell growth inhibition,alter the activities of antioxidant defense system,and result in oxidative damage in yeast cells.

sodium arsenite;yeast;antioxidant enzymes;malondialdehyde;ROS

2015-11-05 錄用日期：2016-01-29

1673-5897（2016）3-302-06

X171.5

A

10.7524/AJE.1673-5897.20151105001

簡介：儀慧蘭(1963—)，女，博士，教授，博士生導(dǎo)師，主要研究方向為環(huán)境生物學(xué)與逆境生理學(xué)，已發(fā)表研究論文90余篇，獲國家發(fā)明專利授權(quán)2項。

國家自然科學(xué)基金青年基金(21307087)；山西省高等學(xué)校大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)項目(2015363)

吳麗華(1981—)，女，博士，副教授，研究方向為環(huán)境毒理學(xué)，E-mail:wlh1981622_510@163.com

*通訊作者（Corresponding author），E-mail:yihl@sxu.edu.cn