H5亞型高致病性禽流感病毒抗原性變異分析

蔣文明，李金平，侯廣宇，彭 程，劉 朔，王素春，張玉新，陳繼明

（1.中國動物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，山東青島　266032；2.唐山市動物衛(wèi)生監(jiān)督所，河北唐山　063000）

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H5亞型高致病性禽流感病毒抗原性變異分析

蔣文明1，李金平1，侯廣宇1，彭 程1，劉 朔1，王素春1，張玉新2，陳繼明1

（1.中國動物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，山東青島266032；2.唐山市動物衛(wèi)生監(jiān)督所，河北唐山063000）

為深入了解我國H5亞型高致病性禽流感病毒的抗原性變異情況及其規(guī)律，對我國2012—2015年分離的H5亞型高致病性禽流感病毒進(jìn)行了HA基因的擴增、測序與遺傳進(jìn)化分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)這些流行毒株主要分布在第2.3.2.1分支、第2.3.4.4分支和第7.2分支。制備流行毒株的單因子陽性血清，與相應(yīng)疫苗株進(jìn)行交叉血凝抑制試驗，計算抗原相關(guān)系數(shù)，并對各分支流行毒與相應(yīng)疫苗之間的HA1主要抗原位點差異進(jìn)行分析。結(jié)果表明，Re-4、Re-5、Re-6、Re-7、Re-8疫苗株之間的血凝抑制抗原相關(guān)系數(shù)在0.17～0.67之間，表明不同分支之間的抗原性有較大差異。隨著時間的推移，分支內(nèi)流行毒與疫苗之間的血凝抑制抗原相關(guān)性差異會越來越大，抗原性變異程度增加，這與HA1主要抗原位點差異分析的結(jié)果一致。因此，要取得理想的防控效果，必須及時更新疫苗，使用與流行毒匹配性更好的疫苗。這些數(shù)據(jù)為深入了解H5亞型高致病性禽流感病毒的抗原變異和對該病毒的防控提供了技術(shù)支持。

H5；禽流感病毒；抗原性；變異；疫苗

1996年，我國首次從廣東省的鵝中分離到H5N1亞型高致病性禽流感病毒（Avian infl uenza virus，AIV）A/goose/Guangdong/1/96。2003年以來，尤其是2004年，我國暴發(fā)了多起H5亞型高致病性禽流感疫情，給養(yǎng)禽業(yè)造成了巨大損失。為此，2005年底，我國開始實施全面免疫政策［1］。2006年，我國先后推出了Re-1疫苗和針對第7分支的Re-4疫苗；2008年，推出針對第2.3.4分支病毒的Re-5疫苗。隨著病毒抗原性的不斷變異，原有疫苗的保護效率下降，不足以對新出現(xiàn)的病毒或變異株提供足夠的保護。2012年，我國推出了針對第2.3.2.1分支Re-6疫苗；2014年，推出針對第7.2分支的Re-7疫苗，替換原來的Re-4疫苗。2010年開始，第2.3.4分支的病毒開始出現(xiàn)較大變異［2-4］，其血凝抑制滴度（Re-5標(biāo)準(zhǔn)陽性血清），與Re-5本身相比差異較大，導(dǎo)致Re-5疫苗對其保護效果較差。尤其2013年以來，多地暴發(fā)了由該分支病毒引起的高致病性禽流感疫情，WHO/OIE/FAO H5N1進(jìn)化工作組將該變異株分支命名為第2.3.4.4分支［5］。2014年底，農(nóng)業(yè)部批準(zhǔn)了針對該分支病毒的Re-8疫苗，2016年獲準(zhǔn)開始使用。

疫苗與流行毒的匹配性是評估疫苗效果最重要的因素。鑒定疫苗株與流行毒之間抗原匹配性最好的方法是免疫攻毒試驗，但由于對實驗條件要求較高，因此最初常常通過血凝抑制試驗或病毒中和試驗數(shù)據(jù)，分析不同分離株之間的抗原相關(guān)性［6］。

目前，第2.3.2.1分支、第2.3.4.4分支和第7.2分支是在我國流行的3個主要分支。為更深入了解我國H5亞型高致病性AIV抗原性的變異情況，本研究利用交叉血凝抑制試驗，對近年來在我國流行的3個分支病毒進(jìn)行了抗原性分析，為深入了解H5亞型AIV抗原性變異情況及其規(guī)律以及防控提供技術(shù)支持。

1　材料與方法

1.1病毒

2012—2015年H5亞型AIV分離株（12G44、12R266、12G162、12NX1440、12A319、12R357、 12J206、12L101、12S280、13Y170、13Y125、13R177、13R21、13K145、14Weifang、14J3275、14G1778、14Yunnan、14A1652、14A1661、14Qingdao、14Rizhao、15J2408、15A2435、15G2076、15Yantai、15J2448、15J2016）共28株由本室分離保存，其中“12”“13”“14”“15”分別代表毒株分離于2012年、2013年、2014年和2015年。

1.2主要試劑

QIAamp Viral RNA Mini Kit購 自 Qiagen公司；HiScript II One Step RT-PCR Kit、DL2000 Plus Marker購自Vazyme公司；禽流感病毒H5亞型血凝抑制試驗抗原（Re-4、Re-5、Re-6、Re-7、Re-8）與陽性血清購自哈爾濱維科生物技術(shù)開發(fā)公司；SPF雞胚購自濟南斯帕法斯家禽有限公司。

1.3引物

擴增HA基因的通用引物根據(jù)已發(fā)表的文獻(xiàn)合成［7］。

1.4病毒RNA提取

用QIAamp Viral RNA Mini Kit提 取 病 毒RNA，置-70 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5一步法RT-PCR擴增HA基因

按照HiScript II One Step RT-PCR Kit說明書配置44.0 μL RT-PCR預(yù)混液，包括25.0 μL 2 × RTPCR Buffer，引物各2.0 μL（10 μmol/L），2.5 μL Enzyme Mix，12.5 μL ddH2O，加入6.0 μL RNA模板。RT-PCR反應(yīng)條件為50 ℃反轉(zhuǎn)錄30 min，94 ℃預(yù)變性5 min，然后進(jìn)行30個循環(huán)（94 ℃變性30 s、57 ℃退火30 s、72 ℃延伸2 min），最后72 ℃延伸7 min。利用QIAxcel毛細(xì)管電泳系統(tǒng)進(jìn)行片段分析，PCR產(chǎn)物送上海生工進(jìn)行測序鑒定。

1.6HA基因遺傳進(jìn)化分析

利用Clustal W軟件將本試驗中各分離株的HA基因序列與參考株HA基因序列進(jìn)行比對，再用MEGA5.05軟件對其HA1亞單位部分的序列進(jìn)行譜系分析。譜系分析的參數(shù)設(shè)置如下：采用Neighbor-joining計算方法，核苷酸變異設(shè)為Kimura 2-parameter模式，各位點變異速率設(shè)為Gamma分布（Gamma參數(shù)為2.0）。Bootstrap值的計算設(shè)置為1 000個重復(fù)。

1.7流行毒株單因子陽性血清制備

1.7.1滅活抗原的制備。每個譜系選取每年流行毒2～3株，用無菌生理鹽水10 000倍稀釋后，接種10日齡SPF雞胚，0.1 mL/枚，37 ℃孵化，收取接種12 h后死亡雞胚的尿囊液，加入0.3%福爾馬林溶液，2～8 ℃滅活48 h。檢測HA效價，如HA效價低于28，應(yīng)離心后濃縮至28以上。

1.7.2流行毒株滅活疫苗制備。取按1.7.1方法制備的流行毒滅活抗原，按96：4的比例加入吐溫-80，充分混合使吐溫-80完全溶解作為水相，然后按1：2比例加入油相（含礦物油94份和司本-80 6份）在勻漿機內(nèi)以適當(dāng)?shù)乃俣葎驖{乳化，檢驗。

1.7.3流行毒株單因子陽性血清制備。取1.7.2制備的各毒株滅活疫苗，分別免疫3～5周齡的SPF雞，0.5mL/只，免疫后21日采血，分離血清，檢測效價后備用。

1.8交叉血凝抑制試驗

以Re-6標(biāo)準(zhǔn)陽性血清和第2.3.2.1分支流行毒株單因子陽性血清對第2.3.2.1分支的病毒進(jìn)行交叉血凝抑制試驗；以Re-4、Re-7標(biāo)準(zhǔn)陽性血清和第7.2分支流行毒株單因子陽性血清對第7.2分支的病毒進(jìn)行交叉血凝抑制試驗；以Re-5、Re-8標(biāo)準(zhǔn)陽性血清和第2.3.4.4分支流行毒株單因子陽性血清對第2.3.4.4分支的病毒進(jìn)行交叉血凝抑制試驗，根據(jù)公式R=（r1×r2）1/2，計算抗原間的相關(guān)性：其中R=兩株間抗原性差異，r1=甲病毒對乙血清的血凝抑制滴度/甲病毒對甲血清的血凝抑制滴度，r2=乙病毒對甲血清的血凝抑制滴度/乙病毒對乙血清的血凝抑制滴度。

1.9抗原位點分析

根據(jù)已發(fā)表的H5亞型AIV的抗原位點［8-9］，分析各分離株HA1基因的抗原位點變化，并與相應(yīng)疫苗株HA氨基酸序列比對。

2　結(jié)果

2.1HA基因的擴增與測序

如圖1所示，對分離毒株的HA基因進(jìn)行RTPCR擴增，均獲得了與預(yù)期大小一致的目的片段。HA片段測序、Blast分析表明，所有毒株均為H5亞型高致病性AIV。

圖1　HA基因的RT-PCR擴增

2.2HA基因遺傳進(jìn)化分析

如圖2所示，我國H5亞型AIV主要流行譜系為第2.3.4.4分支、第2.3.2.1c分支和第7.2分支，其對應(yīng)的疫苗分別為Re-8、Re-6和Re-7。其中，第2.3.4.4分支又可細(xì)分為第2.3.4.4a、第2.3.4.4b、第2.3.4.4c、第2.3.4.4d四個小分支。這四個小分支在我國均有流行，Re-8疫苗株屬于第2.3.4.4d分支。

2.3HI試驗

各疫苗株之間的交叉血凝抑制試驗和抗原相關(guān)性結(jié)果（表1和表2）表明，Re-4、Re-5、Re-6、Re-7、Re-8之間的血凝抑制抗原相關(guān)系數(shù)在0.17～0.67之間，Re-4和Re-5疫苗株之間的抗原相關(guān)系數(shù)為0.667≈0.67，二者抗原性有小的差異（0.5≤ R＜0.67），其他各疫苗株之間抗原性差異顯著（R＜0.5）。

第2.3.2.1分支不同毒株的抗原相關(guān)性結(jié)果（表3）表明，分支內(nèi)各毒株之間的血凝抑制抗原相關(guān)系數(shù)在0.24～0.94之間，14A1622、15J2448、15Yantai與Re-6疫苗株之間抗原性差異顯著（R＜0.5）。

圖2　H5亞型AIV HA1基因遺傳進(jìn)化分析

表1　各疫苗株之間交叉血凝抑制試驗結(jié)果（Log2）

表2　各疫苗株之間的血凝抑制抗原相關(guān)系數(shù)（R）

第2.3.4.4分支不同毒株的抗原相關(guān)性結(jié)果（表4）表明，分支內(nèi)各毒株之間的血凝抑制抗原相關(guān)系數(shù)在0.29～0.94之間，Re-5與Re-8之間抗原性差異顯著（R＜0.5）。12G44和12G162與Re-5之間抗原性無差異（0.67≤R≤1.5），與Re-8之間抗原性差異顯著（R＜0.5）。13R177、13Y170、14Yunnan、14G1778、15G2076、15J2408與Re-5之間抗原性有差異，與Re-8之間抗原性無差異。

第7.2分支不同毒株的抗原相關(guān)性結(jié)果（表5）表明，分支內(nèi)各毒株之間的血凝抑制相關(guān)系數(shù)在0.17～0.94之間，Re-4與Re-7之間抗原性差異顯著（R＜0.5）。12S280、12L101、14Qingdao、14Rizhao與Re-4之間抗原性有差異，與Re-7之間抗原性無差異。

2.4抗原位點分析

表6為第2.3.2.1分支流行毒株與Re-6 HA1主要抗原位點分析結(jié)果，各流行毒株與Re-6 HA1主要抗原位點差異4～11個。相比2012年和2013年分離株，2014年和2015年分離株主要抗原位點變異數(shù)量增多，變異程度增加。

表7為第2.3.4.4分支流行毒株與Re-5和Re-8 HA1主要抗原位點分析結(jié)果，各流行毒與Re-5 HA1主要抗原位點差異4～13個，Re-8與Re-5 HA1主要抗原位點差異11個。12G44和12G162與Re-5 HA1主要抗原位點僅差異4個，2013—2015年流行毒與Re-5 HA1主要抗原位點差異10～13個，與Re-8 HA1主要抗原位點差異1～6個。

表8為第7.2分支流行毒株與Re-4和Re-7 HA1主要抗原位點分析結(jié)果，各流行毒與Re-4 HA1主要抗原位點差異12～16個，與Re-7 HA1主要抗原位點差異3～6個，Re-7與Re-4 HA1主要抗原位點差異15個。

3　討論

2010年之前，我國主要流行第2.3.4和第7分支的H5亞型AIV，疫苗防控方面主要免疫Re-1、Re-4和Re-5。隨著AIV的不斷變異，2012年之后，主要流行譜系變?yōu)榈?.3.2.1分支、第7.2分支和第2.3.4.4分支，疫苗也更新為Re-6、Re-7、Re-8。Re-4、Re-5、Re-6、Re-7、Re-8各疫苗株之間的血凝抑制抗原相關(guān)系數(shù)在0.17～0.67之間，表明不同分支之間的抗原性有較大差異，因此必須使用匹配相應(yīng)分支的疫苗才能取得理想的防控效果。

表3　第2.3.2.1分支不同毒株之間的血凝抑制抗原相關(guān)系數(shù)（R）

表4　第2.3.4.4分支不同毒株之間的血凝抑制抗原相關(guān)系數(shù)（R）

表5　第7.2分支不同毒株之間的血凝抑制抗原相關(guān)系數(shù)（R）

表6　第2.3.2.1分支流行毒株與Re-6疫苗株HA1主要抗原位點的差異分析

第2.3.2.1分支內(nèi)各毒株之間的血凝抑制抗原相關(guān)性分析表明，隨著時間的推移，流行毒抗原變異加劇，與Re-6疫苗株的抗原相關(guān)性差異越來越大，導(dǎo)致Re-6的免疫效果下降，繼而導(dǎo)致相關(guān)疫情的發(fā)生。HA1主要抗原位點分析結(jié)果也驗證了這一點。隨著時間的推移，相比Re-6疫苗，流行毒主要抗原位點變異數(shù)量增多，變異程度增加。

Re-5與Re-8疫苗株之間的抗原相關(guān)系數(shù)為0.41，差異顯著，二者有11個HA1主要抗原位點的差異。2012年分離株12G44和12G162屬于第2.3.4.2分支，與Re-5較近，而與Re-8較遠(yuǎn)。2013年之后的流行毒與Re-5的抗原性差異越來越大，導(dǎo)致了多起相關(guān)疫情的發(fā)生。這些流行毒與Re-8的血凝抑制抗原無差異，因此針對第2.3.4.4分支病毒的Re-8疫苗應(yīng)該可以取得較好的免疫防控效果。

Re-4與Re-7疫苗株之間的抗原相關(guān)系數(shù)為0.38，差異顯著，二者有15個HA1主要抗原位點的差異。2006年Re-4開始使用，2014年被Re-7取代。隨著時間的推移，2012年之后的流行毒與Re-4抗原性差異顯著，而與Re-7之間抗原性無明顯差異，這可能與Re-7使用時間較短有關(guān)。

交叉血凝抑制試驗、抗原相關(guān)性分析和HA1主要抗原位點分析表明，隨著時間的推移，流行毒與疫苗株之間的抗原相關(guān)性差異會越來越大，抗原性變異程度加劇。以前的分析表明［10］，疫苗免疫后病毒變異速度會加快，導(dǎo)致病毒免疫逃避的發(fā)生，進(jìn)而病毒分支增多，臨床上需要更多的疫苗進(jìn)行防控，而后導(dǎo)致病毒的變異分化進(jìn)一步加劇，使得禽流感防控更加困難。

表7　第2.3.4.4分支流行毒株與Re-5和Re-8疫苗株HA1主要抗原位點的差異分析

表8　第7.2分支流行毒株與Re-4和Re-7疫苗株HA1主要抗原位點的差異分析

因此，要取得理想的防控效果，必須及時更新疫苗，使用與流行毒匹配性更好的疫苗才能取得理想的防控效果，我們之前的結(jié)果也驗證了這一結(jié)論［11］。同時，政府要研究建立適合我國國情的禽流感防控消除計劃，適時啟動全面免疫退出計劃的第一步，爭取早日實現(xiàn)有效控制和消滅禽流感的目的。

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（責(zé)任編輯：朱迪國）

Analysis on Antigenic Variation of H5 Subtype Highly Pathogenic Avian Infl uenza Virus

Jiang Wenming1，Li Jinping1，Hou Guangyu1，Peng Cheng1，Liu Shuo1，Wang Suchun1，Zhang Yuxin2，Chen Jiming1
（1.China Animal Health and Epidemiology Center，Qingdao，Shandong 266032；2.Tangshan Animal Health Supervision Institution，Tangshan，Hebei 063000）

To further understand the situation of antigenic variation of H5 subtype highly pathogenic avian influenza viruses and its regularity，the HA genes of H5 subtype highly pathogenic avian infl uenza viruses isolated from 2012 to 2015 were amplifi ed，sequenced and analyzed with genetic evolution. It was showed that the epidemic strains were mainly distributed into the clades 2.3.2.1，7.2 and 2.3.4.4. The single factor positive sera against pandemic strains were prepared and cross hemagglutination inhibition tests were done with standard positive sera against corresponding vaccines. The relativity of antigen index was calculated and the differences of major antigen sites in HA1 genes between popular strains and corresponding vaccine strains were analyzed. The results showed that the relativity of hemagglutination inhibition antigen index of Re-4，Re-5，Re-6，Re-7，Re-8 was between 0.17～0.67，indicated that the antigenicities between the different clades had big differences. With the passage of time，the relativity of hemagglutination inhibition antigen between popular strains and vaccine strains in one clade will be more and more low，the degree of antigenic variation will increase. It was consistent with the results of variance analysis of the main antigen sites in HA1 region. In order to obtain ideal control effect，vaccines must be updated timely，so as to make them are more married with popular strains. These data will provide technical support for understanding the antigenic variation and the prevention and control of this virus.

H5；avian infl uenza virus；antigenicity；variation；vaccine

S852.65

A

1005-944X（2016）09-0027-06

10.3969/j.issn.1005-944X.2016.09.009

青島市科技計劃（14-2-4-105-jch）；中國動物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心創(chuàng)新基金（2015IF-0003YM）