李志芬，喬 俊，陸 均，王君玲，許 琳*

(1.山西大同大學(xué)化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院，山西大同037009；2.上海衡欣檢測(cè)技術(shù)有限公司，上海201821)

2，6-二甲基-3，5-吡啶二甲酰腙衍生物的合成及與DNA的作用

李志芬1，喬 俊1，陸 均2，王君玲1，許 琳1*

(1.山西大同大學(xué)化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院，山西大同037009；2.上海衡欣檢測(cè)技術(shù)有限公司，上海201821)

本文以2，6-二甲基-1，4-二氫吡啶-3，5-二甲酸二乙酯為原料，通過氧化、肼解得到2，6-二甲基-3，5-吡啶二甲酰肼，該甲酰肼和芳香醛反應(yīng)合成了4個(gè)2，6-二甲基-3，5-吡啶二甲酰腙衍生物，合成路線設(shè)計(jì)合理，反應(yīng)條件溫和，產(chǎn)率高，目標(biāo)化合物的結(jié)構(gòu)用氫譜和質(zhì)譜進(jìn)行了表征，通過EB競(jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn)測(cè)定了它們與DNA的結(jié)合常數(shù)約為104左右，表明該類酰腙化合物可以與DNA發(fā)生作用。

吡啶;酰腙;人工核酸酶;DNA

近十幾年來，人工核酸酶的研究取得了很大進(jìn)展，這些成果將有助于細(xì)胞學(xué)、分子生物學(xué)的發(fā)展，并有可能應(yīng)用于基因治療中。因?yàn)樘烊缓怂崦傅幕钚灾行挠幸粋€(gè)或多個(gè)金屬離子參與反應(yīng)，所以以金屬配合物作為人工核酸酶的研究受到了廣泛的關(guān)注，其中就包括許多酰腙金屬配合物[1-2]。但是金屬及金屬配合物類核酸酶涉及到的多數(shù)為有氧化或還原活性的金屬離子，很可能發(fā)生一些比較復(fù)雜的化學(xué)反應(yīng)，比如金屬離子從配合物中解離出來，或發(fā)生一些難以控制的氧化還原反應(yīng)，這樣就使得金屬類人工核酸酶潛在的應(yīng)用價(jià)值受到了限制[3-4]。非金屬人工核酸酶相對(duì)更安全。近年來，科研人員逐漸發(fā)現(xiàn)了幾類非金屬人工核酸酶，包括短肽、胍類衍生物、大環(huán)多胺衍生物、環(huán)糊精衍生物、以及酰腙衍生物[5-8]。人工核酸酶對(duì)DNA的作用可以分為2步，第1步是與DNA結(jié)合，第2步是催化斷裂DNA。因此判斷一種化合物是否為非金屬人工核酸酶的首要條件是其可以與DNA結(jié)合，本文通過文獻(xiàn)調(diào)研設(shè)計(jì)合成了4個(gè)酰腙化合物，并測(cè)定了它們?cè)跊]有金屬參與的情況下與DNA的結(jié)合能力。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

主要儀器：瓦里安INOVA-400MHZ核磁共振儀，安捷倫液質(zhì)儀，瓦里安Cary Eclipse熒光分光光度計(jì)。試劑：乙酰乙酸乙酯，磷酸氫二銨，烏洛托品，過硫酸銨，水合肼，4-N，N-二甲氨基苯甲醛，2-羥基-3-甲氧基苯甲醛，4-（2-吡啶基）-苯甲醛，4-吡啶甲醛。小牛胸脅DNA，溴化乙錠（EB），二甲基亞砜（DMSO），乙醇，丙酮，均為市售，分析純。

1.2 合成實(shí)驗(yàn)

根據(jù)文獻(xiàn)[9]合成2，6-二甲基-1，4-二氫吡啶-3，5-二甲酸二乙酯(化合物1)，化合物1用過硫酸銨氧化得到2，6-二甲基-3，5-吡啶二甲酸乙酯(化合物2)，化合物2通過與水合肼反應(yīng)制備2，6-二甲基-3，5-吡啶二甲酰肼(化合物3)，化合物3通過與醛反應(yīng)合成目標(biāo)產(chǎn)物2，6-二甲基-3，5-吡啶二甲酰腙（化合物4），共合成了4個(gè)不同結(jié)構(gòu)的酰腙化合物，其中4a-c是未見報(bào)道的新化合物。具體合成路線見圖1。

1.2.1 2，6-二甲基-3，5-吡啶二甲酸乙酯的合成(化合物2）

250 mL 三口瓶中加入24.80 g（97.93 mmol）2，6-二甲基-1，4-二氫吡啶-3，5-二甲酸二乙酯，丙酮30 mL，冷卻至0 ℃。44.70 g（195.86 mmol）過硫酸銨溶解于120 mL水中，將過硫酸銨水溶液緩慢滴加到上述丙酮溶液中，室溫反應(yīng)3h后，減壓蒸出部分溶劑直到有白色固體析出，過濾得到2，6-二甲基-3，5-吡啶二甲酸乙酯15.50 g,產(chǎn)率63%。

1.2.2 2，6-二甲基-3，5-吡啶二甲酰肼的合成（化合物3）

250 mL 三口瓶中加入14 g（55.72 mmol）2，6-二甲基-3，5-吡啶二甲酸乙酯，100 mL乙醇，26.50 mL（445.80 mmol）85%水合肼，加熱回流6h后，減壓蒸餾除去乙醇得到粗品，用無水乙醇多次洗滌，干燥后得到白色粉末8.83 g（化合物3），產(chǎn)率71%。

圖1 目標(biāo)化合物合成路線

1.2.3 2，6-二甲基-3，5-吡啶二甲酰腙（4a-d)

100 mL反應(yīng)瓶中加入5 mL 2，6-二甲基-3，5-吡啶二甲酰肼（3.98 mmol）水溶液，然后加入15 mL芳香醛（7.96 mmol）的乙醇溶液，滴入5滴冰醋酸，加熱回流3h后，冷卻，抽濾，用水和乙醇分別洗滌三次，得到酰腙化合物。

4a白色固體，產(chǎn)率93%，1H NMR（400 MHz，DMSO-d6）δ 12..20（s，2H），8.68（d，J=4.6 Hz，3H），8.58（d，J=4.6 Hz，1H），8.43（d，J=4.1 Hz，1H），8.30（d，J=6.3 Hz，1H），8.09（d，J=10.6 Hz，1H），7.79-7.62（m，3H），7.38 ～ 7.34（m，1H），2.63，2.48（s，6H）。ESI-MS：m∕z=402.5（[M+H]+）。

4b白色固體，產(chǎn)率74%，1H NMR（400 MHz，DMSO-d6）δ 12.12 ～ 12.01（m，2H），8.76 ～ 8.63（m，2H），8.38（d，J=5.3 Hz，1H），8.28 ～ 7.82（m，12H），7.73（s，1H），7.57（t，J=9.4 Hz，1H），7.38（dt，J=16.5，8.4 Hz，2H），2.65，2.50（s，6H）。ESI-MS：m∕z=554（[M+H]+）

4c淡黃色固體，產(chǎn)率97%，1H NMR（400 MHz，DMSO-d6）δ 12.08（br，s，2H），10.70（br，s，2H），8.60 ～ 8.40（m，2H），8.11（m，1H），7.24 ～ 7.12（m，2H），7.10 ～ 7.01（m，2H），6.93 ～ 6.82（m，2H），3.84，3.78（s，6H），2.684，2.47（s，6H）。ESI－MS：m∕z=492.8（[M+H]+）。

4d 白色粉末，產(chǎn)率84%，1H NMR（400 MHz，DMSO-d6）δ 11.75 ～ 11.57（m，2H），8.16（d，J=6.0 Hz，1H），7.96（d，J=12.8 Hz，1H），7.78（s，1H），7.53（t，J=7.7 Hz，3H），7.25（dd，J=11.7，8.9 Hz，1H），6.76（d，J=8.9 Hz，3H），6.67，6.49（d，J=8.8 Hz，1H），2.99，2.92，2.83（s，12H），2.60，2.47（s，6H）。ESI-MS：m∕z=486.9（[M+H]+）。

1.3 2，6-二甲基-3，5-吡啶二甲酰腙與DNA的作用

溴乙啶（EB）本身沒有熒光，當(dāng)加入DNA后，溴乙啶的平面大環(huán)結(jié)構(gòu)插入到DNA的堿基對(duì)之間，產(chǎn)生強(qiáng)的熒光，當(dāng)再加入一個(gè)可以和DNA能夠發(fā)生作用的小分子化合物后，該熒光會(huì)逐漸減弱，甚至被完全萃滅。該試驗(yàn)常用來證明小分子化合物與DNA的相互作用，并計(jì)算兩者的結(jié)合常數(shù)[10]。

實(shí)驗(yàn)步驟：①配制Tris緩沖溶液（5 mol∕L Tris-HCl∕50 mmol∕L NaCl，pH 7.4）。②將 CT-DNA 溶解在水中，用紫外-可見分光光度計(jì)測(cè)定CT-DNA的濃度，將其稀釋到100 μmol∕L。③配制10 μmol∕L的EB水溶液。④將CT-DNA加入到EB溶液中，二者濃度比為(10∶1)，用熒光分光光度計(jì)測(cè)定其熒光強(qiáng)度。⑤向上述溶液中加入一定濃度的小分子化合物（0.5～5 mmol），發(fā)現(xiàn)隨著小分子化合物的加入。熒光強(qiáng)度逐步減弱，當(dāng)?shù)陀?0%時(shí)，結(jié)束實(shí)驗(yàn)。⑥根據(jù)公式KEB·[EB]=Kapp·[compound]（KEB=1.0×107L∕mol），計(jì)算小分子化合物與DNA的結(jié)合常數(shù)。圖2～5是酰腙4a～4d與DNA作用的光譜圖，通過計(jì)算我們得到4種酰腙化合物與DNA的結(jié)合常數(shù)分別是：2.4×104L∕mol（4a），2.9×104L∕mol（4b），2.2×104L∕mol（4c），3.6×104L∕mol（4d）。

圖2 EB/DNA熒光光譜隨著化合物4a的加入的變化

圖3 EB/DNA熒光光譜隨著化合物4b的加入的變化

圖4 EB/DNA熒光光譜隨著化合物4c的加入的變化

2 結(jié)果與討論

2，6-二甲基-3，5-吡啶二甲酰腙衍生物的合成路線較短，反應(yīng)條件溫和，產(chǎn)率高，目標(biāo)產(chǎn)物分別用核磁共振氫譜和質(zhì)譜進(jìn)行了表征，結(jié)構(gòu)正確。在與DNA作用的研究中，我們發(fā)現(xiàn)隨著酰腙化合物的加入，EB-DNA體系的熒光強(qiáng)度逐漸下降，說明酰腙化合物可以與DNA結(jié)合，當(dāng)熒光強(qiáng)度下降到50%時(shí)，我們通過計(jì)算得到了這4種化合物與DNA的結(jié)合常數(shù)約為104L∕mol，其作用機(jī)理可能是通過平面芳環(huán)對(duì)DNA堿基對(duì)的插入來完成的。結(jié)果表明該類酰腙化合物可作為非金屬人工核酸酶的重要研究對(duì)象。

圖5 EB/DNA熒光光譜隨著化合物4d的加入的變化

[1]Morrow J R,Amyes T L,Richard J P.Phosphate binding energy and catalysis by Small and large Molecules[J].Acc Chem Res,2008,41(4)：539-548.

[2]Aiba Y，Sumaoka J,Komiyama M.Artificial DNA cutters for DNA manipulation and genome engineering[J].Chem Soc Rev,2011,40(12)：5657-5668.

[3]Smith J,Ariga K,Anslyn E V.Enhanced imidazole-catalyzed RNA cleavage induced by a bis-alkylguanidinium receptor[J].J Am Chem Soc,1993,115(1)：362-364.

[4]Boerner L J,Zaleski J M.Metal complex-DNA interactions：from transcription inhibition to photoactivated cleavage[J].Curr Opin Chem Biol,2005,9(2)：135-144.

[5]Scheffer U,Strick A,Ludwig V,et al.Metal-Free Catalysts for the hydrolysis of RNA derived from guanidines,2-Aminopyridines,and 2-Aminobenzimid-azoles[J].J Am Chem Soc,2005,127(7)：2211-2217.

[6]Sheng X,Lu X M,Zhang J J,et al.Synthesis and DNA cleavage activity of artificial receptor 1,4,7-triazacyclononane containing guanidinoethyl and hydroxyethyl side arms[J].J Org Chem,2007,72(5)：1799-1802.

[7]Feng Y P,Cao S L,Xiao A S,et al.Studies on cleavage of DNA by N-phosphoryl branched peptides[J].Peptides,2006,27(6)：1554-1560.

[8]Li Z F,Qiao J,Jia Z F,et al.Synthesis of the Pyridine Hydrazones as Metal-free Artificial Nucleases[J].Chem.Lett,2015,44(9)：1243-1244.

[9]Cui L Y,Zhang M,Xu Z,et al．Synthesis of 2，6-dimethyl-3，5-pyridinediary-hydrazones in Water[J].Shanghai Univ(Nat Sci Ed.),2006,12(4)：412-414.

[10]Dong X D,Wang X Y,Lin M X,et al.Promotive Effect of the Platinum Moiety on the DNA Cleavage Activity of Copper-Based Artificial Nucleases[J].Inorg Chem,2010,49(5)：2541-2549.

Synthesis and DNA Action of 2，6-Dimethylpyridine-3,5-Dicarbohydrazide

LI Zhi-fen1,QIAO Jun1,LU Jun2,WANG Jun-ling1,XU Lin1*
(1.School of Chemical and Environmental Engineering,Shanxi Datong University,Datong Shanxi,037009；

2.Shanghai Hengxin Testing Technology Co.,Ltd,Shanghai,201821)

2,6-dimethyl-1,4-dihydropyridine-3,5-dicarboxylate was oxided,then reacted with hydrazine hydrate to produce 2,6-dimethylpyridine-3,5-dicarbohydrazide,which reacted with aromatic aldehyde to give four 2,6-Dimethylpyridine-3,5-Dicarbohydrazide with high rate,the reaction conditions was gentle and the title compounds were characterized with1H NMR and MASS.Results indicate that these compounds can bind to calf thymus DNA and the apparent binding constants were about 104.

pyridine;hydrazide;artificial nucleases;DNA

O625.43

A

1674-0874(2016)01-0038-03

2015-11-25

李志芬(1982-)，女，山西大同人，博士，講師，研究方向：人工核酸酶的設(shè)計(jì)與合成。?許琳，女，教授，通信作者。

〔責(zé)任編輯 楊德兵〕