王全,李紅亞,李術(shù)娜,王會,李茉莉

(1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,河北 保定　071001；2.衡水市農(nóng)機管理總站,河北 衡水　053000；3.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 生活科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南 長沙　410128)

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Box-Behnken設(shè)計響應(yīng)面法優(yōu)化超聲波輔助雙水相法提取瑪咖多糖

王全1,李紅亞1,李術(shù)娜1,王會2,李茉莉3

(1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,河北 保定071001；2.衡水市農(nóng)機管理總站,河北 衡水053000；3.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 生活科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南 長沙410128)

利用Box-Behnken設(shè)計響應(yīng)面法優(yōu)化超聲波輔助雙水相法提取瑪咖多糖的條件.采用瑪咖干根為原料，考察了提取溫度、提取時間、料液比3個因素對提取結(jié)果的影響.在單個變量因子實驗基礎(chǔ)上，通過采用Box-Behnken設(shè)計響應(yīng)面分析法對瑪咖多糖的超聲波雙水相提取條件進行優(yōu)化.最佳提取條件為提取溫度60 ℃、料液比1∶20(質(zhì)量比)、提取時間52 min.與二次方程的擬合度在0.815 3，得到瑪咖多糖的提取率為15.831%，與實測值15.732%基本一致.Box-Behnken響應(yīng)面法用于優(yōu)化超聲波輔助雙水相法提取瑪咖多糖的條件是可行的，模型預(yù)測效果較好，優(yōu)化條件具備可行性.

瑪咖多糖；Box-Behnken 設(shè)計；超聲波提?。浑p水相

瑪咖(Maca)是1年生或2年生的草本植物，屬于十字花科(Cruciferae)植物的一種[1].瑪咖中含有豐富的營養(yǎng)成分，如蛋白質(zhì)、氨基酸、多糖、維生素、不飽和脂肪酸和礦物質(zhì)等，其根中不飽和脂肪酸的含量較高，占已知脂肪酸總量的56%以上，并且其富含的亞麻酸和亞油酸對人體健康有益.另外，瑪咖根中含有18種左右的氨基酸和多種金屬離子，其中包括人體必需的8種氨基酸，由于氨基酸組成合理，對谷物類蛋白有較好的平衡作用[2].瑪咖的次生代謝物質(zhì)主要有瑪咖酰胺、瑪咖烯、芥子油苷、異硫氰酸酯、甾醇及其衍生物[3].此外，瑪咖的根中還含有微量的單寧、硫氰酸芐、皂角苷等次生代謝物質(zhì)[4].

瑪咖富含多種營養(yǎng)物質(zhì)以及活性物質(zhì)，有非常合理的營養(yǎng)結(jié)構(gòu)，它具有提高生育能力的保健功能和治療貧血、抑郁癥以及中老年人的更年期綜合癥、風(fēng)濕等疾病.此外，瑪咖還具有抗癌和抗白血病的功效以及抗疲勞、調(diào)節(jié)內(nèi)分泌等多種獨特的藥理作用[5].

多糖是一種天然大分子物質(zhì)，它是由糖苷鍵連接醛糖和酮糖而構(gòu)成的多聚糖，是組成生命體的關(guān)鍵物質(zhì)，也是維持生命體的基本能源物質(zhì)[6].瑪咖多糖在醫(yī)藥中的主要作用包括抗腫瘤、抗輻射、抗病毒、抗炎、抗疲勞、抗衰老、降血糖、降血脂、免疫調(diào)節(jié)等功能[7].目前最常用的多糖提取方法主要有水提法，如陳燕青[8]等用水提醇沉法提取瑪咖多糖后進行含量測定，結(jié)果顯示出較好的重現(xiàn)性，但是方法操作時間長，提取率低；酸堿法，如孟憲云[9]等用質(zhì)量分數(shù)5%硫酸銨溶液和水2種方法提取茜草多糖，發(fā)現(xiàn)稀酸提取法產(chǎn)品純度相對較高.趙云平[10]用0.1 mol/L氫氧化鈉提取知母多糖，多糖得率22.078%，但是酸堿會引起多糖的降解及糖苷鍵的斷裂，因此操作時間不宜過長；酶法，如Hauke Hilz等應(yīng)用酶分離得到了更多的果膠多糖，此方法回收率高，節(jié)約能耗，但是提取成本較高；微波法，如胡靈[11]等利用微波輔助技術(shù)提取靈芝多糖，結(jié)果比對照組的多糖提取率明顯提高.柳志宇[4]分別利用聚能式和擴散式超聲設(shè)備對瑪咖多糖進行了提取，達到了較好的效果，提取率分別為15.26%和13.25%.本實驗采用超聲波[12-13]與雙水相萃取技術(shù)[14-15]相結(jié)合的方法來提取瑪咖多糖.雙水相萃取法是利用目標(biāo)物質(zhì)在上、下兩相之間的分配系數(shù)不同，使兩相中目標(biāo)物質(zhì)的濃度出現(xiàn)不同，進而實現(xiàn)分離的目的.雙水相萃取法對目標(biāo)物質(zhì)回收率高，耗能小，操作條件溫和，利于后續(xù)提純工作.本實驗采用Box-Behnken響應(yīng)面分析法[16]對瑪咖多糖的超聲波雙水相提取工藝進行優(yōu)化，建立回歸模型，取得了嗎咖多糖的最佳提取條件，為瑪咖多糖的提取提供了參考.

1　儀器與試劑

數(shù)控超聲波清洗器、TD5A-WS臺式低速離心機，賽特湘儀離心機儀器有限公司；SHZ-D(Ⅲ)循環(huán)水式真空泵，河南省予華儀器有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器RE-52AA，河南省予華儀器有限公司；2802UV/VIS分光光度計，上海美譜達儀器有限公司.瑪咖干根細粉，秘魯；體積分數(shù)6%苯酚溶液，DNS溶液，Sevag試劑，濃硫酸(分析純)，PEG-400(分析純)，葡萄糖(分析純).

2　方法與結(jié)果

2.1總糖及還原糖含量的測定

以葡萄糖為標(biāo)準，采用苯酚-硫酸法進行總糖含量的測定[17]；以葡萄糖為標(biāo)準，采用DNS法進行還原糖含量測定.

2.2多糖含量的測定

多糖量的計算見公式(1)

(1)

式中，m多為多糖質(zhì)量，mg；m總為總糖質(zhì)量，mg；m還為還原糖質(zhì)量，mg.

含糖量的計算見公式(2)

(2)

式中，m多為多糖質(zhì)量，mg；m原料為原料質(zhì)量，mg；m含糖量為多糖的百分含量.

2.3標(biāo)準曲線的建立

苯酚-硫酸法測定總糖含量獲得的總糖標(biāo)準曲線方程為y=6.897x-0.026，其中x代表總糖的質(zhì)量(mg)，y代表吸光度值，R2為0.999，線性關(guān)系良好.

DNS法測定還原糖含量獲得的還原糖標(biāo)準曲線方程為y=1.312x-0.046，其中x代表還原糖的質(zhì)量(mg)，y代表吸光度值，R2=0.998，線性關(guān)系良好.

2.4雙水相系統(tǒng)的制備[18]

采用聚乙二醇/硫酸銨作為雙水相體系，取一定體積的多糖提取液樣品，通過加入不同比例的PEG-400和硫酸銨，觀察其是否分相以及分相的速度和得到的上相與下相的體積比，最終確定加入的PEG-400占總體系的16.00%，硫酸銨占總體系的22.00%.

2.5瑪咖多糖的提取[19]

稱取瑪咖塊根粉末5.00 g，按一定的料液比例加入蒸餾水，在一定溫度下水浴超聲提取一定時間(超聲功率為200 W)，離心分離上層清液，并濃縮至原體積的1/5，將濃縮液冷卻.用Sevag法除蛋白質(zhì).取一定體積濃縮液，加入適量PEG-400，充分溶解后，按一定質(zhì)量比加入(NH4)2SO4，超聲混勻，靜止分相，用分液漏斗分離，取其下相保存，備用.

2.5.1提取溫度對瑪咖多糖提取率的影響

料液比1∶20(質(zhì)量比)，提取時間30 min，提取溫度分別為40，50，60，70，80 ℃，按照2.5的實驗路線提取瑪咖多糖，并測定多糖提取率.實驗結(jié)果如表1所示.

表1　溫度對瑪咖多糖提取率的影響

由表1數(shù)據(jù)作折線圖，如圖1所示.

圖1　溫度對瑪咖多糖提取率的影響Fig.1　Effect of temperature on extraction rate of polysaccharide from Maca

結(jié)果表明，瑪咖多糖提取率隨著溫度的上升而逐漸增高，當(dāng)在60 ℃時達到最大值，之后有微小地下降趨勢.這可能由于隨著溫度的升高，瑪咖多糖在水中的溶解度增大，進而多糖的提取率上升.但是在溫度上升的同時，多糖在較高的溫度下的分解也會增加，因此選擇60 ℃為實驗提取溫度.

2.5.2料液比對瑪咖多糖提取率的影響

在提取溫度60 ℃，提取時間30 min的條件下，分別按料液比(質(zhì)量比)1∶10，1∶15，1∶20，1∶25，1∶30加入蒸餾水，按照2.5的實驗路線提取瑪咖多糖，并測定多糖提取率.實驗結(jié)果如表2所示.

表2　料液比對瑪咖多糖提取率的影響

由表2數(shù)據(jù)作折線圖，如圖2所示.

結(jié)果表明，瑪咖多糖的提取率隨著料液比的增大而逐漸上升，而當(dāng)料液比高于1∶20(質(zhì)量比)時，瑪咖多糖的提取率隨著料液比的增大而有所提高.瑪咖多糖隨著料液比的增大，在水中溶解的越充分，但是提取增加不大，因此選擇料液比1∶20(質(zhì)量比)作為實驗條件.

2.5.3提取時間對瑪咖多糖提取率的影響

在料液比1∶20(質(zhì)量比)，提取溫度60 ℃，提取時間分別為20，30，40，50，60 min的條件下，按照2.5的實驗路線提取瑪咖多糖，并測定多糖提取率.結(jié)果如表3所示.

表3　提取時間對瑪咖多糖提取率的影響

由表3數(shù)據(jù)作折線圖，如圖3所示.

圖2　料液比對瑪咖多糖提取率的影響Fig.2　Effect of solid-to-liquid ratio on extraction rate of polysaccharide from Maca

圖3　提取時間對瑪咖多糖提取率的影響Fig.3　Effect of ultrasonic time on extraction rate of polysaccharide from Maca

結(jié)果表明，在低于40 min時，隨著時間的增加瑪咖多糖的提取率迅速上升，在40 min以后提取率增加緩慢，在提取時間為60 min時達到最大值，這可能由于隨著超聲時間的增長，瑪咖多糖在水中溶解的越充分.但是提取時間在50 min時的提取率已經(jīng)接近最大值，考慮到能耗與提取率的關(guān)系，實驗選擇50 min.另外，瑪咖粉在浸泡0.5 h后超聲提取與直接超聲提取結(jié)果變化不大，總結(jié)原因可能為藥材粉末由于顆粒較小，在實驗的有效時間內(nèi)即可充分提??；超聲提取的效果較徹底.

2.6響應(yīng)面實驗設(shè)計

2.6.1 實驗設(shè)計

基于單因素實驗結(jié)果，以提取溫度60 ℃，料液比1∶25，提取時間50 min為中心點，利用Box-Behnken軟件進行響應(yīng)面實驗設(shè)計.以提取溫度A、提取時間B、料液比C為自變量，以多糖提取率Y為響應(yīng)值，利用響應(yīng)面設(shè)計軟件分析實驗結(jié)果.

表4　響應(yīng)面設(shè)計的因素與水平表

由響應(yīng)面設(shè)計軟件設(shè)計實驗方案，其方案結(jié)果如表5所示.

表5　響應(yīng)面分析程序及實驗結(jié)果

根據(jù)表5的方案條件，按照2.5的實驗方法進行實驗，零水平實驗重復(fù)5次，用以估計實驗誤差[20].最終將得到瑪咖多糖的提取率.

2.6.2回歸模型的建立及方差分析

以瑪咖多糖提取率為指標(biāo)，采用Box-Behnken軟件對表5中的數(shù)據(jù)進行回歸分析，回歸分析結(jié)果見表6.各因素經(jīng)過回歸擬合后，獲得瑪咖多糖提取率對編碼自變量提取溫度、料液比、提取時間的二次多項回歸方程

Y =14.47+0.37A+1.04B-0.38C-0.13AB-2.24AC+0.22BC-1.04A2-1.78B2-0.64C2.

P<0.000 1極顯著；P<0.050 0顯著.

經(jīng)Box-Behnken軟件分析，Model(模型)的F值是18.23(P<0.001 0)，表明該模型非常顯著.因素的顯著性檢驗結(jié)果顯示，交互因素AC(即提取溫度和料液比交互作用)P值小于0.000 1，說明其對瑪咖多糖提取率有極顯著的影響；提取時間的二次項B2、提取時間B、提取溫度的二次項A2的P值均小于0.050 0，說明對瑪咖多糖提取率影響顯著；其他因素的P值大于0.100 0，說明無顯著影響[21-22].相對于純誤差失擬項的F值1.60(P=0.322 8>0.050 0)，表明失擬項的差異不顯著，實驗的擬合性較好.

表7　瑪咖多糖提取的二次多項式擬合分析

為了研究2因素之間交互作用對瑪咖多糖提取率的影響，將其中一個因素固定在零水平，選取剩余2個因素對瑪咖多糖提取率進行響應(yīng)面分析.如圖4所示，曲面上相同提取率所對應(yīng)的因素值在底面上形成曲線，即為等高線圖.等高線的形狀可以清晰地反映出2因素交互作用對瑪咖多糖提取率影響的強弱.等高線越接近圓形，說明交互作用對提取率影響越弱；等高線越接近橢圓形，說明交互作用對提取率影響越強；在等高線的圓心處附近存在極值的條件[21].從圖4a、b可以看出，當(dāng)提取溫度保持不變時，瑪咖多糖提取率隨提取時間的升高而增大，曲面的斜率較大.當(dāng)提取時間保持不變時，多糖提取率隨提取溫度的升高變化不明顯，曲面斜率相對較小.說明提取時間對瑪咖多糖提取率的影響較為顯著.從圖4c、d可以看出提取溫度與料液比交互作用形成的曲面最陡，說明對多糖提取率的影響最顯著.從圖4e、f可以看出提取時間與料液比的交互作用對多糖提取率的影響較弱[23-24].

圖4　響應(yīng)面及等高線圖Tab.4　Response surface and contour plots

2.7驗證實驗

通過Box-Behnken軟件求解回歸方程，得到瑪咖多糖的最佳提取條件：提取溫度60 ℃，料液比(質(zhì)量比)1∶20，提取時間51.95 min，在此條件下，多糖提取率的理論值為15.831%.結(jié)合實際操作情況，對實驗條件進行一定的修改，在60 ℃、1∶20(質(zhì)量比)的料液比、提取時間52 min條件下，實驗結(jié)果如表8所示.

表8　驗證實驗結(jié)果

結(jié)果表明，軟件的預(yù)測值為15.831%，在提取溫度為60 ℃，料液比(質(zhì)量比)1∶20，提取時間為52 min的實際操作條件下，測得瑪咖多糖提取率為15.732%.實驗值與理論預(yù)測值十分接近，說明了該模型在實際預(yù)測上的可用性，可以利用響應(yīng)曲面法優(yōu)化瑪咖多糖的提取條件.

3　結(jié)論

通過單因素實驗考察了溫度、料液比、超聲時間對瑪咖多糖提取率的影響，在此基礎(chǔ)上采用響應(yīng)面分析法對提取工藝進行優(yōu)化，建立了回歸數(shù)學(xué)模型.通過模型，得到最佳提取條件為溫度60 ℃、料液比(質(zhì)量比) 1∶20、超聲時間 51.95 min，在此條件下預(yù)測瑪咖多糖提取率為15.831%.經(jīng)過實驗驗證，該條件下的多糖的提取率達到15.732%，與預(yù)測值基本一致，優(yōu)化效果明顯，為瑪咖多糖的提取提供實驗基礎(chǔ).

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(責(zé)任編輯：梁俊紅)

Box-Behnken design for optimized extraction of polysaccharides from maca via ultrasonic-assisted aqueous two-phase method

WANG Quan1,LI Hongya1,LI Shuna1,WANG Hui2,LI Moli3

(1.College of Life Science,Agricultural University of Hebei,Baoding 071001,China; 2.Agricultural Machinery Management Station of Hengshui,Hengshui 053000,China； 3.College of Biological Science and Technology, Hunan Agricultural University, Changsha 410128,China)

maca polysaccharide;box-Behnken design;ultrasonic extraction;aqueous two-phase

10.3969/j.issn.1000-1565.2016.04.010

2015-08-20

國家自然科學(xué)基金青年基金資助項目(20905019)

王全(1980—)，男，河北衡水人，河北農(nóng)業(yè)大學(xué)講師，河北大學(xué)在讀博士，主要從事天然藥物提取與分析的研究.

E-mail：wangquan210@163.com

O629

A

1000-1565(2016)04-0387-09