單增李斯特菌便捷檢測(cè)試紙的制備及檢測(cè)效果

鄭曉風(fēng)，韓　勇，劉英玉，張軍濤，張　琦，張曉紅，姚　剛,

（1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830052；2.新疆烏魯木齊市畜牧草原工作站，新疆 烏魯木齊 830000）

單增李斯特菌便捷檢測(cè)試紙的制備及檢測(cè)效果

鄭曉風(fēng)1，韓勇2，劉英玉1，張軍濤1，張琦1，張曉紅1，姚剛1,*

（1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830052；2.新疆烏魯木齊市畜牧草原工作站，新疆 烏魯木齊 830000）

目的：研究一種快速、便捷檢測(cè)食品中單增李斯特菌的方法，擬對(duì)本實(shí)驗(yàn)室制備的單增李斯特菌快速檢測(cè)試紙（Listeria monocytogenes-fast test paper，LM-FTP）（專(zhuān)利受理號(hào)：201510274726.9）進(jìn)行檢測(cè)效果評(píng)價(jià)。方法：采集肉樣、乳樣、水樣和蔬菜，用LM-FTP進(jìn)行檢測(cè)，并與市售單增李斯特菌檢測(cè)試紙片（3M PetrifilmTM）進(jìn)行比對(duì)實(shí)驗(yàn)。結(jié)果：LM-FTP的檢測(cè)特異性為100%，檢測(cè)限為2.1×104CFU/mL。增菌培養(yǎng)到報(bào)告結(jié)果只需5.5 h。LM-FTP和3M PetrifilmTM檢測(cè)都可對(duì)樣品完成檢測(cè)，對(duì)農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)畜產(chǎn)品及蔬菜檢測(cè)，二者符合率為75%，對(duì)超市同類(lèi)食品檢測(cè)，二者符合率為62.5%；對(duì)超市熟食檢測(cè)時(shí)，二者符合率為93.75%。結(jié)論：與市售3M Petrifi lmTM檢測(cè)方法相比，LM-FTP檢測(cè)試紙制備簡(jiǎn)單，操作便捷，較3M PetrifilmTM的24 h報(bào)告結(jié)果更節(jié)省時(shí)間，但在檢測(cè)靈敏度方面有一定差距，尚需進(jìn)一步研究改進(jìn)。

單增李斯特菌；酶底物法；快速檢測(cè)試紙

單增李斯特菌（Listeria monocytogenes）是常見(jiàn)的食源性致病菌，它已于2002年被世界衛(wèi)生組織列為第四大重要的食源性致病菌［1］。單增李斯特菌廣泛存在于自然界中，主要是通過(guò)污染乳制品、畜禽產(chǎn)品、生熟肉、蔬菜引起發(fā)?。?-4］。人和動(dòng)物誤食后可引起胃腸炎、敗血癥等，對(duì)免疫力低下者如腫瘤、艾滋病的更容易引起感染［5-10］。據(jù)美國(guó)疾病預(yù)防與控制中心報(bào)道，全美國(guó)每年有2 000多例嚴(yán)重的病癥是由單增李斯特菌引起的［11］，國(guó)內(nèi)目前還沒(méi)有相關(guān)報(bào)道［12］，但是張淑紅等對(duì)河北省2005—2013年食品中檢出了單增李斯特菌［13］。李斯特菌病的死亡率可達(dá)20%～70%［14-16］。

縱觀各國(guó)單增李斯特菌檢測(cè)技術(shù)，主要包括傳統(tǒng)的生化培養(yǎng)技術(shù)、免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)、液相色譜技術(shù)以及分子生物學(xué)技術(shù)等。傳統(tǒng)的生化培養(yǎng)技術(shù)主要包括：增菌、分離和鑒定3 個(gè)環(huán)節(jié)，因此耗時(shí)、耗力，常需要6～7 d出結(jié)果［17］。免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)以抗原抗體免疫為基礎(chǔ)，制備特異性克隆抗體檢測(cè)細(xì)菌，具有高特異、快速的特點(diǎn)得到青睞，但抗體種類(lèi)繁多，對(duì)專(zhuān)業(yè)技術(shù)人員和儀器設(shè)備依賴(lài)程度高。分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)研究熱點(diǎn)是有堿基配對(duì)原理的核酸探針雜交技術(shù)、快速擴(kuò)增目的基因?yàn)闄z測(cè)原理的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)等［18］，具有靈敏度高、特異性好等優(yōu)點(diǎn)，但所需儀器昂貴，對(duì)實(shí)驗(yàn)室條件要求高，難以滿(mǎn)足畜產(chǎn)品生產(chǎn)一線(xiàn)對(duì)食源致病微生物的源頭檢測(cè)需求，特別是我國(guó)欠發(fā)達(dá)地區(qū)的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)需求問(wèn)題更加凸顯。由于我國(guó)鮮少有與本研究原理相關(guān)的檢測(cè)技術(shù)，因此，擬采用美國(guó)3M公司生產(chǎn)的3M PetrifilmTM和本室制備的LM-FTP檢測(cè)試紙進(jìn)行檢測(cè)效果比對(duì)實(shí)驗(yàn)，以期研發(fā)出具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的單增李斯特菌便捷檢測(cè)技術(shù)。

1　材料與方法

1.1材料與菌株

牛肉、雞肉、羊肉、散稱(chēng)鮮牛乳、青菜等 市購(gòu)；國(guó)產(chǎn)品牌純牛奶、牛肉、培根肉、三文魚(yú)、火腿、雞腿肉、精腿肉、蛋黃、礦泉水、純凈水等來(lái)自超市的熟食和瓶裝水。

標(biāo)準(zhǔn)單增李斯特菌CICC21633菌株、沙門(mén)氏菌菌株、大腸桿菌菌株 中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心；金黃色葡萄球菌 新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)微生物實(shí)驗(yàn)室分離鑒定并保存。

1.2試劑與儀器

腦心浸液培養(yǎng)基（CM917）、腦心浸液瓊脂（CM918） 北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司；營(yíng)養(yǎng)肉湯、營(yíng)養(yǎng)瓊脂 北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；氯化鈉天津市盛奧化學(xué)試劑有限公司；單增李斯特菌檢測(cè)試紙本實(shí)驗(yàn)室自制；Whatman濾紙 英格蘭梅德斯國(guó)際濾紙有限公司；環(huán)境單增李斯特菌檢測(cè)試紙片 美國(guó)3M公司。

電熱恒溫培養(yǎng)箱 長(zhǎng)沙市西區(qū)起重電器廠(chǎng)；SJ-CJ-2F型雙人雙面凈化工作臺(tái) 蘇州凈化設(shè)備有限公司；DHG-9140A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司；PHS-3C數(shù)字式pH計(jì) 上海精賢光電科技有限公司；紫外-可見(jiàn)光分光光度計(jì) 德國(guó)Eppendorf公司；PL203電子天平 梅勒特-托利多儀器（上海）有限公司；優(yōu)普系列超純水機(jī) 成都超純科技有限公司。

1.3方法

1.3.1單增李斯特菌檢測(cè)試紙制備

根據(jù)單增李斯特菌產(chǎn)生的酶遇其底物顯色的原理，采用單因素試驗(yàn)［19］對(duì)最佳底物濃度、pH值、反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)溫度等進(jìn)行篩選，將篩選出的最佳條件再采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)［20］進(jìn)行單增李斯特菌檢測(cè)最佳顯色反應(yīng)條件的優(yōu)化篩選。將Whatman濾紙裁剪成長(zhǎng)×寬為4 cm×1 cm的試紙條，高壓滅菌，無(wú)菌操作包被底物，制備成單增李斯特菌檢測(cè)試紙（LM-FTP）（已經(jīng)申請(qǐng)專(zhuān)利，專(zhuān)利受理號(hào)：201510274726.9），見(jiàn)圖1，4 ℃密封保存。

圖1　1LMLM-FTP制備示意圖Fig.1　Scheme of LM-FTP preparation

1.3.2樣品前處理

將待檢水樣、肉樣、乳樣等按GB 4789.30—2010《食品微生物學(xué)檢驗(yàn)：?jiǎn)魏思?xì)胞增生李斯特氏菌檢驗(yàn)》［21］進(jìn)行樣品的前處理。實(shí)驗(yàn)前將高壓過(guò)的剪刀、平皿、鑷子等試驗(yàn)器材放入無(wú)菌操作臺(tái)內(nèi)進(jìn)行紫外照射。然后用滅菌后的剪刀在操作臺(tái)內(nèi)取肉樣25 g進(jìn)行剪碎，將剪碎好的樣品轉(zhuǎn)入盛有225 mL生理鹽水的錐形瓶?jī)?nèi)進(jìn)行1∶10混勻并用無(wú)菌封口膜進(jìn)行封口，為了充分混勻肉樣和生理鹽水還需要手動(dòng)混勻并且標(biāo)記。乳樣和水樣是用1 mL的移液槍吸取25 mL與生理鹽水進(jìn)行1∶10混勻最后再將錐形瓶放置37 ℃電熱恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h。

1.3.3樣品增菌

24 h后取出錐形瓶，在無(wú)菌操作臺(tái)內(nèi)，用槍吸取1 mL樣品處理液加入9 mL腦心浸液培養(yǎng)基內(nèi)并輕輕混勻，在37 ℃恒溫?fù)u床上，以180～190 r/min的轉(zhuǎn)速，振蕩培養(yǎng)5 h。

1.3.4單增李斯特菌檢測(cè)試紙?zhí)禺愋詸z測(cè)

將鑒定完全的沙門(mén)氏菌、大腸桿菌及金黃色葡萄球菌進(jìn)行增菌后，滴加在LM-FTP檢測(cè)試紙上，同時(shí)用單增李斯特菌顯色結(jié)果做對(duì)比，從而確定LM-FTP的特異性。

1.3.5單增李斯特菌檢測(cè)試紙靈敏度檢測(cè)

按照2、4、10、100 倍的比例將增菌培養(yǎng)后的單增李斯特菌進(jìn)行倍比稀釋?zhuān)∠♂尯玫木旱渭拥絃M-FTP上，并對(duì)其靈敏度與3M Petrifi lmTM靈敏度對(duì)比研究。

1.3.6單增李斯特菌檢測(cè)試紙的檢測(cè)

37 ℃恒溫?fù)u床振蕩培養(yǎng)5 h后移出離心管，進(jìn)行檢測(cè)。每平皿內(nèi)放3 片LM-FTP檢測(cè)試紙，滴加富集5 h后的菌液。結(jié)果判定：觀察顯色反應(yīng)，若顯藍(lán)色，判定為單增李斯特菌陽(yáng)性結(jié)果，不顯藍(lán)色則判定為陰性。

1.3.7環(huán)境單增李斯特菌檢測(cè)試紙片的檢測(cè)

按照3M PetrifilmTM的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，用1 mL的移液器吸取3 mL富集5 h后的菌液，垂直均勻的滴加在測(cè)試片中央，靜置10 min，以使膠體凝固。每個(gè)樣品增菌液滴加2 片測(cè)試片，以做重復(fù)。同時(shí)做1 片陰性對(duì)照測(cè)試片。置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。結(jié)果判定：觀察紫紅色菌落的存在與否，若測(cè)試片上出現(xiàn)紫紅色菌落，則表示檢出單增李斯特菌；若測(cè)試片上未出現(xiàn)紫紅色菌落，則表示未檢出單增李斯特菌。

1.3.8符合率計(jì)算

2　結(jié)果與分析

2.1單增李斯特菌檢測(cè)試紙?zhí)禺愋詸z測(cè)結(jié)果由表1和圖2判定結(jié)果：只有單增李斯特菌顯藍(lán)色，

表1　1LM-FTP特異性檢測(cè)結(jié)果Table1　Specificity of LM-FTP

圖2　2LM-FTP特異性檢測(cè)結(jié)果Fig.2　Specificity of LM-FTP

其他的3 株菌不顯色，特異性100%。

2.2單增李斯特菌檢測(cè)試紙靈敏度檢測(cè)結(jié)果

表2　LM-FTP靈敏度檢測(cè)結(jié)果Table2　Sensitivity of LM-FTP

圖3　3LMLM-FTP靈敏性檢測(cè)結(jié)果Fig.3　Sensitivity of LM-FTP

圖4　3MPetrifilmTM靈敏性檢測(cè)結(jié)果Fig.4　Sensitivity of 3M PetrifilmTM

由表2和圖3、4結(jié)果得知，LM-FTP的檢測(cè)最低限為2.1×104CFU/mL，3M Petrifi lmTM檢測(cè)最低限為1 CFU/mL。

2.3農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)和超市畜產(chǎn)品結(jié)果

本實(shí)驗(yàn)室自制LM-FTP與3M Petrifi lmTM的檢測(cè)符合率比較表明，農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)畜產(chǎn)品及蔬菜檢測(cè)符合率為75%，而超市同類(lèi)食品檢測(cè)符合率為62.5%。

表3　農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)與超市畜產(chǎn)品樣品檢測(cè)結(jié)果比較Table3　Comparison of results obtained using LM-FTP and 3M PetrifilmTM for the detection of samples collected from farmer s market and supermarket

如圖5～7所示，LM-FTP檢測(cè)到單增李斯特菌，則試紙片顯藍(lán)色（圖中均未顯示顏色，下同）；反之，試紙片不顯色。3M PetrifilmTM檢測(cè)片檢測(cè)到單增李斯特菌則會(huì)出現(xiàn)紫紅色菌落；反之，則未出現(xiàn)紫紅色菌落。

圖 5 農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)LM-FTP和3M PetriffiilmTM檢測(cè)結(jié)果Fig. 5 Results of LM-FTP and 33MM PetrifilmTMfor samples collected from farmer’s market

圖6　超市畜產(chǎn)品LM-FTP檢出結(jié)果Fig.6　Results of LM-FTP detection for livestock samples collected from supermarket

圖7　超市畜產(chǎn)品3M PetrifilmTM檢出結(jié)果Fig.7　Results of 3M PetrifilmTMdetection for livestock samples collected from supermarket

2.4超市熟食檢測(cè)結(jié)果

LM-FTP與3M PetrifilmTM在對(duì)超市熟食檢測(cè)檢測(cè)結(jié)果對(duì)比結(jié)果發(fā)現(xiàn)，二者的符合率為93.75%（表4）。LMFTP與3M Petrifi lmTM具體檢測(cè)結(jié)果如圖8、9所示。

表4　超市熟食檢測(cè)結(jié)果對(duì)比Table4　Comparison of results obtained using LM-FTP and 3M PetrifilmTMfor the detection of supermarket delis

圖8　超市熟食LM-FTP檢測(cè)結(jié)果Fig.8　Results of LM-FTP detection for supermarket delis

圖9　超市熟食3M PetrifilmTM檢測(cè)結(jié)果Fig.9　Results of 3M PetrifilmTMdetection for supermarket delis

3　討 論

目前，單增李斯特菌是李斯特屬中唯一引起人和動(dòng)物患病的一種食源性致病菌［22］，因此能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)該菌的快速檢測(cè)技術(shù)我國(guó)食品安全控制的首要任務(wù)之一。崔煥忠等［23］研究的膠體金檢測(cè)試紙檢測(cè)食品中單增李斯特菌而制備的特異性抗體，具有快速、特異性強(qiáng)等特點(diǎn)，但是單抗制備昂貴，所以進(jìn)行食品樣品檢測(cè)費(fèi)用較高，同時(shí)該技術(shù)對(duì)食品中單增李斯特菌檢測(cè)最低限為3.9×105CFU/mL，而LM-FTP的檢測(cè)限為2.1×104CFU/mL，相比較而言，LM-FTP靈敏度較高，能夠滿(mǎn)足食品中單增李斯特氏菌檢測(cè)的需要。分子生物學(xué)檢測(cè)中李敏等［24］用免疫磁珠分離PCR方法對(duì)食品中單增李斯特菌快速檢測(cè)，具有極好的特異性、靈敏性，但存在所需儀器設(shè)備昂貴且對(duì)操作技術(shù)要求高等缺陷，在食品樣品中無(wú)法實(shí)現(xiàn)大批量的檢測(cè)。毛燕等［25］將免疫磁珠技術(shù)與顯色培養(yǎng)基相結(jié)合檢測(cè)牛乳中的單增李斯特菌的實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確、直觀，但是需要4～7 d報(bào)告結(jié)果，不利于快速檢測(cè)。

美國(guó)、歐盟等發(fā)達(dá)國(guó)家對(duì)單增李斯特菌快速檢測(cè)方法已經(jīng)相對(duì)成熟，已開(kāi)發(fā)出各種快檢系統(tǒng)和自動(dòng)化儀器，流式細(xì)胞技術(shù)只需要1 min即可完成定量分析，但儀器投入昂貴，提高了檢測(cè)成本［14］。目前市場(chǎng)上較實(shí)用的3M PetrifilmTM試紙片，需要依賴(lài)國(guó)外進(jìn)口，且價(jià)格平均45～50 元。而我國(guó)對(duì)單增李斯特菌研究的經(jīng)驗(yàn)和方法起步相對(duì)較晚［26］，從而表明我國(guó)自主研發(fā)快速檢測(cè)技術(shù)的必要性。

本實(shí)驗(yàn)室研制的試紙是利用單增李斯特菌合成酶遇特異的底物產(chǎn)生肉眼可見(jiàn)的顯色反應(yīng)，完成對(duì)該菌的快速檢測(cè)，無(wú)需任何儀器即可判定結(jié)果，簡(jiǎn)化了操作步驟，也減少了專(zhuān)業(yè)技術(shù)人員的指導(dǎo)。LM-FTP前期制備的理念來(lái)自微流控芯片技術(shù)，它是以紙張作為材料，具有質(zhì)量輕、易儲(chǔ)藏、便于銷(xiāo)毀、價(jià)格低廉等優(yōu)點(diǎn)。LM-FTP只需要滴加液體40 μL，并且顯色結(jié)果可以長(zhǎng)期保存。LM-FTP的研制有利于食品生產(chǎn)一線(xiàn)，特別是偏遠(yuǎn)地區(qū)檢測(cè)技術(shù)薄弱地方進(jìn)行食源性致病微生物的初步普查與檢測(cè)，為食品中單增李斯特菌污染控制提供便捷技術(shù)支撐。然而，由于LM-FTP與3M Petrifi lmTM檢測(cè)試紙比較而言，在熟食品檢測(cè)中符合率較高，達(dá)到93.75%，但在農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)畜產(chǎn)品及蔬菜檢測(cè)符合率為75%，而超市同類(lèi)食品檢測(cè)符合率為62.5%，尚存在較大差距，其主要原因可能在于熟食是經(jīng)過(guò)高溫滅菌環(huán)節(jié)，而單增李斯特菌是不耐37 ℃高溫的，證明熟食中含菌量低，LM-FTP和3M PetrifilmTM都不能檢測(cè)出，仍需要對(duì)LM-FTP的靈敏度進(jìn)一步研究改進(jìn)。

4　結(jié) 論

與市售3M PetrifilmTM檢測(cè)方法相比，本實(shí)驗(yàn)室自制的LM-FTP制備簡(jiǎn)單，操作便捷，從增菌培養(yǎng)到報(bào)告結(jié)果時(shí)間短，只需要5.5 h，即可呈現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的顯色反應(yīng)，較3M PetrifilmTM24 h報(bào)告結(jié)果更節(jié)省時(shí)間。但與市售3M PetrifilmTM相比，在檢測(cè)靈敏度方面尚需進(jìn)一步研究改進(jìn)提高。

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Preparation and Applicability of a Simple and Fast Test Strip to Detect Listeria monocytogenes

ZHENG Xiaofeng1, HAN Yong2, LIU Yingyu1, ZHANG Juntao1, ZHANG Qi1, ZHANG Xiaohong1, YAO Gang1,*
（1. College of Veterinary Medicine, Xinjiang Agricultural University, ürümqi 830052, China；2. ürümqi Station of Animal Husbandry and Pasture of Xinjiang Province, ürümqi 830000, China）

Purpose： In the present study, a paper-based test strip for the fast and simple detection of foodborne L. monocytogenes （LM） was prepared and named as LM-FTP （Patent Acceptance Number： 201510274726.9）, and its performance was evaluated. Methods： The performance evaluation was carried out in comparison with 3M Petrifi lmTMby using them to detect samples of meat, milk, drinking water and vegetable collected from farmer's market and supermarket. Results： The specifi city of LM-FTP was 100% with a limit of detection of 2.1 × 104CFU/mL, and the detection process from bacterial enrichment to obtainment of analytical results took about 5.5 hours. Both LM-FTP and 3M Petrifi lmTMcould enable the detection of the samples we tested. The coincidence rate between the results obtained using LM-FTP and 3M Petrifi lmTMfor the detection of livestock products and vegetables from farmer's market was about 75%, whereas that for those from supermarket was about 62.5%. In addition, the coincidence rate between the results of both methods for supermarket delis was about 93.75%. Conclusions： LM-FTP is simpler to prepare, easier to use, and time saving compared with 3M Petrifi lmTM, but it was inferior to 3M Petrifi lmTMin terms of sensitivity. Therefore, LM-FTP remains to be further improved.

Listeria monocytogenes； enzyme substrate method； rapid test strip

10.7506/spkx1002-6630-201620033

S852.612

A

1002-6630（2016）20-0191-07

鄭曉風(fēng), 韓勇, 劉英玉, 等. 單增李斯特菌便捷檢測(cè)試紙的制備及檢測(cè)效果［J］. 食品科學(xué), 2016, 37（20）： 191-197.

DOI：10.7506/spkx1002-6630-201620033. http：//www.spkx.net.cn

ZHENG Xiaofeng, HAN Yong, LIU Yingyu, et al. Preparation and applicability of a simple and fast test strip to detect Listeria monocytogenes［J］. Food Science, 2016, 37（20）： 191-197. （in Chinese with English abstract） DOI：10.7506/spkx1002-6630-201620033. http：//www.spkx.net.cn

2016-02-01

新疆維吾爾自治區(qū)高技術(shù)發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目（201411105）；新疆維吾爾自治區(qū)研究生教育創(chuàng)新計(jì)劃-新疆研究生科研創(chuàng)新項(xiàng)目（XJGRI2015093）

鄭曉風(fēng)（1991—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)樾螽a(chǎn)品質(zhì)量安全。E-mail：1439831292@qq.com

姚剛（1959—），男，教授，博士，研究方向?yàn)閯?dòng)物生長(zhǎng)發(fā)育調(diào)控及畜產(chǎn)品質(zhì)量安全。E-mail：yaogang516@163.com