張麗霞　張虹　卞立紅　任國領(lǐng)　孟令一　黃永紅

摘要：從大慶油田油水采出液中經(jīng)富集培養(yǎng)、劃線分離、溶血圈測定和苯酚硫酸檢測等方法篩選出一株產(chǎn)表面活性劑的菌株QS—M2，經(jīng)生理生化分析和16S rDNA分子生物學(xué)鑒定，確定菌株Qs·M2為銅綠假單胞菌，提取其代謝產(chǎn)物經(jīng)薄層層析和HPLc—Ms鑒定表明：主要的表面活性劑物質(zhì)是鼠李糖脂類物質(zhì)，其中單鼠李糖脂的主要組分為RhaC₁₀、RhaC₁₂：C₁₂雙鼠李糖脂的主要組分為Rha2C₁₄CC₁₂、Rha2C₁₀C₁₂和Rha2C₁₀C₁₀，該菌株產(chǎn)生的鼠李糖脂可將上清液的界面張力由72.0mN/m降至36.9mN/m，且鼠李糖脂的乳化性能較好，在72 h內(nèi)乳化性能穩(wěn)定，結(jié)果表明，鼠李糖脂類表面活性劑物質(zhì)是Qs-M2菌株在微生物提高原油采收率過程中發(fā)揮作用的主要因素，

關(guān)鍵詞：生物表面活性劑；菌株篩選；界面張力；乳化性能；鼠李糖脂

DoI：10.15938/j.jhust.2016.04.012

中圖分類號：TQ920.6

文獻標志碼：A

文章編號：1007-2683（2016）04-0065-05

0引言生物表面活性劑是由微生物產(chǎn)生的一類嚴格集親水基團和疏水基團于一體的具有表面活性的化學(xué)物質(zhì)與化學(xué)表面活性劑相比，生物表面活性劑除具有潤濕、乳化、分散、洗滌、起泡、增溶等功能外，還具有低毒性、可降解性和環(huán)境友好性、高效性等性能，在石油、環(huán)境保護、食品和醫(yī)藥、化妝品、洗化用品等諸多領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景大量研究已經(jīng)證明，利用微生物產(chǎn)生的生物表面活性劑能夠有效的提高原油采收率其主要作用機理是降低油水界面張力，乳化原油，形成水包油的乳化液，提高巖石的親水性能，然而，在一般的生產(chǎn)過程中，由于生物表面活性劑產(chǎn)量低、生產(chǎn)成本高、純化工藝復(fù)雜，所以目前生物表面活性劑沒有大規(guī)模的生產(chǎn)采用原油為唯一碳源篩選產(chǎn)生物表面活性劑的微生物菌株，經(jīng)過馴化得到高效產(chǎn)生物表面活性劑的菌株，不僅降低生產(chǎn)成本而且適應(yīng)油田環(huán)境，可以產(chǎn)生更好的驅(qū)油效果。

產(chǎn)生物表面活性劑的微生物主要是細菌和酵母菌，微生物代謝的目前最有效的生物表面活性劑是鼠李糖脂類，其產(chǎn)生菌多為假單胞菌屬，假單胞菌屬產(chǎn)生的鼠李糖脂的親水基團一般由1-2分子的鼠李糖構(gòu)成，疏水基團則由1-2分子具有不同碳鏈長度的脂肪酸構(gòu)成，在生物合成過程中，這些基團之間可能相互鏈接而生成多種化學(xué)結(jié)構(gòu)相近的同系物，鼠李糖脂組分的鑒定是闡述鼠李糖脂采油性能的前提和基礎(chǔ)，而糖脂類物質(zhì)的成分鑒定方法則從簡易的利用鼠李糖脂水解后測定鼠李糖的色度逐漸發(fā)展為利用高效液相色譜一質(zhì)譜聯(lián)用、核磁共振等分析樣品組成的復(fù)雜方法Mata-Sandoval等則利用高效液相色譜法分析得到了由銅綠假單胞菌UG2所產(chǎn)生的鼠李糖脂的主要組成為RhC₁₀Rh2C₁₀C₁₂H₂、RH₂C₁₀C₁₂和Rh₂C₁₀C₁₀，目前，高效液相色譜一質(zhì)譜聯(lián)用被認為是目前對鼠李糖脂組分研究最精確的方法之一，

本研究從大慶油田油藏采出液中篩選出一株高產(chǎn)糖脂類生物表面活性劑的菌株QS-M2，對QS-M2菌株進行生理生化分析和分子生物學(xué)鑒定；利用薄層層析實驗和HPLC，MS方法對提純的鼠李糖脂組分進行了鑒定和表征；同時，通過對糖脂類物質(zhì)產(chǎn)量、界面張力、乳化性能等指標的測定，分析了篩選菌株的采油潛力。

1.材料和方法

1.1樣品來源

樣品來自于大慶油田采油三廠油藏采出液，

1.2培養(yǎng)基

LB液體培養(yǎng)基（g/L）：蛋白胨1%，酵母粉0，5%，NaCI1%，pH 7.0.LB固體培養(yǎng)基（g/L）：LB液體培養(yǎng)基基礎(chǔ)上加1.5%瓊脂粉，制成平板，石油液體培養(yǎng)基（g/L）：原油5%，NaCl0.21%，NH4cl0.07%，N%HPO₄12%，KH2PO₄0.07%，酵母粉0.6%，MgSOC₄0.5%，pH7.0，血平板培養(yǎng)基：購自北京奧博星生物技術(shù)有限責任公司。

1.3菌株的篩選和鑒定

1.3.1菌種富集、分離純化

菌種富集、分離純化參照文將100 mL石油液體培養(yǎng)基加入250 mL錐形瓶中，121℃滅菌20min，樣品接種量為3%，37°C150 rpm培養(yǎng)48 h至培養(yǎng)基渾濁，采用平板劃線法進行菌種的分離純化，將所鑒定的純菌劃線至斜面，37℃培養(yǎng)1 d，4～C保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2產(chǎn)糖脂類菌株的篩選

1）產(chǎn)生物表面活性劑菌株的初篩，挑取單菌落接人5mL LB液體培養(yǎng)基，37°C150 rpm培養(yǎng)24h取1mL菌液4°C 12000 rpm離心除菌后，取上清10UL滴在血平板上，37°C培養(yǎng)24 h，觀察透明溶血圈的出現(xiàn)篩選產(chǎn)表面活性劑的菌種。

2）苯酚硫酸法篩選產(chǎn)糖脂類菌株，發(fā)酵上清液加人0，5 mL 6%苯酚溶液，混勻，加入2，5 mL濃硫酸，混勻，沸水浴10 min，分光光度計490 nm處測定吸光度值，糖脂定性檢測中，在490 nm處吸光值顯著高于對照組，可確定為產(chǎn)糖脂菌種，

1.3.3產(chǎn)糖脂類菌株的鑒定

1）菌株生理生化分析，菌株的生理生化分析參照文，主要進行了革蘭氏染色、淀粉水解、糖發(fā)酵、吲哚試驗、VP試驗、檸檬酸試驗、明膠水解試驗等。

2）菌株的分子生物學(xué)鑒定，菌株的分子生物學(xué)鑒定參照文

1.4糖脂類表面活性劑特性研究1，4，1糖脂類表面活性劑的組分鑒定

1）薄層層析實驗，薄層層析實驗參照文，

2）HPLC—MS鑒定，采用高效液相色譜一質(zhì)譜聯(lián)用法對純化組分進行鑒定，單糖脂和二糖脂主要成分的物質(zhì)的量百分比由各成分出峰面積的比例近似計算得到。

1.4.2糖脂類表面活性劑的性能檢測

糖脂類表面活性劑的提取參照文，對提取的糖脂類表面活性劑進行界面張力、乳化性能和排油圈性能測定，

1）界面張力測定，使用界面張力儀檢測上清界面張力，對照組為蒸餾水，

2）乳化性能測定，在20mL乳化管中中依次加入5mL不同濃度的表面活性劑溶液和5mL二甲苯。超聲處理3min，靜置，分別于Oh、24h、48h、72h觀察并記錄乳化相體積及變化，

3）排油性能測定，將0，5g蘇丹紅Ⅲ溶解于100mL液體石蠟中，攪拌均勻后，過濾除去不溶物及雜質(zhì)，在90 mm平皿中加入30mL蒸餾水，滴加1mL蘇丹紅Ⅲ染色后的液體石蠟，待液體石蠟散開在水面上鋪開形成一層均勻的薄膜后，在石蠟中心處緩慢滴加10txL上清液，觀察排油圈直徑并記錄，

2.結(jié)果與討論

2.1產(chǎn)糖脂類表面活性劑菌株的篩選結(jié)果

經(jīng)富集培養(yǎng)、平板劃線分離后，從大慶油田采油三廠油藏采出液中初步篩選出18株微生物菌株，對初篩的21株微生物菌株進行溶血圈檢測，如圖1所示，共得到14株產(chǎn)生物表面活性劑的微生物菌株，為了進一步篩選產(chǎn)糖脂類表面活性劑的菌株，進行了苯酚硫酸實驗，發(fā)酵上清液經(jīng)過在490 nm處吸光值顯著高于對照組的菌株，可確定為產(chǎn)糖脂菌種，經(jīng)過篩選共得到7株產(chǎn)糖脂類菌株，對7株產(chǎn)糖脂類菌株進行液體發(fā)酵7 d后，對提取的糖脂類粗品進行稱重，其中菌株QS-M2的粗品產(chǎn)量最高，達到了0.725g/L后續(xù)實驗中用到的菌株均為QS-M2菌株，

2.2產(chǎn)糖脂類菌株的鑒定結(jié)果

2.2.1QS-M2菌株的形態(tài)及生理生化特征

Qs—M2菌株形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果和生理生化特征如表l、2所示，QS-M2菌落圓形、表面光滑、淺綠色、邊緣整齊、短桿狀、菌落中心向上凸起、菌落不透明，QS-M2菌株屬于革蘭氏陰性菌，VP試驗、檸檬酸鹽試驗、明膠水解試驗為陽性，淀粉水解試驗、吲哚試驗、甲基紅試驗、硫化氫試驗為陰性，

2.2.2 QS-M2菌株的分子生物學(xué)鑒定

QS-M2菌株的16S rDNA基因經(jīng)克隆測序拼接后，在NCBI數(shù)據(jù)庫中進行blast比對，如表3所示，16S rDNA序列分析的結(jié)果顯示，該菌株為銅綠假單胞桿菌，

2.3QS-M2菌株產(chǎn)生的表面活性劑類型分析和組

分鑒定

2.3.1

薄層層析實驗對表面活性劑的定性分析

如圖2所示，以鼠李糖作為標準品（左側(cè)），用薄層層析實驗對QS-M2菌株產(chǎn)生的糖脂類表面活性劑進行定性分析，結(jié)果顯示，與對照相似，QS-M2菌株產(chǎn)生的糖脂類表面活性劑顯色為黃綠色，表明QS-M2菌株產(chǎn)生的糖脂類表面活性劑為鼠李糖脂，

2.4 QS-M2菌株產(chǎn)生的鼠李糖脂的性能測定

界面張力、排油圈性能和乳化性能是生物表面活性劑性能測定的重要指標_1引，如表4所示，界面張力隨著鼠李糖脂濃度的增大逐漸降低并且穩(wěn)定，最終界面張力由72.0mN/m降低至36.9mN/m，下降了35.1mN/m，排油圈直徑隨著表面活性劑濃度增大而增加，排油能力增強，

乳化指數(shù)是靜置24h后乳化體積與總體積的百分比，乳化指數(shù)越高說明乳化效果越好，且乳化性能穩(wěn)定，由表5可以得出，乳化層的體積并非隨著表面活性劑濃度的增大而增大，而是達到了一定體積后，隨著濃度的增加，乳化層體積下降，與50%吐溫20溶液相比，乳化穩(wěn)定性極高，長達72 h的測量時間里，乳化層體積幾乎穩(wěn)定不變，說明鼠李糖脂的乳化性能較高，并且乳化的穩(wěn)定性能極好，

3.結(jié)論

1）從大慶油田油藏產(chǎn)出水樣中經(jīng)過富集培養(yǎng)、劃線分離、溶血圈測定和苯酚硫酸檢測等方法篩選出一株產(chǎn)表面活性劑的菌株QS-M2，其發(fā)酵產(chǎn)生的糖脂產(chǎn)量為0，225g/L

2）QS-M2菌株經(jīng)形態(tài)學(xué)觀察、生理生化分析和分子生物學(xué)鑒定，該菌株為銅綠假單胞菌（Pseudo，monas aeruginosa）。

3）QS-M2菌株產(chǎn)生的表面活性劑經(jīng)薄層層析和HPLC-MS鑒定，主要的表面活性劑物質(zhì)是鼠李糖脂，其中單鼠李糖脂的主要組分為RhaC₁₀C₁₀、RhaC₁₂C₁₂雙鼠李糖脂的主要組分為Rha2C₁₄C₁₂、Rha2C₁₀C₁₂和Rha2C₁₀C₁₀。

4）QS-M2菌株產(chǎn)生的鼠李糖脂對上清液界面張力的影響是隨著鼠李糖脂濃度的增大逐漸降低并穩(wěn)定，最終降低界面張力72.0mN/m至36.9mN/m，下降了35.1mN/m；排油圈直徑隨著表面活性劑的濃度增大而增加，排油性能增強；該鼠李糖脂具有較好的乳化性能，并在72h內(nèi)乳化性能穩(wěn)定。