響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化超聲輔助提取連錢(qián)草多糖工藝及其體外抗氧化活性

劉曉鵬，張俊霞，姜 寧,，宋宜枝，向極釬，王秋霜，吳 皓（.湖北民族學(xué)院生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，湖北 恩施 445000；.南京醫(yī)藥股份有限公司博士后工作站，江蘇 南京 00；.南京中醫(yī)藥大學(xué)博士后流動(dòng)站，江蘇 南京 00）

響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化超聲輔助提取連錢(qián)草多糖工藝及其體外抗氧化活性

劉曉鵬1,2,3，張俊霞1，姜 寧1,*，宋宜枝1，向極釬1，王秋霜2，吳 皓3
（1.湖北民族學(xué)院生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，湖北 恩施 445000；2.南京醫(yī)藥股份有限公司博士后工作站，江蘇 南京 210012；3.南京中醫(yī)藥大學(xué)博士后流動(dòng)站，江蘇 南京 210023）

通過(guò)中心復(fù)合試驗(yàn)優(yōu)化超聲輔助提取連錢(qián)草多糖的工藝，以1,1-二苯基-2-苦肼基（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基和2,2’-連氮基-雙-（3-乙基苯并噻唑-6-磺酸）自由基（2,2’--azino-bis-(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) radical，ABTS＋?）清除能力、Fe2＋螯合力、鐵離子還原抗氧化力（ferric reducing antioxidant power，F(xiàn)RAP）和N,N-二甲基-對(duì)苯二胺（N,N-dimethyl-p-phenylenediamine，DMPD）自由基清除能力為指標(biāo)，研究連錢(qián)草多糖的體外抗氧化活性。結(jié)果表明，超聲輔助提取連錢(qián)草多糖的最優(yōu)工藝為pH 7.2、液固比32∶1（mL/g）、超聲功率270 W、超聲時(shí)間8 min，此條件下多糖提取率在4.95%～5.12%范圍內(nèi)。體外抗氧化活性結(jié)果顯示，連錢(qián)草多糖DPPH自由基清除能力為（0.51±0.04）μmol Trolox/mg，ABTS＋?清除能力為（0.69±0.04）μmol Trolox/mg，F(xiàn)e2＋螯合力為（0.51±0.29）μmol EDTA/mg，F(xiàn)RAP值為（3.45±0.03）μmol Trolox/mg，DMPD自由基清除能力為（0.17±0.01）μmol Trolox/mg。

連錢(qián)草；多糖；超聲輔助提??；響應(yīng)面分析；抗氧化

連錢(qián)草為唇形科活血丹屬植物活血丹（Glechoma longituba (Nakai) Kupr.）干燥地上部分，曬干或鮮用。連錢(qián)草性味涼辛，微苦，微寒，歸肝、腎、膀胱經(jīng)[1]。連錢(qián)草具有利尿、預(yù)防腎結(jié)石[2]、抑菌[3]、抗炎鎮(zhèn)痛[4]、降血糖[5]、抗腫瘤[6]以及抑制破骨細(xì)胞生長(zhǎng)[7]等藥理作用。

多糖是中藥的主要活性成分之一，而目前對(duì)連錢(qián)草的研究主要集中在萜類(lèi)[8]、黃酮類(lèi)[9]、有機(jī)酸類(lèi)[10-11]，對(duì)連錢(qián)草多糖的研究則較少，僅前期研究了水浴法提取工藝的優(yōu)化[12]，而無(wú)對(duì)該多糖其他方面研究的報(bào)道。本研究通過(guò)考察提取液pH值、液固比、超聲功率和超聲時(shí)間等因素，采用單因素試驗(yàn)和中心復(fù)合試驗(yàn)優(yōu)化超聲輔助提取連錢(qián)草多糖的工藝，并考察5 個(gè)抗氧化指標(biāo)以揭示其體外抗氧化活性，旨在為連錢(qián)草這一傳統(tǒng)中藥的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)和理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

連錢(qián)草由南京同仁堂洪澤科技有限公司提供，烘干，粉碎，過(guò)60 目篩；1,1-二苯基-2-苦肼基（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、2,2’-連氮基-雙-（3-乙基苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽（2,2’-azino-bis(3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid) diammonium salt，ABTS）、菲咯嗪（ferrozine試劑）、三吡啶三吖嗪（2,4,6-tris(2-pyridyl)-s-triazine，TPTZ）、N,N-二甲基對(duì)苯二胺二鹽酸鹽（N,N-dimethyl-p-phenylenediamine，DMPD）、Trolox 日本東京化成工業(yè)株式會(huì)社；二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白濃度定量試劑盒 碧云天生物技術(shù)研究所；葡萄糖、無(wú)水乙醇、蒽酮等（均為分析純） 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Multiskan GO全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀 美國(guó)Thermo公司；TU-1810型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；RT-02A型多功能粉碎機(jī) 弘荃機(jī)械企業(yè)有限公司；COUCTER型離心機(jī) 美國(guó)Beckman公司；JY96-Ⅱ超聲波細(xì)胞粉碎機(jī) 寧波新芒生物科技股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 超聲輔助提取連錢(qián)草多糖工藝的優(yōu)化

1.3.1.1 連錢(qián)草多糖的提取[13]

稱取一定量的連錢(qián)草干粉末，加入適量緩沖液，超聲波處理一定時(shí)間后，離心取上清液進(jìn)行真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至原體積的1/10，向濃縮液中緩慢加入無(wú)水乙醇至乙醇終體積分?jǐn)?shù)為80%，4 ℃靜置過(guò)夜，離心，沉淀用無(wú)水乙醇洗滌3 次后用蒸餾水溶解。將上述溶液、三氯甲烷、正丁醇按體積比25∶5∶1混合并劇烈振蕩20 min，離心取上清液，此過(guò)程重復(fù)5 次以除去蛋白。葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品，硫酸-蒽酮法測(cè)多糖含量[14]，多糖提取率按下式計(jì)算：

式中：ρ為測(cè)定樣液的質(zhì)量濃度/（mg/mL）；V為提取體積/mL；m為連錢(qián)草質(zhì)量/mg。

測(cè)量抗氧化活性前，將上述提取多糖樣品置于截留相對(duì)分子質(zhì)量3 500的透析袋中，于蒸餾水中透析過(guò)夜以除去小分子物質(zhì)。透析液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，凍干得連錢(qián)草多糖凍干粉。檢測(cè)凍干粉中的多糖含量；牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)品，BCA法檢測(cè)其蛋白含量，具體操作按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行；沒(méi)食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品，F(xiàn)olin-Ciocalteu法測(cè)多糖凍干粉的總酚含量[15]；蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品，分光光度法測(cè)量總黃酮含量[16]。

1.3.1.2 單因素試驗(yàn)

稱取一定量的連錢(qián)草粉末，按照下列條件進(jìn)行單因素試驗(yàn)：分別配制pH 4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0的緩沖液，按液固比30∶1（mL/g）加入樣品中，超聲時(shí)間4 min、超聲功率200 W；固定pH 7.0、超聲功率200 W和超聲時(shí)間4 min，改變液固比分別為10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1（mL/g）；固定pH 7.0、液固比30∶1（mL/g），分別用功率為50、100、150、200、250、300、350 W的超聲波處理4 min；提取液pH 7.0、液固比30∶1（mL/g）、超聲功率200 W條件下分別處理2、4、6、8、10 min。考察各單因素對(duì)連錢(qián)草多糖提取率的影響。

1.3.1.3 中心復(fù)合試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，采用Design-Expert 8.0軟件進(jìn)行中心復(fù)合試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以pH值、液固比、超聲功率和超聲時(shí)間為自變量，多糖提取率為響應(yīng)值優(yōu)化連錢(qián)草多糖的提取工藝。試驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

表1 中心復(fù)合試驗(yàn)因素與水平Table 1 Coded levels for factors used in central composite design

根據(jù)中心復(fù)合試驗(yàn)，建立pH值、液固比、超聲功率和超聲時(shí)間與多糖提取率的回歸方程，并進(jìn)行響應(yīng)面分析，優(yōu)化出連錢(qián)草多糖提取的最佳工藝，并對(duì)優(yōu)化的工藝進(jìn)行驗(yàn)證，證明此工藝的可行性。

1.3.2 連錢(qián)草多糖體外抗氧化活性的測(cè)定

1.3.2.1 DPPH自由基清除能力測(cè)定

連錢(qián)草多糖DPPH自由基清除能力的測(cè)定按照Gülcin等[17]方法進(jìn)行。Trolox為標(biāo)準(zhǔn)品，濃度分別為2.5、5、10、20、40、80 μmol/L，以Trolox濃度為橫坐標(biāo)、DPPH自由基清除能力為縱坐標(biāo)，制作出Trolox對(duì)DPPH自由基清除能力的標(biāo)準(zhǔn)曲線。連錢(qián)草多糖的DPPH自由基清除能力用每毫克樣品μmol Trolox當(dāng)量表示（μmol Trolox/mg）。

1.3.2.2 ABTS＋?清除能力測(cè)定

參照Chen等[18]的方法測(cè)定連錢(qián)草多糖的ABTS＋?清除能力。Trolox作為標(biāo)準(zhǔn)品，作出Trolox的ABTS＋?清除能力（濃度分別為1.25、2.5、5、10、20、40 μmol/L）標(biāo)準(zhǔn)曲線。連錢(qián)草多糖的ABTS＋?清除能力以每毫克樣品μmol Trolox當(dāng)量表示（μmol Trolox/mg）。

1.3.2.3 Fe2＋螯合力測(cè)定

Fe2＋螯合力依照文獻(xiàn)[19]測(cè)定。EDTA作為測(cè)定該指標(biāo)的標(biāo)準(zhǔn)品，濃度為7.8、15.6、31.3、62.5、125、250 μmol/L，計(jì)算Fe2＋螯合力與EDTA濃度的線性回歸方程。樣品的螯合力用每毫克樣品μmol EDTA當(dāng)量表示（μmol EDTA/mg）。

1.3.2.4 鐵離子還原抗氧化力（ferric reducing antioxidant power，F(xiàn)RAP）測(cè)定

FRAP測(cè)定采用Fernandes等[20]的方法。Trolox為標(biāo)準(zhǔn)品，測(cè)定濃度分別為5、10、20、40、80、160 μmol/L的FRAP值，計(jì)算FRAP值與Trolox濃度的線性回歸方程。用每毫克樣品μmol Trolox當(dāng)量表示（μmol Trolox/mg）連錢(qián)草多糖的FRAP。

1.3.2.5 DMPD自由基清除能力測(cè)定

連錢(qián)草多糖DMPD自由基清除能力參考文獻(xiàn)[19]進(jìn)行測(cè)定。Trolox為標(biāo)準(zhǔn)品，測(cè)定不同濃度（分別為6.25、12.5、25、50、100、200 μmol/L）的Trolox對(duì)DMPD自由基清除能力，制作Trolox DMPD自由基清除能力的標(biāo)準(zhǔn)曲線。連錢(qián)草多糖的DMPD自由基清除能力以μmol Trolox當(dāng)量表示（μmol Trolox/mg）。

1.4 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 連錢(qián)草多糖凍干粉組分分析

連錢(qián)草多糖凍干粉為白色粉末，得率為4.52%，其中多糖含量為97.28%，未檢測(cè)到蛋白質(zhì)、酚類(lèi)以及黃酮類(lèi)化合物。因此，可以推斷凍干粉中連錢(qián)草多糖是體外抗氧化的物質(zhì)基礎(chǔ)。

2.2 超聲輔助提取連錢(qián)草多糖工藝的優(yōu)化

2.2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

圖1 單因素試驗(yàn)結(jié)果Fig.1 Results of single factor experiments

當(dāng)提取液pH值較低時(shí)，連錢(qián)草多糖的提取率較低，隨著提取液pH值逐步增加，提取率顯著上升，當(dāng)pH值達(dá)到7.0時(shí)，提取率最高，隨后pH值的提高不再增加連錢(qián)草多糖的提取率，反而有所下降（圖1A）。液固比能顯著影響連錢(qián)草多糖的提取率，當(dāng)液固比較小時(shí)，增大液固比可以提取連錢(qián)草多糖的提取率，當(dāng)液固比達(dá)到30∶1（mL/g）時(shí)，多糖提取率不再顯著增加（圖1B）。由圖1C可以看出，當(dāng)超聲功率為250 W時(shí)，多糖提取率最高，低于或高于250 W，提取率均有所下降。隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng)，連錢(qián)草多糖的提取率顯著上升，當(dāng)處理時(shí)間超過(guò)8 min后，提取率增加不再顯著（圖1D）。所以，在pH 6～8、液固比20∶1～40∶1（mL/g）、超聲功率200～300 W、超聲時(shí)間6～10 min范圍內(nèi)進(jìn)行中心復(fù)合試驗(yàn)。

2.2.2 中心復(fù)合試驗(yàn)結(jié)果

2.2.2.1 回歸模型的建立

表2 中心復(fù)合試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 2 Central composite design with experimental values of polysaccharide yield

中心復(fù)合試驗(yàn)結(jié)果如表2所示。由統(tǒng)計(jì)軟件Design-Expert 8.0分析，建立了如下四元二次回歸方程：Y=4.86＋0.10A＋0.25B＋0.31C－0.26D＋0.03AB＋ 0.22AC＋0.10AD＋0.29BC＋0.07BD－0.17CD－0.26A2－0.58B2－0.41C2－0.46D2。

表3 中心復(fù)合試驗(yàn)結(jié)果方差分析表Table 3 Analysis of variance (ANOVA) of the results of central composite design

該模型的決定系數(shù)R2為0.967 5，校正后決定系數(shù)為0.937 2。對(duì)建立的模型進(jìn)行方差分析，結(jié)果列于表3中，該模型極顯著（P＜0.000 1），失擬性不顯著（P＞0.1），說(shuō)明此回歸模型能很好地?cái)M合實(shí)際。AB、AD和BD項(xiàng)不顯著（P＞0.05），需將此3項(xiàng)從回歸模型中刪除。因此，回歸模型最終為：Y＝4.86＋0.10A＋0.25B＋0.31C－0.26D＋0.22AC＋0.29BC－0.17CD－0.26A2－0.58B2－0.41C2－0.46D2。

2.2.2.2 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由上述回歸方程計(jì)算得知，當(dāng)A＝0.47、B＝0.39、C＝0.72、D＝－0.33時(shí)，Y出現(xiàn)極大值。即當(dāng)提取條件為pH 7.2、液固比32∶1（mL/g）、超聲功率268 W、超聲時(shí)間7.68 min時(shí)，連錢(qián)草多糖的提取率最高，達(dá)5.09%。為了操作方便，將優(yōu)化的工藝定為：pH 7.2、液固比32∶1（mL/g）、超聲功率270 W、超聲時(shí)間8 min。并對(duì)優(yōu)化的工藝進(jìn)行驗(yàn)證，得到多糖的提取率在4.95%～5.12%之間，說(shuō)明該工藝穩(wěn)定可靠，對(duì)生產(chǎn)實(shí)踐具有很好的指導(dǎo)作用。

本課題組曾優(yōu)化水浴法提取連錢(qián)草多糖的工藝，得到的最佳工藝為pH 7.2、液固比33∶1（mL/g）、提取溫度89 ℃、提取時(shí)間160 min，在此條件下，多糖得率為（3.40±0.05）%[12]。與水浴提取法相比，超聲輔助法不僅縮短了提取時(shí)間，還大大提高了提取率。

2.2.2.3 響應(yīng)面分析

圖2 各因素交互作用對(duì)連錢(qián)草多糖提取率的影響Fig.2 Interactive effects of extraction parameters on the yield of polysaccharides

由表3可以得知，pH值與超聲功率、液固比與超聲功率、超聲功率與超聲時(shí)間的交互作用能顯著影響連錢(qián)草多糖的提取率（P＜0.05）。通過(guò)響應(yīng)面分析可以看出，液固比32∶1（mL/g）、超聲時(shí)間7.68 min時(shí)，隨著pH值的上升和超聲功率的加大，多糖提取率急劇增加，當(dāng)pH 7.0～7.5、超聲功率260～280 W時(shí)，多糖提取率最高（圖2a），當(dāng)pH值和超聲功率繼續(xù)提高后，多糖提取率急劇下降。這可能是因?yàn)閜H值不適宜時(shí)，即使提高超聲功率，多糖也不易溶出；如pH值適宜，超聲功率過(guò)小，多糖溶出速率慢，超聲功率過(guò)大又會(huì)破壞多糖的結(jié)構(gòu)，均使提取率降低；只有二者協(xié)同作用，都達(dá)到最佳條件時(shí)，提取率才會(huì)最大。如圖2b所示，當(dāng)pH 7.2、超聲時(shí)間7.68 min時(shí)，多糖提取率隨著液固比和超聲功率水平的上升急劇增加，液固比約32∶1（mL/g）、超聲功率260～280 W時(shí)，達(dá)到最大值，隨后提取率隨二者的增加急劇下降。如圖2c所示，pH值和液固比分別為7.2和32∶1（mL/g）時(shí)，超聲功率和時(shí)間水平的上升會(huì)使多糖提取率急劇提高，隨后提取率上升趨勢(shì)變緩，當(dāng)超聲功率260～280 W、超聲時(shí)間7～8 min時(shí)，多糖的提取率最高。

2.3 連錢(qián)草多糖體外抗氧化活性測(cè)定結(jié)果

Trolox由于具有較強(qiáng)的抗氧化能力，常被用作體外抗氧活性測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)品[21-22]。本研究采用Trolox為標(biāo)準(zhǔn)品，將連錢(qián)草多糖的5 個(gè)體外抗氧化活性指標(biāo)以每毫克μmol Trolox當(dāng)量表示，能具體顯示多糖的體外抗氧化活性。

2.3.1 DPPH自由基清除能力

Trolox在2.5～80 μmol/L濃度范圍內(nèi)與DPPH自由基清除率線性方程為y=0.002 9x－0.016 4，決定系數(shù)R2為0.954 5，將測(cè)得的連錢(qián)草多糖DPPH自由基清除率代入方程中得連錢(qián)草多糖DPPH自由基清除能力為（0.51±0.04）μmol Trolox/mg。

DPPH自由基清除能力是常用的體外抗氧化活性指標(biāo)，多糖能清除DPPH自由基是因?yàn)樗鼈兡芴峁┵|(zhì)子。Thetsrimuang等[23]從真菌Lentinus polychrous Lév.的菌絲體、新鮮子實(shí)體、干燥子實(shí)體中提取了多糖，并比較了3 種粗多糖的DPPH自由基清除能力，發(fā)現(xiàn)菌絲體多糖的清除能力最強(qiáng)，達(dá)0.131 μmol Trolox/mg。因此，連錢(qián)草多糖的DPPH自由基清除能力明顯強(qiáng)于Lentinus polychrous Lév.菌絲體多糖，這可能是因?yàn)檫B錢(qián)草多糖能提供更多的質(zhì)子清除DPPH自由基。

2.3.2 ABTS＋?清除能力

當(dāng)Trolox濃度在1.25～40 μmol/L范圍內(nèi)與ABTS＋?清除率的線性方程為y＝0.008 9x＋0.031 2，決定系數(shù)R2為0.972 3，將測(cè)得的連錢(qián)草多糖ABTS＋?清除率代入上述回歸方程中，得到連錢(qián)草多糖的ABTS＋?清除能力為（0.69±0.04）μmol Trolox/mg。

Mateos-Aparicio等[24]依次用0.05 mol/L NaOH、1 mol/L KOH和4 mol/L KOH溶液從豆渣的乙醇不溶物中提取出3 種多糖0.05MSF（0.05 mol/L NaOH溶液、0.05 mol/L NaOH可溶性多糖）、1MSF（1 mol/L KOH溶液、1 mol/L KOH可溶性多糖）、4MSF（4 mol/L KOH溶液、4 mol/L KOH可溶性多糖），對(duì)ABTS＋?清除能力進(jìn)行評(píng)價(jià)，3 種多糖的ABTS＋?清除能力分別為（0.078±0.005）、（0.068±0.007）、（0.063±0.004）μmol Trolox/mg，由此可知連錢(qián)草多糖的ABTS＋?清除能力大于豆渣中提取的多糖。由于清除ABTS＋?涉及到電子的轉(zhuǎn)移，所以連錢(qián)草多糖較大豆渣中提取的多糖能提供更多的電子。

2.3.3 Fe2＋螯合力

在一定濃度范圍內(nèi)（7.8、15.6、31.3、62.5、125、250 μmol/L），EDTA 的Fe2＋螯合力與濃度呈線性關(guān)系（y＝0.003 7x＋0.073 6，R2為0.937 9），由該線性方程得到連錢(qián)草多糖的Fe2＋螯合力為（0.51±0.29）μmol EDTA/mg。

一些過(guò)渡金屬如Fe2＋、Cu＋、Pb2＋、Co2＋等能促使活性氧（reactive oxygen species，ROS）的產(chǎn)生，其中Fe2＋是最強(qiáng)的促氧化劑，能導(dǎo)致脂質(zhì)過(guò)氧化體的產(chǎn)生[25]；菲咯嗪能與Fe2＋形成在562 nm波長(zhǎng)處有吸收峰的Fe2＋-菲咯嗪復(fù)合物，當(dāng)加入抗氧化劑后，該吸光度減弱，并在一定范圍內(nèi)呈線性關(guān)系，可以反映樣品的Fe2＋螯合力[26]。

Jiang Changxing等[27]的研究表明，采用超聲輔助提取的榕樹(shù)（Ficus microcarpa）氣生根多糖在3.6 mg/mL時(shí)，F(xiàn)e2＋螯合率達(dá)81.3%。Yuan等[28]從桑葉中提取了粗桑葉多糖（mulberry leaves polysaccharides，MLP），并將MLP進(jìn)行分離純化，得到兩種純的多糖MLP-3a和MLP-3b，對(duì)這3 種多糖的Fe2＋螯合力進(jìn)行了測(cè)定，發(fā)現(xiàn)當(dāng)質(zhì)量濃度為4.0 mg/mL時(shí)，它們的 Fe2＋螯合率分別為92.96%、51.33%、87.76%。

關(guān)于多糖螯合Fe2＋的機(jī)理至今鮮見(jiàn)系統(tǒng)闡述，但有研究者證實(shí)如某物質(zhì)含兩個(gè)或兩個(gè)以上如下基團(tuán)：—OH、—SH、—COOH、—PO3H2,、C＝O、—NR2、—S—和—O—，并能進(jìn)行有效地配置，就會(huì)具有金屬螯合能力[29]；對(duì)槲皮素螯合金屬的機(jī)理也證明這一點(diǎn)[30]。因此，推測(cè)多糖螯合Fe2＋的機(jī)理也是因?yàn)榫哂心承┥鲜龉δ軋F(tuán)，但具體的作用原理還需進(jìn)一步研究。

2.3.4 FRAP值

抗氧化劑將鐵-三吡啶三吖嗪（Fe3＋-TPTZ）復(fù)合物還原成藍(lán)色的亞鐵離子形式（Fe2＋），此形式在593 nm波長(zhǎng)處有吸收峰，吸光度越高，抗氧化力越強(qiáng)。

Trolox在一定濃度范圍內(nèi)（5～160 μmol/L），F(xiàn)RAP值與其濃度成正比，線性方程為y＝0.001 4x＋0.004 5，決定系數(shù)R2為0.997 9。由此，測(cè)得連錢(qián)草多糖的FRAP為（3.45±0.03）μmol Trolox/mg。

多糖能阻止Fe3＋轉(zhuǎn)化為Fe2＋，其中一個(gè)原因是能提供電子，另一個(gè)原因是具有大量重復(fù)的—OH[31]。Gómez-Ordó?ez等[32]依次采用冷水、熱水、0.1 mol/L HCl溶液和2 mol/L KOH溶液提取，從食用紅藻Mastocarpus stellatus中得到4 種多糖，測(cè)量4 種多糖的FRAP值，得到最高的為冷水提取組分，為0.045 μmol Trolox/mg。所以，連錢(qián)草多糖的還原Fe3＋能力要高于食用紅藻Mastocarpus stellatus中的4 種多糖。這可能是因?yàn)檫B錢(qián)草多糖提取電子的能力強(qiáng)于食用紅藻Mastocarpus stellatus中的4種多糖或具有更多的—OH的重復(fù)結(jié)構(gòu)。

2.3.5 DMPD自由基清除能力

以Trolox濃度（6.25～100 μmol/L）為自變量，以DMPD自由基清除率為因變量，得到DMPD自由基清除率與Trolox濃度的線性方程為y＝0.008 6x＋0.043 8（決定系數(shù)R2為0.936 9）。將測(cè)得的連錢(qián)草多糖的DMPD自由基清除率代入上述方程中，得到連錢(qián)草多的DMPD自由基清除能力為（0.17±0.01）μmol Trolox/mg。

DMPD在含有適宜氧化劑的酸性溶液中能形成穩(wěn)定的DMPD自由基，該自由基在505 nm波長(zhǎng)處有最大吸收峰?？寡趸瘎┤缒芴峁湓咏oDMPD自由基，則會(huì)在波長(zhǎng)505 nm處的吸光度降低，該方法與ABTS＋?清除能力的測(cè)定相比，終點(diǎn)吸光度更穩(wěn)定。這種方法對(duì)疏水性物質(zhì)的測(cè)定靈敏性和重復(fù)性都要差，而多糖大多為親水性的，所以，此法特別適合測(cè)定多糖的抗氧化性[33]。

Rana等[34]檢測(cè)了印度黃檀（Dalbergia sissoo）葉、柚木（Tectona grandis）皮和美洲含羞草（Mimosa diplotricha）種子多糖的DMPD自由基清除能力，結(jié)果顯示3 種多糖IC50值分別為（3.360±0.080）、（2.360±0.070）、（4.980±0.100） mg/mL。本研究采用μmol Trolox/mg為單位對(duì)連錢(qián)草多糖的DMPD自由基清除能力進(jìn)行量化，由于采用了不同的標(biāo)準(zhǔn)來(lái)衡量多糖的DMPD自由基清除能力，所以無(wú)法比較其能力的強(qiáng)弱。

3 結(jié) 論

本研究采用中心復(fù)合試驗(yàn)優(yōu)化了超聲輔助提取連錢(qián)草多糖的工藝，當(dāng)提取條件為pH 7.2、液固比32∶1（mL/g）、超聲功率268 W、超聲時(shí)間7.68 min時(shí)，連錢(qián)草多糖的提取率達(dá)到5.09%，優(yōu)于水浴提取法；并研究了連錢(qián)草多糖體外抗氧化活性，表明連錢(qián)草多糖具有較強(qiáng)的DPPH自由基、ABTS＋?清除能力，較高的Fe2＋螯合力、FRAP值以及DMPD自由基清除能力。因此，連錢(qián)草多糖有望開(kāi)發(fā)成具有很好抗氧化活性的藥物或食品添加劑。

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Optimization by Response Surface Methodology of Ultrasound-Assisted Extraction and Antioxidant Activities of Polysaccharides from Glechoma longituba (Nakai) Kupr.

LIU Xiaopeng1,2,3, ZHANG Junxia1, JIANG Ning1,*, SONG Yizhi1, XIANG Jiqian1, WANG Qiushuang2, WU Hao3
(1. College of Biological Science and Technology, Hubei University for Nationalities, Enshi 445000, China; 2. Postdoctoral Research Station, Nanjing Medical Co. Ltd., Nanjing 210012, China; 3. Postdoctoral Research Station, Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing 210023, China)

In this study, we optimized the ultrasound-assisted extraction of polysaccharides from the dried aboveground part of Glechoma longituba (Nakai) Kupr. by response surface methodology (RSM) based on central composite design and measured the antioxidant activities of the extracted polysaccharides using 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) radical scavenging, 2,2’-azino-bis(3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid radical (ABTS+·) scavenging, Fe2+chelating activity, ferric reducing antioxidant power (FRAP), and N,N-dimethyl-p-phenylenediamine radical scavenging methods. The optimal extraction conditions were obtained as follows: pH, 7.2; liquid-to-solid ratio, 32:1 (mL/g); ultrasonic power, 270 W; and ultrasonic time, 8 min. Under these conditions, the yield of polysaccharides was 4.95%–5.12%. The extracted polysaccharides exhibited powerful antioxidant activities. The DPPH radicals and ABTS+· scavenging activities, Fe2+chelating activity, FRAP value and DMPD radical scavenging capacity were (0.51 ± 0.04) μmol Trolox equivalent (TE)/mg, (0.69 ± 0.04) μmol TE/mg, (0.51 ± 0.29) μmol EDTA-2Na equivalent (EE)/mg, (3.45 ± 0.03) μmol TE/mg and (0.17 ± 0.01) μmol TE/mg, respectively.

Glechoma longituba (Nakai) Kupr.; polysaccharides; ultrasound-assisted extraction; response surface methodology; antioxidant activity

10.7506/spkx1002-6630-201604003

TS201.1

A

1002-6630（2016）04-0013-07

劉曉鵬, 張俊霞, 姜寧, 等. 響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化超聲輔助提取連錢(qián)草多糖工藝及其體外抗氧化活性[J]. 食品科學(xué), 2016, 37(4): 13-19. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201604003. http://www.spkx.net.cn

LIU Xiaopeng, ZHANG Junxia, JIANG Ning, et al. Optimization by response surface methodology of ultrasound-assisted extraction and antioxidant activities of polysaccharides from Glechoma longituba (Nakai) Kupr.[J]. Food Science, 2016, 37(4): 13-19. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201604003. http://www.spkx.net.cn

2015-06-29

“十二五”國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（2011BAI04B04-5）；江蘇省“企業(yè)博士后集聚計(jì)劃”項(xiàng)目（2011033）；

2013年湖北省戰(zhàn)略性新興（支柱）產(chǎn)業(yè)人才培養(yǎng)（生物工程）項(xiàng)目；

2014年度湖北省本科高?！皩?zhuān)業(yè)綜合改革”試點(diǎn)項(xiàng)目（生物工程）

劉曉鵬（1971—），男，副教授，博士，研究方向?yàn)樘烊划a(chǎn)物。E-mail：18913386031@189.cn

*通信作者：姜寧（1968—），女，副教授，碩士，研究方向?yàn)樘烊划a(chǎn)物。E-mail：jiangn888@163.com