樂 薇，劉 樂（武漢工商學(xué)院環(huán)境與生物工程學(xué)院，湖北 武漢 4300 65）

數(shù)碼成像比色法測定牛乳中蛋白質(zhì)的含量

樂 薇，劉 樂
（武漢工商學(xué)院環(huán)境與生物工程學(xué)院，湖北 武漢 4300 65）

考馬斯亮藍可與蛋白質(zhì)生成藍色復(fù)合物，經(jīng)數(shù)碼成像后，顯色溶液的灰度差值和蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度呈正比例，據(jù)此建立了數(shù)碼成像比色法測定牛乳中蛋白質(zhì)含量的方法，并對成像條件、顯色條件、干擾物質(zhì)進行了探討。結(jié)果顯示，用于牛乳中蛋白質(zhì)含量測定時，該法的相對標準偏差小于2%，回收率在97.5%～102.6%之間，結(jié)果與考馬斯亮藍分光光度法一致，但更簡便、快速。

數(shù)碼成像比色法；蛋白質(zhì)；考馬斯亮藍

蛋白質(zhì)是生命活動不可缺少的成分，因此在食品、醫(yī)藥、生物學(xué)中常需檢測蛋白質(zhì)含量，隨著分析手段的提高，蛋白質(zhì)含量的測定方法也越來越準確、快速和靈敏。目前，蛋白質(zhì)的測定方法有凱氏定氮法[1]、紫外吸收法[2]、比色法[3-9]、紅外法[10-12]、高效液相色譜法[13-15]及毛細管電泳分析法[16]等。其中經(jīng)典的凱氏定氮法存在耗時較長、試劑消耗量大、對環(huán)境有污染等缺點，且無法排除其他含氮化合物影響，而其他幾種方法則需要有專門的儀器或特定的試劑等，還很難適應(yīng)現(xiàn)場快速分析的需要，因而開發(fā)靈敏度高、簡單、便捷且易推廣的檢測分析方法具有重要的現(xiàn)實意義。

數(shù)碼成像比色法是將待測溶液顯色后，通過數(shù)碼成像并轉(zhuǎn)換成灰度格式，通過不同顏色深度的灰度值計算出待測物質(zhì)的含量。該方法是基于電荷耦合器件記錄影像，利用紅、綠、藍三基色原理來表達任何一種顏色。在保持背景顏色基本一致的條件下，體系顏色深淺隨樣品質(zhì)量濃度成比例變化的趨勢可在同一張數(shù)碼像片中得到充分體現(xiàn)[17]。目前，數(shù)碼成像比色法已用于測量水體中的總磷[17]和釩[18]、環(huán)境及生物樣品中亞硝酸根[19]和氰化物[20]、維生素[21]、空氣中氮氧化物的日變化曲線[22]等，但鮮見此法測定蛋白質(zhì)含量的報道。考慮到蛋白質(zhì)比色法中的考馬斯亮藍分光光度法快速、干擾因素少[23]，故本實驗擬采用考馬斯亮藍與蛋白質(zhì)顯色，并通過數(shù)碼成像來測定牛乳中蛋白質(zhì)含量，為蛋白質(zhì)含量的現(xiàn)場快速測定提出新的思路。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

考馬斯亮藍（生化試劑）、牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）標準品 上海源葉生物科技有限公司；尿素、硝酸鈉、硝酸鉀、硫酸銨、甘氨酸、谷氨酸、葡萄糖、十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS），以上試劑均為分析純。考馬斯亮藍G-250溶液：稱取100 mg考馬斯亮藍溶于50 mL 95%乙醇溶液中，再加入100 mL 85%的磷酸溶液，混勻，定容到1 000 mL。

DSC-N2型數(shù)碼相機 日本Sony公司；756型紫外-可見分光光度計 上海光譜儀器有限公司；AUY120型電子天平 上海精密科學(xué)儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 數(shù)碼成像比色法測定蛋白質(zhì)的含量

在一系列10 mL比色管中各加入0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL的100 μg/mL BSA標準溶液，加水至4.0 mL，再加入5.0 mL考馬斯亮藍G-250試劑，搖勻，用水稀釋至10.0 mL，放置5 min后直接數(shù)碼成像，用ACDsee將其格式轉(zhuǎn)換為灰度格式后，選擇圖中顏色均勻部分，利用Scion Image軟件讀出各溶液的灰度峰值，并以未加BSA溶液的灰度值進行校正，繪制灰度差值-BSA質(zhì)量濃度的標準曲線。移取一定體積稀釋一定倍數(shù)的牛乳，按標準曲線的制作步驟，得出灰度差值，進行含量計算。同時將上述各溶液以試劑空白為參比測定595 nm波長處的吸光度A。同法制備質(zhì)量濃度分別為0、2、4、6、8、10 μg/mL的BSA標準溶液，并進行測定。

1.2.2 共存物質(zhì)對數(shù)碼成像比色法的干擾影響實驗

在一系列10 mL比色管中加入0.2 mL的100 μg/mL BSA溶液，加水至4 mL，各加入0.1 mL 1×10－2mol/L的待測共存物質(zhì)溶液（尿素、硝酸鈉、硝酸鉀、硫酸銨、甘氨酸、谷氨酸、葡萄糖、SDS），作用10 min后，再加入5.0 mL考馬斯亮藍G-250試劑，搖勻，用水稀釋至10.0 mL，放置5 min后直接數(shù)碼成像，用ACDsee將其格式轉(zhuǎn)換為灰度格式后，利用Scion Image軟件讀出各溶液的灰度峰值，并以未加BSA溶液的灰度值進行校正，平行實驗3 次，取平均值，與未加共存物質(zhì)的BSA測定溶液的灰度差值進行比較，計算相對誤差。

2 結(jié)果與分析

2.1 數(shù)碼成像條件的選擇

2.1.1 玻璃儀器的選擇

實驗分別用試管與比色管進行，按照1.2.1節(jié)中的實驗步驟進行實驗，所拍攝數(shù)碼照片如圖1所示；將實驗所得照片用ACDsee轉(zhuǎn)換成灰度格式并用Scion處理得出灰度曲線（圖2）。由圖2可知，試管與比色管中顯色照片的灰度峰值均能隨著BSA質(zhì)量濃度的增大而增大，為了后續(xù)定容操作方便，選擇比色管進行后續(xù)實驗。

圖1 試管（a）與比色管（b）中顯色照片F(xiàn)ig.1 Color development in the test tube (a) and in the colorimetric tube (b)

圖2 試管（a）與比色管（b）下的灰度曲線Fig.2 Gray graphs for the test tube (a) and the colorimetric tube (b)

2.1.2 考察拍攝條件

實驗分別以硫酸紙和白紙為襯底拍攝照片，按照1.2.1節(jié)操作，結(jié)果如圖3和圖4所示?？芍蛩峒埍尘跋虑€比較光滑，而白紙背景條件下曲線呈鋸齒狀，不光滑，不利于觀察各管溶液的灰度峰值，其原因可能是由于白紙的反光率高，造成了拍攝時的光噪增強，而硫酸紙具有防反光作用，可降低光噪，因此選擇硫酸紙為本實驗的襯底。

圖3 硫酸紙（a）與白紙（b）背景下的顯色照片F(xiàn)ig.3 Color development observed using white paper (a) and parchment paper (b) as the background

圖4 硫酸紙（a）與白紙（b）背景下的灰度曲線Fig.4 Gray graphs obtained using white paper (a) and parchment paper (b) as the background

在自然光照下，以分別以向光與背光為條件拍攝照片，按照1.2.1節(jié)操作，得出顯色結(jié)果（圖5）和灰度曲線（圖6）。

圖5 向光（a）與背光（b）條件下的顯色照片F(xiàn)ig.5 Color development observed when the solutions were toward the light (a) and against the light (b)

圖6 向光（a）與背光（b）條件下的灰度曲線Fig.6 Gray graphs obtained when the solutions were toward the light (a) and against the light (b)

在兩種實驗條件下，所得到的曲線均較為光滑，且BSA各質(zhì)量濃度條件下的灰度峰值基本一致，故向光與背光拍攝對實驗結(jié)果影響并不大。但同時也發(fā)現(xiàn)BSA質(zhì)量濃度大于8 μg/mL后，灰度值增大趨勢減小，說明在后續(xù)標準曲線繪制實驗中，需適當(dāng)減小BSA的質(zhì)量濃度。

2.2 顯色條件的優(yōu)化

參考考馬斯亮藍分光光度法的顯色條件選擇范圍[24]，實驗了不同顯色時間及顯色劑用量對數(shù)碼成像比色法測定灰度值的影響。

2.2.1 考馬斯亮藍G-250用量的影響

圖7 考馬斯亮藍用量對灰度差值的影響Fig.7 Influence of Coomassie brilliant blue dosage on the grey value

由圖7可知，隨著考馬斯亮藍用量的增加，灰度差值逐漸增加，當(dāng)加入的考馬斯亮藍用量為4.0 mL時達到最大，此后再增加考馬斯亮藍的用量，灰度差值趨于穩(wěn)定，考慮到顯色劑的適當(dāng)過量，故選擇考馬斯亮藍的用量為5.0 mL。

圖8 顯色時間對灰度差值的影響Fig.8 Influence of color development time on the grey value

2.2.2 顯色時間的影響

由圖8可知，隨著顯色時間的延長，灰度差值逐漸增大，而BSA顯色溶液在5～10 min中的增加趨勢較平緩，故選擇顯色時間為5 min。

2.3 共存物質(zhì)的影響

表1 共存物質(zhì)對數(shù)碼成像比色法的影響Table 1 Effect of coexisting substances on the grey value

采用數(shù)碼成像比色法，考察了一些常見金屬離子和牛乳中的添加劑對2 μg/mL BSA溶液的影響，結(jié)果見表1，發(fā)現(xiàn)K＋、Na＋、Mg2＋、糖類、氨基酸等，不干擾測定或干擾可以忽略，但表面活性劑會干擾測定，這與分光光度法的結(jié)果一致[23]，即不干擾分光光度法測定的物質(zhì)也不干擾數(shù)碼成像比色法的測定。

2.4 標準曲線的建立

表2 數(shù)碼成像比色法和分光光度法的標準曲線方程Table 2 Standard curve equations established by digital imaging colorimetry and spectrophotometry

在上述最優(yōu)條件下，分別獲得數(shù)碼成像比色法和分光光度法的標準曲線方程，結(jié)果見表2，可知蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度在0～10 μg/mL時，數(shù)碼成像比色法的相關(guān)系數(shù)明顯低于分光光度法，說明數(shù)碼成像比色法的線性范圍比分光光度法要窄。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)質(zhì)量濃度范圍縮小為0～5 μg/mL時，數(shù)碼成像比色法的相關(guān)系數(shù)與分光光度法相當(dāng)，但數(shù)碼成像比色法線性擬合的方程斜率遠大于分光光度法，說明數(shù)碼成像比色法的靈敏度更高。

2.5 樣品測定及回收率實驗結(jié)果

取0.40 mL稀釋10 倍的牛乳樣品液，按1.2.1節(jié)操作，測定牛乳中蛋白質(zhì)的含量，并對樣品溶液進行了平行測定。為驗證實驗方法的準確性，也進行了加標回收實驗，結(jié)果見表3和表4。

表3 樣品測定的結(jié)果Table 3 Analytical results for milk samples using digital imaging colorimetry

表4 數(shù)碼成像比色法與分光光度法測定結(jié)果對比Table 4 Comparison of the results obtained by digital imaging ccoolloorriimmeettrryy aanndd ssppeeccttrroopphhoottoommeettrryy ffoorr tthhee pprrootteeiinn ccoonntteenntt ooff ssppiikkeedd milk samples

由表3和表4可知，數(shù)碼成像比色法與考馬斯亮藍分光光度法相比較，實驗結(jié)果比較準確，樣品回收率在97.5%～102.6%之間，誤差在±3%以內(nèi)，相同質(zhì)量濃度的測定結(jié)果與考馬斯亮藍分光光度法結(jié)果基本一致，因此樣品可用數(shù)碼成像比色法進行測定。

3 結(jié) 論

考馬斯亮藍溶液與蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度作用的數(shù)碼相片中，溶液的顏色隨著蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度的增加而逐漸加深，不同顏色梯度的灰度差值與蛋白質(zhì)的質(zhì)量濃度呈很好的線性關(guān)系，表明數(shù)碼成像比色法能用于蛋白質(zhì)含量的測定。對比考馬斯亮藍比色法與數(shù)碼成像比色法，數(shù)碼成像比色法靈敏度顯著提高，且樣品和標準系列溶液的測定可在同一張數(shù)碼照片上進行，整個系統(tǒng)更簡單，操作更方便，適合用于現(xiàn)場快速分析，但應(yīng)注意數(shù)碼成像比色法的線性范圍比分光光度法窄，因此在樣品測定中要控制好質(zhì)量濃度。

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Determination of the Protein Content of Milk by Digital Imaging Colorimetry

YUE Wei, LIU Le
(College of Environmental and Biological Engineering, Wuhan Technology and Business University, Wuhan 430065, China)

The grey value obtained by digital imaging for the blue complex formed from the binding interaction of Coomassie brilliant blue with proteins is positively linearly related to the concentration of proteins. Thus, a method was established for the determination of the protein content of milk by digital imaging colorimetry. The imaging conditions, color development conditions and interfering substances were investigated. The recovery rates for spiked milk samples were between 97.5% and 102.6% with a relative standard deviation (RSD) less than 2%. Consistent results were obtained using digital imaging colorimetry and spectrophotometry, but digital imaging colorimetry was more convenient and faster.

digital imaging colorimetry; protein; Coomassie brilliant blue

10.7506/spkx1002-6630-201604027

TS207.3

A

1002-6630（2016）04-0154-04

樂薇, 劉樂. 數(shù)碼成像比色法測定牛乳中蛋白質(zhì)的含量[J]. 食品科學(xué), 2016, 37(4): 154-157. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201604027. http://www.spkx.net.cn

YUE Wei, LIU Le. Determination of the protein content of milk by digital imaging colorimetry[J]. Food Science, 2016, 37(4): 154-157. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201604027. http://www.spkx.net.cn

2015-03-06

樂薇（1979—），女，副教授，碩士，研究方向為生物分析。E-mail：yuewei11@126.com