超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)蛋雞體內(nèi)抗病毒藥物利巴韋林

鄭 鋅，湯曉艷，曹興元，齊 凱，陶 瑞，王 敏（.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，肉品加工與質(zhì)量控制教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 0095；.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)技術(shù)研究所，農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 0008；.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，北京 00094）

超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)蛋雞體內(nèi)抗病毒藥物利巴韋林

鄭 鋅1，湯曉艷2,*，曹興元3，齊 凱1，陶 瑞2，王 敏2
（1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，肉品加工與質(zhì)量控制教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210095；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)技術(shù)研究所，農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100081；3.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，北京 100094）

為研究禁用抗病毒藥物利巴韋林在蛋雞體內(nèi)的殘留性，對(duì)11 只京紅蛋雞以30 mg/kg體質(zhì)量單次口服灌喂利巴韋林藥物，采集給藥后不同時(shí)間的靜脈血，以超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)利巴韋林，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式和同位素內(nèi)標(biāo)法定量。利巴韋林線性范圍為5～5 000 ng/mL，檢出限為1 ng/mL。在10～1 000 ng/mL范圍內(nèi)樣品添加回收率為86.4%～97.1%，批內(nèi)、批間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均滿足定量要求。結(jié)果表明，給藥后血漿中利巴韋林質(zhì)量濃度迅速升高，隨著代謝消除進(jìn)行，血漿中利巴韋林質(zhì)量濃度逐漸下降，至24 h血漿中利巴韋林質(zhì)量濃度低于方法檢出限。蛋雞口服給藥利巴韋林后吸收迅速，到達(dá)峰值時(shí)間短，體內(nèi)分布廣，消除速度快，殘留性不高。

利巴韋林；代謝；蛋雞；超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法

利巴韋林，又名病毒唑，三氮唑核苷，化學(xué)名1-β-D-呋喃核糖基-1H-1,2,4,-三氮唑-3-甲酰胺，是一種嘌呤核苷類似物，自1972年合成[1-2]以來，被廣泛用于人類呼吸道合胞病毒、流感病毒、脊髓灰質(zhì)炎病毒、丙型肝炎病毒等的治療[3]。長(zhǎng)期以來，為了預(yù)防畜禽流感，利巴韋林也被廣泛應(yīng)用于畜禽養(yǎng)殖過程中。為了保證人類用藥安全和動(dòng)物防疫安全，2005年農(nóng)業(yè)部發(fā)布第560號(hào)公告，禁止利巴韋林、金剛烷胺、嗎啉胍等抗病毒藥物在動(dòng)物養(yǎng)殖中使用。然而利巴韋林在畜禽養(yǎng)殖過程違規(guī)使用的現(xiàn)象仍然普遍存在，畜禽產(chǎn)品質(zhì)量安全受到一定的威脅[4-5]。目前，對(duì)于血漿中的利巴韋林殘留檢測(cè)方法研究比較多，多以液相色譜[6]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定[7-8]，靈敏度不高，分析時(shí)間略長(zhǎng)。本研究建立了一種靈敏快速檢測(cè)雞血漿中利巴韋林的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜方法，分析時(shí)間短，并對(duì)蛋雞體內(nèi)利巴韋林的藥物代謝規(guī)律進(jìn)行了初步研究，可為禽產(chǎn)品中利巴韋林殘留檢測(cè)提供一定的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

4 3 周齡京紅蛋雞1 1 只，平均體質(zhì)量（1.8±0.2） kg，購于北京市順義某雞場(chǎng)。

利巴韋林標(biāo)準(zhǔn)品（1-β-D-ribofuranosyl-1,2,4-triazole-3-carboxamide，C8H12N4O5，Mr：244.20，CAS號(hào)：36791-04-5，純度99.9%） 德國(guó)Dr.Ehrenstorfer有限責(zé)任公司；13C5-利巴韋林（1-β-D-ribofuranosyl-1H-1,2,4-triazole-3-carboxamide-13C5，C313C5H12N4O5，Mr：249.17，貨號(hào)：R414477） 加拿大TRC公司；利巴韋林注射液（批號(hào)：1312263，規(guī)格0.1 g/mL） 杭州民生藥業(yè)有限公司；甲醇（色譜純） 德國(guó)Merck公司；甲酸（色譜純） 美國(guó)Mreda Technology公司；實(shí)驗(yàn)用水為Milli-Q純水儀制備的超純水（≥18 MΩ?cm）；0.22 μm水系濾膜 上海安譜科學(xué)儀器有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

ACQUITY UPLC超高效液相色譜 美國(guó)Waters公司；串聯(lián)AB SCIEX QTRAP 6500型線性離子阱質(zhì)譜儀（配有Turbo V離子源、Analyst 1.6.2數(shù)據(jù)處理軟件）美國(guó) AB Sciex公司；XS105分析天平（感量0.01 mg）瑞士Mettler Toledo公司；TTL-DC II型氮?dú)鉂饪s儀 北京同泰聯(lián)科技發(fā)展有限公司；MicroSmart微型離心機(jī) 北京昊諾斯科技有限公司；VORTEX-5渦旋振蕩器 海門市其林貝爾有限公司。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件

色譜柱：Agilent ZORBAX SB-Aq（3.0 mm×100 mm，1.8 μm）；流動(dòng)相A：甲醇，B：0.1%甲酸溶液。梯度洗脫程序：0～2.5 min，99% B；2.5～4 min，99%～85% B；4～5 min，85%～10% B；5～6 min，10%～99% B；保持3 min。流速：0.3 mL/min；柱溫：30 ℃；樣品室溫度：20 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。

1.3.2 質(zhì)譜條件

電噴霧離子源，正離子模式掃描，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式，監(jiān)測(cè)離子對(duì)m/z 245/113和m/z 245/96，碰撞能分別為15 eV和40 eV，其中m/z 245/113為定量離子對(duì)；13C5-利巴韋林監(jiān)測(cè)m/z 250/113離子對(duì)，碰撞能15 eV。碰撞氣為氮?dú)?，氣簾氣壓力?.14 MPa；霧化氣壓力：0.21 MPa；輔助加熱氣壓力：0.14 MPa；離子源電壓：5 000 V；離子源溫度：550℃；碰撞室出口電壓：10 V；射入電壓：10 V；離子對(duì)駐留時(shí)間：50 ms。

1.3.3 蛋雞給藥及采血

給蛋雞適應(yīng)性飼喂全價(jià)飼料7 d，給藥前禁食12 h，自由采水。給藥前采空白血，給藥后分別于0.25、0.5、1、2、3、8、10、24、34、48、58、72 h翼下靜脈采血1 mL，肝素鈉抗凝，3 000 r/min離心10 min，分離上層血漿，置于1.5 mL離心管中，－20 ℃凍存，待測(cè)。

1.3.4 血漿樣品前處理

將凍存血漿解凍，渦旋均勻，取300 μL置于2 mL離心管中，加入適量?jī)?nèi)標(biāo)工作液（空白血漿不加，以相同體積純水替換），渦旋1 min，加入1.3 mL甲醇，振蕩10 min，12 000 r/min離心10 min，取上清液，40 ℃水浴氮?dú)獯蹈?，?.9 mL純水，渦旋30 s復(fù)溶，15 000 r/min，離心10 min，上清液過0.22 μm水系濾膜，進(jìn)樣測(cè)定。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用AB Sciex質(zhì)譜自帶的Analyst 1.6.2軟件，對(duì)峰面積進(jìn)行積分，并計(jì)算相關(guān)的血漿中利巴韋林質(zhì)量濃度數(shù)據(jù)。用非房室模型藥代動(dòng)力學(xué)軟件WinNonlin 6.3來處理血漿中利巴韋林質(zhì)量濃度-時(shí)間數(shù)據(jù)，計(jì)算每只雞的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)，并計(jì)算平均值及標(biāo)準(zhǔn)差。

2 結(jié)果與分析

2.1 方法特異性考察結(jié)果

在1.3.1和1.3.2節(jié)條件下，對(duì)空白血漿、標(biāo)準(zhǔn)品、空白加標(biāo)血漿，以及給藥后2 h實(shí)際樣品色譜圖進(jìn)行分析。如圖1所示，本方法前處理簡(jiǎn)單，色譜柱對(duì)利巴韋林保留效果較好，且不受內(nèi)源性成分（保留時(shí)間4.13 min）的干擾。利巴韋林保留時(shí)間為3.08 min。

圖1 空白（a）、標(biāo)準(zhǔn)品20 ng/mL（b）、加標(biāo)500 ng/mL樣品（c）和實(shí)際樣品（d）典型色譜圖Fig.1 Typical chromatogram of blank (a), ribavirin standard (20 ng/mL) (b), plasma spiked with 500 ng/mL (c), and real sample (d)

2.2 方法線性范圍、檢出限、準(zhǔn)確度和精密度

以空白樣品配制含利巴韋林5、10、20、100、500、1 000、5 000 ng/mL質(zhì)控樣品，每個(gè)質(zhì)量濃度2 個(gè)平行，以內(nèi)標(biāo)校準(zhǔn)峰面積（Y）對(duì)校準(zhǔn)質(zhì)量濃度（X，ng/mL）進(jìn)行線性擬合，得線性方程Y=0.027 2X＋2.187 5，線性范圍5～5 000 ng/mL。方法檢出限、定量限分別以信噪比3、10 倍計(jì)算，檢出限和定量限分別為1、5 ng/mL。

設(shè)置高、中、低（1 000、100、10 ng/mL）3 個(gè)質(zhì)量濃度利巴韋林質(zhì)控樣品，每個(gè)質(zhì)量濃度樣品重復(fù)數(shù)為5，結(jié)果如表1所示，利巴韋林的平均回收率為86.4%～97.1%，批內(nèi)、批間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均滿足定量要求。

表1 血漿添加利巴韋林回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差Table 1 Linear equations, correlation coefficients, LODs, recoveries and relative standard deviations for ribavirin

2.3 蛋雞體內(nèi)利巴韋林代謝規(guī)律

圖2 口服給藥30 mg/kg后蛋雞血漿中利巴韋林質(zhì)量濃度隨時(shí)間變化曲線（n=11）=11Fig.2 Mean concentration of ribavirin in plasma of laying hens following oral administration of ribavirin at 30 mg/kg BW (n=11=11)

蛋雞單劑量口服灌喂利巴韋林30 mg/kg后，以該方法測(cè)定11 只蛋雞各時(shí)間點(diǎn)的血漿中利巴韋林質(zhì)量濃度，數(shù)據(jù)經(jīng)WinNonlin 6.3軟件分析，繪制成血漿中利巴韋林質(zhì)量濃度-時(shí)間曲線（圖2）。利巴韋林吸收迅速，給藥后（1.59±0.74） h即達(dá)到最大值，血漿中利巴韋林最大質(zhì)量濃度為（2 796.54±1 120） ng/mL，蛋雞腸道對(duì)利巴韋林的吸收程度不高，藥時(shí)曲線下面積僅為（AUC0～t）（10 658.18±2 627.348）（h?ng）/mL。利巴韋林在蛋雞體內(nèi)消除快，血漿消除半衰期（T1/2β）為（2.94±0.90） h，在1 0 h下降到（1 3 6.6 1±6 7.2 8） n g/m L，此后血漿中利巴韋林質(zhì)量濃度進(jìn)入平穩(wěn)期，在34 h低于檢出限。總的來說，蛋雞對(duì)利巴韋林的代謝快，藥物的殘留性不高，平均駐留時(shí)間為（3.58±0.73） h。

3 討 論

3.1 方法色譜及質(zhì)譜條件優(yōu)化

利巴韋林極性強(qiáng)，且結(jié)構(gòu)與核苷類似，易受到血漿中的核苷的影響。文獻(xiàn)報(bào)道，一般采用Agilent SBAq[9]、XDB C18[10]、Waters HILIC[11]、T3[12]、Atlantis dC18[13]等對(duì)極性化合物有一定保留的色譜柱進(jìn)行利巴韋林分離。根據(jù)實(shí)驗(yàn)，利巴韋林在Agilent ZORBAX SB-Aq（3.0 mm×100 mm，1.8 μm）親水性色譜柱上保留效果好，峰形尖銳，且該色譜柱能分離基質(zhì)中的內(nèi)源性干擾。本方法選擇99%的水相作為起始比例，在流動(dòng)相中添加了0.1%的甲酸，并提高離子源溫度，保證了高比例水相條件下的有效離子化。此外，實(shí)驗(yàn)還對(duì)比了甲醇和乙腈的洗脫效果。結(jié)果顯示，相比于乙腈，甲醇洗脫能分離利巴韋林和內(nèi)源性干擾，且保留效果更好。研究中還發(fā)現(xiàn)，采用甲醇溶解樣品上機(jī)會(huì)產(chǎn)生溶劑效應(yīng)，色譜出現(xiàn)雙峰，因此，樣品提取及復(fù)溶試劑均采用純水。本方法靈敏度高，線性范圍寬，不受基質(zhì)干擾，前處理方法簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)。

利巴韋林在正離子模式條件下易電離，產(chǎn)生[M＋H]＋m/z 245和[M＋Na]＋m/z 267，加鈉峰響應(yīng)略高，但不穩(wěn)定，不宜選用。以[M＋H]＋為母離子進(jìn)行碎片離子掃描，m/z 113、m/z 96和m/z 133為主要例子碎片。根據(jù)文獻(xiàn)[14]的研究，m/z 113、m/z 133碎片是呋喃核糖和三氮唑環(huán)斷裂形成，m/z 96是由三氮唑乙胺中性丟失NH2獲得。根據(jù)2002/657/EEC關(guān)于確證法4 個(gè)確證點(diǎn)的要求，選取豐度強(qiáng)，干擾小的兩對(duì)離子對(duì)m/z 245/113和m/z 245/96為定性離子對(duì)，同時(shí)選取m/z 245/113為定量離子對(duì)，并優(yōu)化離子源電壓、溫度等參數(shù)。

3.2 不同動(dòng)物體內(nèi)利巴韋林藥物代謝規(guī)律對(duì)比

利巴韋林在蛋雞體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)研究尚屬空白，相關(guān)數(shù)據(jù)的缺失，不利于殘留研究中給藥劑量、采樣時(shí)間點(diǎn)的確認(rèn)。本研究表明，蛋雞口服利巴韋林呈現(xiàn)出吸收快、分布廣、消除較快的特點(diǎn)。達(dá)峰時(shí)間Tmax反映了藥物在機(jī)體內(nèi)的吸收快慢，利巴韋林在蛋雞體內(nèi)Tmax為（1.59±0.74） h。利巴韋林在蛋雞血漿中的達(dá)峰時(shí)間與其在豬[15]和大鼠[16]等動(dòng)物中的達(dá)峰時(shí)間相比，并沒有太大差別，均在1～3 h。利巴韋林口服給藥的吸收受到腸道首關(guān)效應(yīng)的影響，生物利用度不高。據(jù)報(bào)道，利巴韋林的吸收受到ENT1[17]、CNT2[18]、CNT3[19]的調(diào)控。而平衡型核苷載體和依賴Na＋的濃縮型核苷載體的種屬差異并不大。

利巴韋林在不同動(dòng)物體內(nèi)的代謝消除差異較大。利巴韋林在蛋雞血漿消除半衰期（T1/2β）為（2.95±0.9） h，消除較快。利巴韋林在豬和猴體內(nèi)的殘留蓄積時(shí)間長(zhǎng)，消除半衰期分別為23.5 h和8.1 h。獼猴靜脈注射，消除半衰期可達(dá)130 h。消除半衰期主要與清除率和代謝轉(zhuǎn)化有關(guān)。研究表明，利巴韋林的代謝轉(zhuǎn)化是利巴韋林消除的主要途徑，通過腎臟代謝消除的部分只占5%～15%[20]。利巴韋林在動(dòng)物體內(nèi)可能的代謝途徑有兩條：一條代謝途徑是去核糖基化或酰胺水解形成三唑羧酸代謝物；另一條是可逆的磷酸化途徑[13]，涉及多種酶的作用，包括腺苷激酶，嘌呤核苷磷酸化酶。磷酸化的活性產(chǎn)物包括利巴韋林單磷酸、利巴韋林二磷、利巴韋林三磷酸[21-22]。利巴韋林在哺乳動(dòng)物體內(nèi)的消除半衰期比較長(zhǎng)，而蛋雞體內(nèi)卻很短，這提示利巴韋林的殘留性與種屬差異有一定關(guān)系，還需進(jìn)一步研究確證。

此外，本研究顯示，利巴韋林在蛋雞體內(nèi)的代謝存在較大的個(gè)體差異，如9、10號(hào)雞Cmax分別為4 920、1 485 ng/mL。這可能是由于不同個(gè)體對(duì)利巴韋林的吸收程度不同或存在一定的個(gè)體生理差異。

4 結(jié) 論

本研究建立了蛋雞血漿中利巴韋林的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)方法，該方法靈敏快速，線性范圍5～5 000 ng/mL，檢出限和定量限分別為1、5 ng/mL，平均回收率為86.4%～97.1%，滿足生物樣品定量相關(guān)要求，并將此方法應(yīng)用于蛋雞體內(nèi)利巴韋林的代謝規(guī)律的初步研究。

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Detection of Antiviral Drug Ribavirin in Laying Hens by Ultra High Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

ZHENG Xin1, TANG Xiaoyan2,*, CAO Xingyuan3, QI Kai1, TAO Rui2, WANG Min2
(1. Key Laboratory of Meat Processing and Quality Control, Ministry of Education, College of Food Science and Technology, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China; 2. Key Laboratory of Agro-food Safety and Quality, Ministry of Agriculture, Institute of Quality Standards and Testing Technology for Argo-products, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081, China; 3. College of Veterinary Medicine, China Agricultural University, Beijing 100094, China)

This study aimed to examine the residues of the banned antiviral drug ribavirin in poultry. Eleven Jinghong laying hens were fed with 30 mg/kg BW ribavirin via single oral administration and their blood samples were collected from a vein under the wing at different time points. The ribavirin in the plasma samples was measured by using ultra high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (UPLC-MS/MS) under the multiple reaction monitoring mode (MRM) and quantified using isotope-labeled internal standard. The calibration curve for ribavirin exhibited good linearity over the concentration range from 5 to 5 000 ng/mL, and the limit of detection (LOD) was 1 ng/mL. Average recoveries for ribavirin spiked at 3 levels ranged from 86.4% to 97.1%, and the inter-batch and intra-batch relative standard deviations (RSDs) both met the quantitative requirement. Ribavirin concentration in laying hens plasma increased rapidly after oral administration but then decreased gradually with metabolic elimination. The results suggested that the pharmacokinetic characteristics of ribavirin in hens include quick absorption, broad distribution, rapid elimination, and lower residue in tissue.

ribavirin; metabolism; laying hens; ultra high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (UPLC-MS/MS)

10.7506/spkx1002-6630-201604035

TS251.1

A

1002-6630（2016）04-0197-05

鄭鋅, 湯曉艷, 曹興元, 等. 超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)蛋雞體內(nèi)抗病毒藥物利巴韋林[J]. 食品科學(xué), 2016, 37(4): 197-201.

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201604035. http://www.spkx.net.cn

ZHENG Xin, TANG Xiaoyan, CAO Xingyuan, et al. Detection of antiviral drug ribavirin in laying hens by ultra high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry[J]. Food Science, 2016, 37(4): 197-201. (in Chinese with English abstract)

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201604035. http://www.spkx.net.cn

2015-04-21

中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院基本科研增量項(xiàng)目（2014ZL015）；“十二五”國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（2012BAD28B03）

鄭鋅（1990—），男，碩士研究生，研究方向?yàn)樾螽a(chǎn)品質(zhì)量安全。E-mail：522859476@qq.com

*通信作者：湯曉艷（1976—），女，研究員，博士，研究方向?yàn)樾螽a(chǎn)品質(zhì)量安全。E-mail：txycaas@126.com