亞基水平上花生蛋白組成、結構和功能性質研究進展

徐 飛，劉 麗，石愛民，劉紅芝，胡 暉，王 強

（中國農業(yè)科學院農產品加工研究所，農業(yè)部農產品加工綜合性重點實驗室，北京 100193）

亞基水平上花生蛋白組成、結構和功能性質研究進展

徐 飛，劉 麗，石愛民，劉紅芝，胡 暉，王 強*

（中國農業(yè)科學院農產品加工研究所，農業(yè)部農產品加工綜合性重點實驗室，北京 100193）

我國花生種質資源豐富，不同品種間蛋白亞基組成不同，分子結構各異，功能性質差異顯著。本文在亞基水平上綜述了花生蛋白主要組分（球蛋白、伴花生球蛋白和清蛋白）的組成；對花生球蛋白和伴花生球蛋白分子結構研究進展進行了歸納；總結花生各蛋白亞基的功能性質研究進展；并歸納了花生蛋白研究中目前存在的問題，對我國花生蛋白研究的發(fā)展方向和趨勢進行了展望；旨在明確亞基水平上花生蛋白研究進展，為廣大花生蛋白研究者提供一定的借鑒意義。

花生蛋白；亞基；結構；功能性質

花生（Arachis hypogaea L.）是一種重要的豆科植物，起源于南美洲熱帶亞熱帶地區(qū)，種植地域廣泛。我國花生種質資源豐富，種質庫共保存6 075 份花生種質材料，為科學研究和加工適宜性品種篩選提供了很好的材料來源。

花生中蛋白質含量高達24%～36%，在油料作物中僅次于大豆（36%～51%），供給了11%的世界蛋白消費[1]。花生蛋白營養(yǎng)價值高，含有人體必需的8 種氨基酸成分，且具有易消化、脹腹因子少等優(yōu)點，同時花生蛋白還具有吸水性、黏著性、分散性、凝膠性、乳化性等功能性質[2]，在食品加工業(yè)領域逐漸發(fā)揮重要作用?；ㄉ鞍椎母鞣N功能性質主要靠蛋白質實現(xiàn)，而這些功能性質發(fā)揮歸根結底是基于亞基組成和分子結構所決定的。因此無論從研究還是生產上來說，在亞基層次上研究花生蛋白將對花生蛋白產業(yè)的發(fā)展具有極其重要的意義。

國內花生蛋白研究起步較晚，且目前研究多以花生分離蛋白或濃縮蛋白為研究對象，極少有文獻涉及亞基層次上的花生蛋白組分，如花生球蛋白和伴花生球蛋白的研究，尤其是對基礎研究方面，如亞基組成、分子結構、亞基與功能性質間構效關系等。本文從亞基角度上對花生蛋白亞基組成、結構解析、功能性質三方面進行國內外文獻綜述，綜合分析了當前問題，提出花生蛋白亞基未來發(fā)展方向，以期為花生蛋白亞基深入研究和實際應用提供一定幫助。

1 文獻統(tǒng)計

圖1列舉了1990ü2015年間《科學引文索引》（Science Citation Index，SCI）收錄的各國關于花生蛋白和花生蛋白亞基相關的研究論文數量，可見美國不論在花生蛋白或是花生蛋白亞基方面研究都遙遙領先，其次則為中國和印度。美國花生消費以食用為主，僅15%用于榨油。此外，對花生蛋白的加工特性、營養(yǎng)特性和致敏反應的研究需求也最為迫切，因此研究文獻數量可觀；而中、印兩國作為主要的花生生產國和消費國，花生大部分用于榨油（≥50%），花生蛋白的研究起步較晚。

圖 1 各國關于花生蛋白（A）和花生蛋白亞基（B）的論文比例Fig.1 Proportion of research articles regarding peanut protein (A) and subunits in various countries (B)

花生蛋白中的兩大組分花生球蛋白和伴花生球蛋白均隸屬于豆科植物貯藏蛋白大類。為了橫向比較同類蛋白研究進展情況，因此以貯藏蛋白亞基大類別為關鍵詞搜索1990ü2015年間SCI索引文獻，其中日本京都大學以85 篇居首，其次為法國農業(yè)科學研究院和美國農業(yè)部農業(yè)科學研究院。詳細分析京都大學文獻發(fā)現(xiàn)其主要以大豆蛋白為研究對象，1980ü1995年間，主要亞基水平上的功能性質尤其是凝膠性為主；1995ü2005年間，主要運用晶體學方法解析蛋白/蛋白亞基結構，并從結構角度出發(fā)研究其功能性質差異為主；2005年至今，則多關注與功能性質蛋白（鐵轉運蛋白、二硫鍵異構酶等），且研究范圍擴至細胞領域（液泡、高爾基體、內質網）。作為與大豆蛋白高同源性的花生蛋白，該研究思路和研究軌跡應為我國花生蛋白的研究提供一定的借鑒意義。

2 花生蛋白亞基組成

2.1 花生蛋白亞基組成

花生蛋白根據其溶解特性可分為水溶性蛋白和鹽溶性蛋白兩大類（圖2），其中大約10%的蛋白質為水溶性蛋白，其余90%為鹽溶性蛋白[3]。鹽溶性蛋白主要包括花生球蛋白（73%）和伴花生球蛋白（21%）。

圖 2 花生蛋白中幾種主要蛋白和亞基組成Fig.2 Major peanut proteins and their subunit composition

2.1.1 花生球蛋白

花生球蛋白隸屬于豆球蛋白家族（legumin），是花生中一類重要的貯藏性蛋白質[4-5]。在1950ü2015年間學術界對花生球蛋白的組成給予了廣泛關注[6-17]，關于花生球蛋白的亞基組成、聚合和解聚模式以及亞基間相互作用方式進行了報道。綜合目前研究結果而言，花生球蛋白的研究已經達成一定共識，但仍在一些方面存在爭議。

花生球蛋白可分為兩種：花生球蛋白Ⅰ（arachinⅠ）和花生球蛋白Ⅱ（arachinⅡ），花生球蛋白Ⅰ為單體形式，沉降系數為9S，而花生球蛋白Ⅱ則以二聚體形式存在，沉降系數為14S，花生球蛋白亞基間以非共價方式結合，并無二硫鍵的存在[6,10-12]。但關于花生球蛋白的解聚-聚集行為模式仍存在些許爭議。Johnson等[8]認為花生球蛋白的14S和9S組分在不同離子強度下存在比例不同，且兩者間存在可逆轉化；而Shetty等[18]研究表明所得的14S組分并不能解聚成9S組分；Yamada等[6]通過比較不同離子強度、不同pH值條件下花生球蛋白的超速離心組分，得出pH值和離子強度是影響其解聚和聚集可逆性的主要因素，并且由9S聚集而成的14S組分與本身存在的14S組分有不同的解聚模式。以上結論的分歧可能是由于提取蛋白的條件不同或是蛋白所處環(huán)境（pH值、離子強度等）不同，導致蛋白質有不同聚集-解聚行為，但具體原因仍需進一步實驗確定。

2.1.2 伴花生球蛋白

伴花生球蛋白隸屬于豌豆球蛋白家族b[4]。高度同源性的蛋白中研究最廣泛的當屬大豆β-伴球蛋白，已有研究發(fā)現(xiàn)該7S組分為異源三聚體，由3 個核心區(qū)高度同源的亞基α（67 kD）、α’（71 kD）、β（50 kD）組成[19]。不同于大豆β-伴球蛋白，研究發(fā)現(xiàn)伴花生球蛋白在蔗糖密度梯度實驗中顯示為一個7S球蛋白[20]，是由60 kD亞基組成的同源三聚體，分子質量為180 kD[21]。但關于伴花生球蛋白的分子質量，目前說法并不統(tǒng)一，但基本處于60～66 kD范圍間[16,20-21]。

2.1.3 2S清蛋白

2S清蛋白是雙子葉植物，尤其是豆科植物的種子中主要的貯藏性蛋白，該家族蛋白具有特征性的四螺旋和4 個二硫鍵結構，該結構具有較高的緊湊性和耐蛋白水解性[22]。

楊曉泉等[16]通過激光質譜法測定了2S清蛋白的各組分的分子質量，發(fā)現(xiàn)其含有6 個主要多肽，并且多肽間是以解離形式存在，并通過單、雙向電泳技術分離花生蛋白，結果表明2S清蛋白有6 個組分共用兩個等電點（PI 5.0和PI 5.5）。林鹿等[23]研究表明2S蛋白主要由6 個亞基組成，分子質量分別為12.5、13、14、15.5、16.5、17 kD，該結果與楊曉泉等[16]研究結果相近。

2.2 花生蛋白亞基缺失

目前花生種質間蛋白亞基缺失多有報道。Shokraii等[24]利用十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gelelectrophoresis，SDSPAGE）和等電點聚焦分析了22 個花生品種，發(fā)現(xiàn)36 kD亞基的缺失品種，并證實36 kD條帶與花生脫紅衣容易度有關；杜寅[13]用SDS-PAGE分析了170 份花生品種的蛋白質含量，發(fā)現(xiàn)不同品種的蛋白質組分和亞基含量存在較大差異，其中雙紀2號、粵油14號、閩花9號等25 個品種35.5 kD亞基缺失；Liang等[25]采用單/雙向電泳技術，分析美國主要的蘭娜型、西班牙型的12 個花生品種，發(fā)現(xiàn)蘭娜型花生中的A-13缺失35 kD亞基，西班牙型中3 個品種缺失27 kD，并發(fā)現(xiàn)所有西班牙型均存在（22.5 kD，pI 3.9）和（23.5 kD，pI 5.7），而所有蘭娜型花生中均不存在；而（23 kD，pI 6.6）和（22 kD，pI 6.8）則存在于所有蘭娜型中，在所有西班牙型中缺失。

不同的蛋白亞基由于其氨基酸組成不同、排列順序不同、肽鏈卷曲方式不同等造成功能性質有較大的差異。特定亞基的缺失品種將有利于某些功能性質的發(fā)揮，但目前花生蛋白亞基缺失品種多是自然突變獲得。相比于大豆，除了自然突變之外，通過輻射和誘變得到不同亞基缺失材料，從而獲得優(yōu)良的加工適宜性品種（乳化型、凝膠型），在該方面日本較為領先，我國經引進也陸續(xù)培育得到了（α+β）缺失型，α、α’缺失品種[26]。因此，篩選、選育優(yōu)良花生特定亞基缺失品種，研究其營養(yǎng)和功能特性，將有助于優(yōu)質花生蛋白資源的開發(fā)，提升花生蛋白產業(yè)整體效益。

3 花生蛋白三維結構解析研究進展

3.1 三維結構解析概況

在美國國立生物技術信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）數據庫中，解析的花生蛋白的序列信息共有24 532 條，而關于蛋白質生物結構的信息則共有73 條，而其中解析結構中大部分為花生凝集素信息，其次為花生過敏原信息[27]。蛋白質數據庫（protein data bank，PDB）中以花生為關鍵詞，共檢索結果36 條，其中凝集素（凝集素及其復合物）23 條，過敏原10 條，酶（二苯乙烯合成酶）3 條（圖3）[28]。表1總結了花生蛋白和大豆蛋白亞基解析情況。綜合可知花生蛋白結構的信息仍存在大部分空白，該領域應引起學者們的重視。

圖3 花生蛋白三維結構解析研究現(xiàn)狀Fig.3 Parsed molecular structures of peanut protein

表1 花生蛋白和大豆蛋白三維結構解析情況對比Table 1 Comparison of parsed structures between peanut protein and soybean protein

3.2 花生蛋白三維結構

Jin等[40]于2007年采用體外重組的方法得到Ara h3的一個亞基，用懸滴法獲得了結晶，并初步解析了其電子密度圖（圖4A），其團隊于2009年得到該亞基的X射線衍射圖譜[29]（圖4B），在1.73 ?分辨率下研究了Ara h3的晶體結構，確定了IgE線性結合表位，并通過線性表位的映射發(fā)現(xiàn)，與溶劑接觸較多的線性表位即是前人文獻中所綜述的易于與病人血清反應的物質。

圖4 花生蛋白Ara h3晶體結構[30,41]Fig.4 Crystal structure of peanut allergen Ara h3[30,41]

Cabanos等[30]對重組花生過敏原Ara h1進行X射線衍射，發(fā)現(xiàn)Ara h1的核心區(qū)結構同7S球蛋白十分相似，大多數的線性表位存在于N端和C端模塊的環(huán)區(qū)和螺旋區(qū)域，其他的一些位于C端核心β-圓筒的β折疊上，這些表位能夠影響三聚體的形成，也正是這些表位使得Ara h1可在腸道中完全或部分消化成碎片（圖5）。

圖5 花生蛋白Ara h1的晶體結構[31]Fig.5 Crystal structure of peanut allergen Ara h1[31]

目前花生中2S清蛋白高級結構得到解析的花生過敏原為Ara h2。Mueller等[32]對花生中致敏性最強過敏原Ara h2進行晶體結構解析，研究結果表明，Ara h2的5 個螺旋被4 個二硫鍵連結在一起，這種結構與淀粉酶和胰蛋白酶抑制劑很相似（圖6）；同時Lehmann等[33]研究證明Ara h2具有胰蛋白酶抑制活性，并且經過烘烤處理后其抑制活性被顯著提高。夏立新等[41]比較Ara h 2和Ara h 6的生物信息，發(fā)現(xiàn)兩者從一級結構到三級結構均極為相似，奠定了兩者交叉反應的分子基礎。

圖6 花生過敏原Ara h2的晶體結構[33]Fig.6 Crystal structure of peanut allergen Ara h2[33]

4 蛋白亞基與功能性質關系

植物蛋白品質的好壞主要取決于它的營養(yǎng)特性和功能特性，其中功能特性主要包括溶解性、水合性、乳化性、起泡性、凝膠性和聚集性等。蛋白的功能性質與其蛋白質的分子質量分布、亞基的大小及其組成、亞基的解離/聚合性質、二硫鍵多寡及其熱穩(wěn)定性、親水/疏水作用等有著密切的關系[42]。

4.1 溶解性

溶解性是發(fā)揮諸如凝膠、起泡、乳化等功能性質的先決條件。王麗[43]通過測試66 個花生品種的蛋白亞基的加工性質，分析得知花生分離蛋白的溶解性與18 kD亞基成顯著相關性，但并未進行深入探討該亞基造成溶解性差異的原因。目前有報道通過化學或酶改性，提高蛋白亞基水合性[44-46]。Gruener等[44]發(fā)現(xiàn)對蛋白質琥珀?；苊黠@提高蛋白質溶解性和分子柔性，其原因在于琥珀?；捎行д归_蛋白亞基結構，促進分子的伸展和親水基團的暴露。酶解方式可以導致蛋白亞基降解，從而提高溶解性[45]，也可能通過專一性的水解，使親水性基團暴露提高水解析。Larre等[46]研究發(fā)現(xiàn)加熱后TGase酶更容易與蛋白亞基結合反應，提高水合性。

4.2 凝膠性

蛋白的凝膠性是重要功能特性，由于植物蛋白組成的高度不均一性以及復雜的空間構象，且應用中受諸如離子強度、溫度、pH值、壓力等多方面因素影響[47]，因此研究其凝膠機理具有很大難度。

王麗[43]測試了66 個花生品種的蛋白亞基和花生分離蛋白的加工性質，數據相關性分析得知花生分離蛋白凝膠性與23.5 kD亞基成顯著相關性。其他花生蛋白亞基的凝膠性還未見報道，而大豆蛋白方面，Utsumi等[48]研究了大豆蛋白凝膠形成過程，發(fā)現(xiàn)大豆11S球蛋白中酸性亞基對凝膠形成有重要作用，且A3比A4更重要，7S中3 個亞基均參與了凝膠形成；Poysa等[49]研究認為A3亞基對豆腐凝膠硬度起著重要作用，而A4亞基對豆腐品質起負作用，A1和A2亞基可以使豆腐質地顯著好于缺少該亞基的豆腐，缺少α’亞基比含有該亞基時的凝膠硬度增加了；Salleh等[50]研究了7S蛋白缺失α及α’亞基對大豆蛋白凝膠性的影響，結果表明影響關系為：缺失α’亞基＞7S全亞基＞缺失α亞基。

4.3 熱特性

熱處理是食品行業(yè)中最常見的加工形式之一，因此研究花生蛋白在受熱條件下的穩(wěn)定性十分有必要。劉巖等[51]從單位時間內物料內熱能隨溫度變化的角度分析，得知花生球蛋白的熱穩(wěn)定性要好于伴花生球蛋白，且其變性協(xié)同性也好于伴花生球蛋白。楊曉泉等[16]則從100 ℃下持續(xù)受熱的穩(wěn)定性角度出發(fā)，得知花生球蛋白的酸性亞基（40.5、37.5 kD）耐熱性較差，而其堿性亞基（19.5 kD）則完全不耐熱。而關于大豆蛋白亞基與熱特性間的構效關系則研究比較深入。Maruyama等[39]研究發(fā)現(xiàn)大豆β-伴球蛋白的3 個亞基的熱穩(wěn)定性順序為：β＞α’＞α，并且解析其三維結構發(fā)現(xiàn)該性質主要由核心區(qū)控制，從結構角度解釋了α’和β亞基熱穩(wěn)定性差異的原因：1）α’亞基的空腔體積較大；2）α’亞基的內部單體界面的帶電殘基聚集較少，并且缺乏同β亞基一樣的鹽橋；3）α亞基的溶劑可及表面的疏水性更強；4）α’亞基含有較少的脯氨酸殘基；5）α’亞基由于5 個額外的殘基的插入，在螺旋3和J’鏈之間的一個環(huán)區(qū)更加靈活。

總體而言，花生蛋白亞基的功能性質研究總體處于初級階段，單個亞基與功能性質的研究多停留于現(xiàn)象發(fā)現(xiàn)層面，且一般是通過突變品種觀測得到；而亞基與亞基間的交互作用對功能性質的影響則尚未見文獻報道，因此研究特定亞基的功能性質和亞基間的交互反應無疑應成為下一階段研究的重點。

5 結 語

以上文獻綜述可知，花生蛋白研究主要存在以下三方面問題：花生亞基間的解聚和聚合模式還未明確，及聚合解聚對花生蛋白性質的影響還鮮有涉及；亞基的鑒定和結構解析方面還存在諸多空白，導致構效關系分析不明確；蛋白中特定亞基的功能性質，以及該亞基與其他亞基的交互作用對蛋白功能性質的影響還未見涉及。

針對以上存在的問題，今后花生蛋白的研究重點應主要集中于以下三個方面：1）明確花生蛋白亞基的解聚和聚合模式，及其對花生蛋白功能性質的影響。研究不同溶液體系、不同外界刺激條件下花生蛋白亞基的解聚和聚合模式，并在特定聚集模式下蛋白的功能性質。2）加深花生蛋白亞基三維結構解析，從結構角度解析花生蛋白構-效關系。單純對某個蛋白功能性質的研究已經逐漸無法滿足現(xiàn)在的研究需求，研究工作者應從結構解析角度入手，深入分析構效關系，為分子修飾、分子設計和功能改性等研究提供理論和可行性基礎。3）亞基水平功能性質研究，解釋亞基功能性質差異以及亞基間的交互作用。由研究綜述可知，花生蛋白的功能性質研究仍停留于比較粗的組分方面，關于其超速離心組分，或單個亞基以及亞基間的功能性質對比研究仍有欠缺。亞基間交互作用方面（協(xié)同增效抑或相互消減），應作為廣大研究工作者關注重點。

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Composition, Structures and Functional Properties of Peanut Seed Protein at Subunit Level: A Review

XU Fei, LIU Li, SHI Aimin, LIU Hongzhi, HU Hui, WANG Qiang*
(Key Laboratory of Agro-Products Processing, Ministry of Agriculture, Institute of Food Science and Technology, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100193, China)

Peanut germplasm resources are very rich and diverse in China, and subunit composition, molecular structures and functional properties are different in different peanut varieties. In this paper, the subunit composition of major peanut protein components such as arahin, conarachin and albumin is overviewed. Herein, we provide a systematic review of the recent progress made in the studies of the molecular structures of arahin and conarachin and the functional properties of each subunit at the subunit level. In addition, some problems encountered in the research on peanut proteins are summarized and the future research direction is proposed， aiming to provide a reference for researchers in this field.

peanut protein; subunit; structure; functional property

10.7506/spkx1002-6630-201607047

TS225.1

A

1002-6630（2016）07-0264-06

徐飛, 劉麗, 石愛民, 等. 亞基水平上花生蛋白組成、結構和功能性質研究進展[J]. 食品科學, 2016, 37(7): 264-269. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201607047. http://www.spkx.net.cn

XU Fei, LIU Li, SHI Aimin, et al. Composition, structures and functional properties of peanut seed protein at subunit level: a review[J]. Food Science, 2016, 37(7): 264-269. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201607047. http://www.spkx.net.cn

2015-07-17

中國農業(yè)科學院科技創(chuàng)新工程項目（CAAS-ASTIP-201X-IAPPST）

徐飛（1989—），女，碩士研究生，研究方向為食品科學。E-mail：love_faith@163.com

*通信作者：王強（1965—），男，研究員，博士，研究方向為糧油加工與功能食品。E-mail：wangqiang06@caas.cn