基于多壁碳納米管免疫傳感器法快速測定食品中的萊克多巴胺

張媛媛，王瑞鑫，李秋薇，李書國

（河北科技大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，河北 石家莊 050018）

基于多壁碳納米管免疫傳感器法快速測定食品中的萊克多巴胺

張媛媛，王瑞鑫，李秋薇，李書國*

（河北科技大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，河北 石家莊 050018）

以改性殼聚糖包埋固定羧基化多壁碳納米管和萊克多巴胺抗體，構(gòu)建免疫傳感器用于萊克多巴胺的檢測。以K3［Fe（CN）6］為探針，利用循環(huán)伏安法表征傳感器構(gòu)建過程和差分脈沖伏安法探究萊克多巴胺抗體/抗原間免疫反應(yīng)對(duì)電流的影響。結(jié)果表明，在優(yōu)化條件下，免疫響應(yīng)電流與溶液中萊克多巴胺質(zhì)量濃度的立方根在0.05～4.05 ng/mL范圍內(nèi)呈線性關(guān)系，其線性方程為最低檢測限為0.08 ng/mL（RSN=3）；所構(gòu)建的免疫傳感器的特異性、穩(wěn)定性和重復(fù)性良好。該法對(duì)豬肉、羊肉等量品進(jìn)行檢測，其檢測結(jié)果與國標(biāo)方法高效液相色譜法一致，檢測快捷方便，可用于食品中萊克多巴胺的快速檢測。

萊克多巴胺；免疫傳感器；多壁碳納米管；快速檢測；食品安全

張媛媛， 王瑞鑫， 李秋薇， 等. 基于多壁碳納米管免疫傳感器法快速測定食品中的萊克多巴胺［J］. 食品科學(xué)， 2016， 37（8）: 170-175. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201608030. http://www.spkx.net.cn

ZHANG Yuanyuan， WANG Ruixin， LI Qiuwei， et al. An immunosensor for rapid determination of ractopamine in foods based on multi-walled carbon nanotubes［J］. Food Science， 2016， 37（8）: 170-175. （in Chinese with English abstract）

萊克多巴胺（ractopamine，RAC）屬于人工合成的一種β-腎上腺受體激動(dòng)劑［1-3］。RAC可有效提高動(dòng)物的瘦肉相對(duì)百分比和蛋白質(zhì)含量，常作為克倫特羅的違規(guī)替代品于畜牧養(yǎng)殖業(yè)（主要用于養(yǎng)牛和養(yǎng)豬），屬于較為常見的“瘦肉精”之一。殘留在動(dòng)物內(nèi)臟和肌肉組織中的RAC，可經(jīng)過食物鏈進(jìn)入人類體內(nèi)，進(jìn)而危害人類的健康。食用后癥狀表現(xiàn)為心動(dòng)失常、心律不穩(wěn)定、惡心和暈眩等［4-6］。RAC的殘留問題引起研究者和消費(fèi)者的熱切關(guān)注，盡管不同國家和地區(qū)對(duì)于其在動(dòng)物飼料中使用問題，觀點(diǎn)不盡相同，美國和加拿大等地區(qū)允許使用，但嚴(yán)格規(guī)定殘留限量，如美國規(guī)定豬肉中RAC的最大殘留為50 μg/kg，而歐盟和我國明確禁止在畜禽養(yǎng)殖業(yè)中使用RAC［7-10］。因此，建立一種檢測時(shí)間短、精確度優(yōu)良的RAC分析方法對(duì)于確保食品安全，維護(hù)消費(fèi)者生命安全和身體健康有著重要意義。

目前，檢測RAC的方法主要有色譜分析法［11-14］、免疫分析法［15-17］、快速檢測卡法［18-22］、電化學(xué)分析法［23-25］等，這些方法各有各自的檢測優(yōu)勢和劣勢。隨著目標(biāo)性抗體不斷地研發(fā)，免疫分析法得到迅速發(fā)展，其中尤以電化學(xué)免疫分析法發(fā)展迅速，因其特異性好、檢測靈敏度高以及檢測速度快、量品處理簡單等優(yōu)勢，成為食品安全快速檢測的主要發(fā)展方向之一。

本實(shí)驗(yàn)以RAC為研究對(duì)象，以羧基化多壁碳納米管/殼聚糖（carboxylic multiwalled carbon nanotubes/ chitosan，MWNTs-COOH/CS）構(gòu)建復(fù)合膜，用于萊克多巴胺抗體（ractopamine antibody，RAC-anti）的固定。該免疫傳感器利用碳納米管對(duì)于生物分子中電子傳遞的良好促進(jìn)性，以及CS成膜以后的生物兼容性及其表面豐富氨基對(duì)于生物分子的良好固定，使得該免疫傳感器在增加RAC-anti固載量的同時(shí)，能較好地固定在玻碳電極（glassy carbon electrode，GCE）表面。根據(jù)質(zhì)量濃度不同的RAC標(biāo)準(zhǔn)溶液與RAC-anti結(jié)合后，MWNTs-COOH/ CS/RAC-anti/GCE界面的電流變化聯(lián)系，探究其數(shù)學(xué)模型，建立一種快速測定食品中瘦肉精的方法。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

豬肉、牛肉、羊肉、雞肉 石家莊市購。

MWNTs-COOH（外徑：40～60 μm，長度：2～5 μm） 北京德科島金科技有限公司；CS（脫乙酰度≥90.0%） 北京索萊寶科技有限公司；RAC-anti深圳芬德生物技術(shù)有限公司；RAC標(biāo)準(zhǔn)品 德國Dr Ehrenstorfer公司；牛血清白蛋白 上海翊圣科技有限公司；N，N-二甲基甲酰胺（分析純） 天津市達(dá)森化工產(chǎn)品銷售有限公司；冰乙酸（分析純） 天津市富宇精細(xì)化工有限公司；鐵氰化鉀、甲醇（均為分析純） 天津市永大化學(xué)試劑有限公司；正己烷（分析純） 天津市津東天正精細(xì)化學(xué)試劑廠；高純度氮?dú)?石家莊市西三教氣體公司。

1.2儀器與設(shè)備

LK98BⅡ型微機(jī)電化學(xué)分析系統(tǒng) 天津蘭力科化學(xué)電子高技術(shù)有限公司；三電極系統(tǒng)（3 mm玻碳圓盤電極為工作電極、鉑絲電極為對(duì)電極、Ag/AgCl電極為參比電極）、電解杯 上海CHI儀器公司；FA2204型電子分析天平 上海菁海儀器有限公司；LC-10A型高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）儀日本島津公司； KQ2200型超聲波清洗儀 昆山市超聲儀器有限公司；TGL-10B型高速臺(tái)式離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠；S-4800-Ⅰ型場發(fā)射掃描電鏡（scanning electron microxcope，SEM） 日本Hitachi公司。

1.3方法

1.3.1MWNTs-COOH/CS復(fù)合膜的制備

準(zhǔn)確稱取0.01 g MWNTs-COOH，加入到10 mL N，N-二甲基甲酰胺溶液中，超聲5 min，得到分散均勻的MWNTs-COOH懸濁液。準(zhǔn)確稱取1.0 g CS，溶于100 mL 1%冰乙酸溶液，制得1% CS透明溶液，置于4 ℃條件下儲(chǔ)存。取5 mL MWNTs-COOH的N，N-二甲基甲酰胺溶液加入到1% CS的冰乙酸溶液中，超聲30 min，使MWNTs-COOH均勻地分散到CS溶液中，制得MWNTs-COOH/CS懸濁液，置于4 ℃條件下保存、備用。

1.3.2電化學(xué)免疫傳感器的制備

將GCE（直徑為3 mm）用粒徑大小為0.05 μm的氧化鋁粉末輕輕打磨拋光，直至電極表面成光滑鏡面，再依次于硝酸（體積分?jǐn)?shù)為50%）、無水乙醇和去離子水中各超聲2 min。超聲完畢以后，將玻碳電極表面用氮?dú)獯蹈珊蟠?。將電極置于0.1 mol/L的稀硫酸溶液中，設(shè)置循環(huán)伏安法的掃描速率為50 mV/s，電壓范圍為-1.0～1.0 V，對(duì)電極進(jìn)行掃描直至循環(huán)伏安圖穩(wěn)定后取出，用去離子水沖洗電極表面，再次用氮?dú)飧稍锖髠溆谩?/p>

圖1　免疫傳感器的制備及免疫過程Fig.1 Procedure for preparation of immunosensor and immune reaction

免疫傳感器的制備流程見圖1。取5 μL的MWNTs-COOH/CS混合液滴涂于GCE表面的中心位置，在室溫條件下（25 ℃左右）自然晾干。然后取6 μL的RAC-anti滴涂于MWNTs-COOH/CS修飾的GCE表面，于4 ℃條件下孵育120 min。最后在電極表面滴涂5 μL 1%的牛血清白蛋白/磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffered solution，PBS，pH 7.4）溶液，于4 ℃條件下約30 min，用于封閉傳感器界面的活性基團(tuán)。最終，制得檢測所用的免疫傳感器，于4 ℃保存待用。

1.3.3電化學(xué)方法

在MWNTs-COOH/CS/RAC-anti修飾的免疫傳感器表面依次滴涂不同質(zhì)量濃度梯度（0～4.05 ng/mL）的RAC標(biāo)準(zhǔn)溶液中，在37 ℃條件下孵育25 min。采用三電極體系（工作電極為MWNTs-COOH/CS/RAC-anti/GCE，參比電極為Ag/AgCl電極，輔助電極為鉑絲電極），于1.0 mmol/L K3［Fe（CN）6］+0.1 mol/L KCl+0.2 mol/L PBS（pH 7.0）進(jìn)行電化學(xué)修飾過程的表征和RAC的檢測分析。運(yùn)用循環(huán)伏安法（電壓-0.2～0.6 V，掃描速率50 mV/s）對(duì)于電極的構(gòu)建步驟進(jìn)行電化學(xué)表征，運(yùn)用差分脈沖伏安法（電位-0.2～0.6 V）分析不同質(zhì)量濃度梯度RAC的峰電流值Ip與相對(duì)應(yīng)的RAC質(zhì)量濃度間關(guān)系，記錄峰電流值Ip，并依據(jù)其相關(guān)的數(shù)學(xué)模型對(duì)RAC質(zhì)量濃度做標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.4市售肉類量品中RAC的測定

1.3.4.1量品前處理

準(zhǔn)確稱取4 g豬肉、牛肉、羊肉、雞肉量品用絞肉機(jī)絞碎，置于25 mL的燒杯中，加入16 mL乙腈，振蕩5 min以后，超聲處理20 min，接著移入50 mL離心管中，室溫離心10 min（6 000 r/min），取上清液10 mL，在60 ℃條件下用氮?dú)獯蹈?，然后加? mL 的100 mmol/L的鹽酸溶液（pH 2.0），再次室溫6 000 r/min離心10 min，取上清液進(jìn)行凈化。對(duì)固相萃取柱分別用3 mL甲醇、3 mL去離子水、3 mL 0.2%的冰乙酸活化后，將上述提取液加入萃取柱，依次用3 mL 0.2%的冰乙酸溶液、3 mL去離子水、3 mL甲醇洗滌，再用3 mL 5%氨化甲醇溶液洗脫，將洗脫液于50 ℃條件下用氮?dú)獯蹈?，用甲醇定容? mL，再經(jīng)0.45 μm濾膜過濾后進(jìn)行檢測。

1.3.4.2電化學(xué)檢測

在制備好的納米免疫傳感器表面滴加2 μL處理好的量品提取液，在37 ℃條件下孵育25 min，然后利用差分脈沖伏安法測定免疫反應(yīng)響應(yīng)電流，每個(gè)量品平行測定3 次，取3 次測定的電流值平均值作為該量品的免疫響應(yīng)電流值，將該免疫響應(yīng)電流值代入1.3.3節(jié)的免疫響應(yīng)電流與RAC質(zhì)量濃度的線性回歸方程，計(jì)算豬肉等量品中RAC的含量。

1.3.4.3HPLC檢測

色譜條件：色譜柱為C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相為戊烷磺酸鈉溶液［取800 mL水，加20 mL冰醋酸和0.87 g 戊烷磺酸鈉（C5H11O3SNa·H2O）混勻］-乙腈（78∶22，V/V）；激發(fā)波長為226 nm，發(fā)射波長為306 nm；流速1 mL/min；進(jìn)量量50 μL［26］。

準(zhǔn)確稱取25 mg RAC標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇溶解并定容于100 mL容量瓶中，作為儲(chǔ)備液保存于4 ℃條件下。使用前依據(jù)需求配成相應(yīng)質(zhì)量濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)工作液，取50 μL量品溶液進(jìn)量，記錄其HPLC圖譜，根據(jù)所得峰面積與對(duì)應(yīng)的工作液質(zhì)量濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。分別取上述處理好的量品提取液50 μL，進(jìn)行HPLC檢測，依據(jù)上述標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算量品中RAC的質(zhì)量濃度，并與電化學(xué)檢測方法進(jìn)行對(duì)比。

2　結(jié)果與分析

2.1RAC納米免疫傳感器的電化學(xué)表征

圖2　不同修飾電極的循環(huán)伏安圖Fig.2 Cyclic voltammograms of different modified electrodes

在1.0 mmol/L K3［Fe（CN）6］+0.1 mol/L KCl+0.2 mol/L PBS（pH 7.0）的測試底液中，以循環(huán)伏安法對(duì)GCE（a）、CS/GCE（b）和MWNTs-COOH/CS/GCE（c）進(jìn)行表征，表征結(jié)果見圖2。Fe（CN）63-/4-在裸玻碳電極上有一對(duì)較好的氧化還原峰。當(dāng)在電極表面修飾CS后，修飾電極的氧化還原峰電流減少，這是由于CS的導(dǎo)電性不太好，對(duì)電子在電極表面上傳遞起一定的阻礙作用。相比較于CS/GCE，可以明顯觀察到MWNTs-COOH的引入提高了玻碳電極的響應(yīng)電流信號(hào)，使MWNTs-COOH/CS/ GCE的氧化還原峰電流均增加，這是由于MWNTs-COOH通過CS固定在電極的表面，形成電子與電極之間電子傳遞的活性中心，MWNTs-COOH納米微?？梢暈橛诩{米尺寸的微電極，可作為電子與裸電極之間的傳輸通道，能夠有效提高免疫傳感器響應(yīng)信號(hào)的靈敏度；用CS分散MWNTs-COOH，在增大RAC-anti在電化學(xué)免疫傳感器表面固載量的同時(shí)，能夠有效保證免疫傳感器的穩(wěn)定性。上述3 種情況下的電極根據(jù)Randles-Sevcik方程［17］，可以求出電極的電活性面積：

式中：Ip為陽極峰電流/μA；A為有效電極面積/cm2；C為K3［Fe（CN）6］濃度（此為1 mmol/L）；D為擴(kuò)散系數(shù)（6.7×10-6cm2/s）；γ為電位變化速率（0.05 V/s）；n為參與氧化還原反應(yīng)的電子數(shù)（此處n=1）。根據(jù)計(jì)算得，CS/GCE和MWNTs-COOH/CS/GCE的有效電極面積分別為0.058、0.077 cm2?？芍琈WNTs-COOH的加入明顯地提高了玻碳電極的有效活性面積（增加了32.76%），從而提高了免疫傳感器的靈敏度。

當(dāng)在MWNTs-COOH/CS/GCE表面滴加RAC-anti以后，氧化還原峰的電流減少并發(fā)生一定的偏移（圖3），因?yàn)閹д姾傻目贵w蛋白經(jīng)過靜電相互作用牢固地吸附在MWNTs-COOH/CS表面上，由于抗體的絕緣性阻礙了電極表面的電子傳遞，這就說明RAC-anti已經(jīng)成功固定在電極表面上。在MWNTs-COOH/CS/RAC-anti/GCE表面滴加RAC標(biāo)準(zhǔn)液以后，其峰位置進(jìn)一步降低，表明RAC-anti和RAC已經(jīng)成功結(jié)合進(jìn)行特異性免疫反應(yīng)。

圖3　修飾電極免疫前后的循環(huán)伏安圖Fig.3 Cyclic voltammograms of immunosensor before and after immune reaction

圖4　電化學(xué)免疫傳感器在不同掃描速率條件下的循環(huán)伏安圖Fig.4 Cyclic voltammograms of the immunosensor at different scan rates

將免疫傳感器（MWNTs-COOH/CS/RAC-anti/RAC/ GCE）在不同掃描速率（20～220 mV/s）條件下以循環(huán)伏安法進(jìn)行掃描，結(jié)果如圖4所示。由圖4可以得出，隨著掃描速率的增加，氧化峰和還原峰的電流均增加，掃描得到的氧化峰和還原峰的電流值都分別與掃描速率的平方根呈線性關(guān)系：Ip1=1.232 7x1/2+1.227 4，線性相關(guān)系數(shù)R2= 0.997 8；Ip2=1.252 4x1/2-2.412 4，線性相關(guān)系數(shù)R2=0.998 0。說明發(fā)生于該免疫傳感器表面的反應(yīng)受擴(kuò)散過程控制。

2.2RAC納米免疫傳感器SEM表征

圖5 不同修飾電極的SEM圖Fig.5 SEM images of different modified electrodes

圖5A為裸玻碳電極上修飾一層CS薄膜的SEM圖。圖5B為裸玻碳電極上修飾一層MWNTs-COOH/CS薄膜的SEM圖，從圖5B可以明顯看出，多壁碳納米管呈現(xiàn)特有的非常規(guī)整的多孔網(wǎng)狀納米纖維結(jié)構(gòu)，且多壁碳納米管的前處理使得碳納米管末端斷裂并羧基化，有利于抗體的固定。這種結(jié)構(gòu)會(huì)增加傳感器的表面積，可以顯著增加抗體固載量，并可有效防止抗體從傳感器上脫附泄漏，提高免疫響應(yīng)電流值，從而提高傳感器的靈敏度。圖5C為抗體修飾到MWNTs-COOH/CS復(fù)合膜上時(shí)的SEM圖，可以看出抗體微粒嵌到了MWNTs-COOH/CS膜的空隙當(dāng)中。

2.3免疫傳感器制備及檢測參數(shù)的優(yōu)化

2.3.1修飾液的用量

MWNTs-COOH/CS混合液的用量可能會(huì)對(duì)電子傳遞產(chǎn)生影響，本實(shí)驗(yàn)分別用1、3、5、7、9 μL的修飾液滴涂在活化穩(wěn)定以后的玻碳電極表面中心位置，滴涂過程中應(yīng)確保電極表面水平。以循環(huán)伏安法分析比較各個(gè)修飾量下峰電流的大小。經(jīng)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，電流逐漸增大，直至修飾量為5 μL時(shí)，峰電流達(dá)到最大，然后隨著修飾量的增加電流逐漸減少。可能由于修飾量增加以后，修飾膜厚度較大影響了電子的傳遞。同時(shí)考慮到所用的電極直徑為3 mm，電極表面積有限，修飾材料用量以3～6 μL為宜，所以選擇修飾膜的用量為5 μL。

2.3.2孵育時(shí)間與溫度對(duì)免疫傳感器的影響

圖6　孵育時(shí)間對(duì)免疫傳感器DPV峰電流的影響Fig.6 Effect of incubation time on DPV response of the immunosensor

RAC-anti與抗原（RAC標(biāo)準(zhǔn)液）的孵育時(shí)間和溫度對(duì)免疫反應(yīng)有重要的影響。為了選擇較好的孵育時(shí)間，在MWNTs-COOH/CS/RAC-anti/GCE表面滴加2 μL的RAC標(biāo)準(zhǔn)溶液，控制反應(yīng)時(shí)間，利用差分脈沖伏安法測定其響應(yīng)電流的變化，如圖6所示。在5～20 min范圍內(nèi)峰電流隨著孵育時(shí)間的延長而增大，表明了抗原/抗體之間需要一定時(shí)間，來通過的特異性免疫反應(yīng)形成穩(wěn)定復(fù)合產(chǎn)物。孵育時(shí)間超過25 min后，峰電流的變化很小，表明固定的抗體與游離的抗原的結(jié)合達(dá)到相對(duì)飽和。在一定范圍內(nèi)，升高溫度可加速免疫反應(yīng)的進(jìn)程，有利于生成免疫復(fù)合物，但溫度過高會(huì)使具抗原與抗體的活性下降，乃至失去活性，不利于RAC的檢測分析。在優(yōu)化孵育時(shí)間的條件下，探究20～45 ℃范圍內(nèi)對(duì)免疫反應(yīng)的影響，如圖7所示。在20～35 ℃范圍內(nèi)，所構(gòu)建的免疫傳感器響應(yīng)電流隨溫度升高而增大，并于約35 ℃時(shí)達(dá)到最大值，當(dāng)溫度高于35 ℃后，響應(yīng)電流的值開始減少，可能原因是RAC-anti活性下降，導(dǎo)致免疫響應(yīng)電流下降，故選取35 ℃為優(yōu)化孵育溫度，孵育時(shí)間為25 min。

圖7　孵育溫度對(duì)免疫傳感器DPV峰電流的影響Fig.7 Effect of incubation temperature on DPV response of the immunosensor

2.3.3電解質(zhì)溶液pH值對(duì)免疫反應(yīng)的影響

檢測所用底液的pH值對(duì)響應(yīng)信號(hào)的峰電流有顯著的影響。相同條件下，不同的底液pH值將會(huì)導(dǎo)致掃描得出的峰電流不同。分析得出，當(dāng)溶液的pH 7.0時(shí)，所得的檢測信號(hào)峰電流Ip最大，表明在pH 7.0時(shí)，檢測體系能夠達(dá)到較好的靈敏度，這可能是因?yàn)楫?dāng)測試底液過酸或者過堿時(shí)，抗體中部分基團(tuán)的質(zhì)子化或解離導(dǎo)致抗體活性有所改變或下降，同時(shí)考慮到CS在過酸或過堿條件下時(shí)容易解離，所以實(shí)驗(yàn)選擇pH 7.0的磷酸鹽緩沖溶液作為檢測所用的電解質(zhì)溶液。

2.4不同質(zhì)量濃度RAC對(duì)免疫傳感器響應(yīng)電流的影響

配制系列質(zhì)量濃度的RAC標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照1.3.4節(jié)的方法測得傳感器在不同質(zhì)量濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液中的差分脈沖曲線，以峰電流為縱坐標(biāo)，抗原質(zhì)量濃度大小為橫坐標(biāo)，按此繪制RAC的標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖8所示。在RAC質(zhì)量濃度范圍為0～4.05 ng/mL時(shí)，免疫反應(yīng)電流Ip值隨RAC質(zhì)量濃度的增大而減小，且ΔIp值下降量與CRAC之間的關(guān)系滿足線性關(guān)系方程：線性相關(guān)系數(shù)R2=0.990 4，其最低檢測限為0.08 ng/mL（RSN=3）。

圖8　RAC的校正曲線Fig.8 Calibration curve of RAC

2.5免疫傳感器的特異性、穩(wěn)定性與重復(fù)性

在制備好的RAC免疫傳感器表面先后滴加同等質(zhì)量濃度、同等體積的RAC和沙丁胺醇，其差分脈沖峰電流變化僅為3.85%，表明該免疫傳感器的特異性較好。將制備好的免疫傳感器連續(xù)掃描15 次，電流響應(yīng)僅下降3.5%。然后將其置于-4 ℃避光保存，不同時(shí)間后用來檢測RAC溶液，3 個(gè)月以后免疫響應(yīng)電流變化率不超過5.0%，表明該傳感器的穩(wěn)定性較好。分別制備同一批次3 支免疫傳感器和不用的3 個(gè)批次（每個(gè)批次2 支）的免疫傳感器，進(jìn)行RAC檢測，同一批次的電流變化率不超過4.6%，不同批次的電流變化率不超過5.7%，表明該傳感器重復(fù)性較好。

2.6實(shí)際量品中RAC含量的檢測結(jié)果

按1.3.4節(jié)方法處理，得到提取液，按照前面優(yōu)化好的實(shí)驗(yàn)條件，以差分脈沖伏安法為檢測方法檢測4 種量品中RAC的含量，進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，并與HPLC法檢測結(jié)果進(jìn)行了對(duì)照，結(jié)果見表1。納米免疫傳感器法檢測豬肉、牛肉、羊肉、雞肉4 種鮮肉，只有豬肉檢測出RAC，其含量為1.3 ng/g，HPLC也只有豬肉檢測出RAC，含量為1.3 ng/g，二者的加標(biāo)回收率分別為96%～102%和95.2%～106%，檢測結(jié)果基本一致。

表1　樣品中RAC含量測定的結(jié)果Table 1 Analytical results for the determination of RAC in samples

3　結(jié) 論

利用MWNTs-COOH/CS復(fù)合膜修飾玻碳電極，制備了基于多壁碳納米管增效的安培型RAC免疫傳感器，提高了免疫傳感器檢測的靈敏度，其復(fù)合修飾材料添加量5 μL、免疫傳感器孵育溫度35 ℃、孵育時(shí)間25 min、電解質(zhì)溶液pH 7.0；該傳感器的抗干擾性、穩(wěn)定性和重復(fù)性較好，用于實(shí)際肉品RAC的檢測，其檢測結(jié)果與HPLC法基本一致，因此可用于畜禽肉、飼料中RAC的快速檢測。

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An Immunosensor for Rapid Determination of Ractopamine in Foods Based on Multi-Walled Carbon Nanotubes

ZHANG Yuanyuan， WANG Ruixin， LI Qiuwei， LI Shuguo*
（College of Biological Science and Engineering， Hebei University of Science and Technology， Shijiazhuang 050018， China）

A highly sensitive nanoimmunosensor for the determination of ractopamine （RAC） in food samples was constructed based on a glass carbon electrode modified with carboxylic multi-walled carbon nanotubes/chitosan （MWNTs-COOH/CS） composite film. Based on the specific immune reaction between antibody and antigen for RAC， the effect of immune response on immunosensor response current was investigated by cyclic voltammetry and differential pulse voltammetry using K3［Fe（CN）6］ as the probe. The results showed that immune response currents increased linearly with the cube root of RAC concentration in the range of 0.05-4.05 ng/mL （Ip= - 4.524 4+ 14.259， R2= 0.990 4） with limit of detection （LOD） of 0.08 ng/mL （RSN= 3）. Excellent specificity， stability and reproducibility of the prepared MWNTs-COOH/CS/RAC-anti immunosensor were observed under the selected conditions. The developed method was applied to the determination of RAC in pork， beef， mutton， and chicken samples. The results agreed well with those obtained by HPLC method. Being faster than HPLC method， this immunosensor is practicable for rapid determination of RAC in food samples.

ractopamine （RAC）； nanoimmunosensor； multi-walled carbon nanotubes （MWCNTs）； rapid determination；food safety

10.7506/spkx1002-6630-201608030

TS225.1

A

1002-6630（2016）08-0170-06

10.7506/spkx1002-6630-201608030. http://www.spkx.net.cn

2015-07-24

國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（20876165）；河北科技大學(xué)大學(xué)生科技創(chuàng)新計(jì)劃項(xiàng)目（2014262）

張媛媛（1989—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称房茖W(xué)與安全。E-mail：993581667@qq.com

李書國（1969—），男，教授，博士，研究方向?yàn)榧Z油食品安全技術(shù)。E-mail：shuguolee@126.com

引文格式：