徐日益，尚紅巖，黃向陽，梁 磊，蘇江濱，陳啟球

（1廣東省生物工程研究所（廣州甘蔗糖業(yè)研究所） 廣東省甘蔗改良與生物煉制重點實驗室，廣州　510316；2廣東省植物纖維綜合利用工程技術(shù)研究開發(fā)中心，廣州　510316；3廣州市植物纖維綜合利用重點實驗室，廣州　510316；4廣東省

生物質(zhì)高值化利用工程實驗室，廣州　510316；5廣東徐聞三和發(fā)展有限公司，湛江　524132）

基于高密度細胞的快速發(fā)酵酒精技術(shù)可行性研究

徐日益1，2，3，4，尚紅巖1，2，3，4，黃向陽1，2，3，4，梁 磊1，2，3，4，蘇江濱1，2，3，4，陳啟球5

（1廣東省生物工程研究所（廣州甘蔗糖業(yè)研究所） 廣東省甘蔗改良與生物煉制重點實驗室，廣州510316；2廣東省植物纖維綜合利用工程技術(shù)研究開發(fā)中心，廣州510316；3廣州市植物纖維綜合利用重點實驗室，廣州510316；4廣東省

生物質(zhì)高值化利用工程實驗室，廣州510316；5廣東徐聞三和發(fā)展有限公司，湛江524132）

將鮮釀酒酵母泥按不同的接種量接入糖蜜培養(yǎng)基進行發(fā)酵，研究表明隨著接種量的增大，酵母增殖系數(shù)減少、發(fā)酵周期縮短、發(fā)酵率略微降低。經(jīng)數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)在一定范圍內(nèi)，初始細胞數(shù)和最終細胞數(shù)的平均值與發(fā)酵周期的乘積 K為常量，表明基于高密度細胞的糖蜜快速發(fā)酵酒精技術(shù)是一項可行并且十分有前景的技術(shù)。

高密度細胞；快速發(fā)酵；酒精

0　前言

目前南方糖蜜酒精企業(yè)多采用固定化酵母雙濃度雙流加發(fā)酵工藝生產(chǎn)酒精［1-2］，常規(guī)做法是將固定化酵母放置于種子罐內(nèi)，流加15～20 °Bx的稀糖蜜作為培養(yǎng)基，罐內(nèi)酵母濃度依據(jù)糖蜜質(zhì)量的優(yōu)劣程度可達0.8億～1.5億個/mL不等。近年來國家環(huán)保政策趨于嚴格，大部分糖廠的附屬酒精車間被叫停生產(chǎn)，各個糖廠的糖蜜被統(tǒng)一集中處理，糖蜜酒精生產(chǎn)模式由車間榨季性生產(chǎn)轉(zhuǎn)變?yōu)橐?guī)模化常年連續(xù)生產(chǎn)。各種來源的糖蜜在運輸過程中必然受到不同程度的污染，隨后被集中儲存在數(shù)千乃至上萬立方米的大型儲罐長達半年甚至2年之久。存儲期間，蛋白質(zhì)和還原糖發(fā)生美拉德反應(yīng)產(chǎn)生氨基糖色素［3-4］；另外由于糖蜜黏度非常高，不易進行滅菌，因此耐高滲微生物可將部分可發(fā)酵性糖轉(zhuǎn)化為有機酸，而這2類產(chǎn)物皆對酒精酵母產(chǎn)生很強的抑制作用，導(dǎo)致種子罐酵母細胞濃度處于1億個/mL左右的低水平，從而使得整體發(fā)酵周期延長、生產(chǎn)效率低下。長期以來，學(xué)者對接種量和酒精發(fā)酵速度有普遍共識：接種量小，發(fā)酵周期長，出酒率相對高；接種量大，發(fā)酵周期短，出酒率相對低［5-7］，但是接種量和發(fā)酵周期具體有何種深層次的規(guī)律，至今鮮有報道。本文系統(tǒng)研究了酵母細胞濃度和發(fā)酵周期的關(guān)系，揭示了在一定范圍內(nèi)平均細胞數(shù)與發(fā)酵周期的乘積K為常量的規(guī)律，初步探索了高密度釀酒酵母細胞快速發(fā)酵酒精的可行性，為高濃糖蜜快速發(fā)酵酒精技術(shù)提供了理論基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1實驗材料

釀酒酵母，由廣東省生物工程研究所（廣州甘蔗糖業(yè)研究所）保藏；

糖蜜，83.27 °Bx，由廣東徐聞三和發(fā)展有限公司提供；

種子培養(yǎng)基：葡萄糖2%，酵母浸粉1.5%，蛋白胨2%，115℃、20 min蒸汽滅菌；

發(fā)酵培養(yǎng)基：30 °Bx糖蜜，pH 3.8，0.2%尿素，115℃、20 min蒸汽滅菌。

1.2主要實驗儀器

MoxiZ細胞計數(shù)儀，美國ORFLO公司；PAL-α迷你數(shù)顯折射儀，廣州愛宕科學(xué)儀器有限公司；BS201S電子分析天平，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；TDL-5A離心機，上海菲恰爾分析儀器有限公司。

1.3實驗方法

1.3.1鮮酵母培養(yǎng)收集方法

無菌條件下，挑一環(huán)新鮮斜面菌苔至小三角瓶種子培養(yǎng)基中，30℃、100 r/min培養(yǎng)16～20 h，再按10%的接種量接種至大三角瓶種子培養(yǎng)基，30℃、100 r/min培養(yǎng)16～20 h，離心分離收集菌泥備用。

1.3.2細胞計數(shù)方法

鮮酵母泥經(jīng)生理鹽水稀釋適當(dāng)倍數(shù)后用MoxiZ細胞計數(shù)儀測量。由于脫水條件所限，經(jīng)測1 g酵母泥含102億個細胞；發(fā)酵液細胞數(shù)則是取0.1～0.5 mL，發(fā)酵液稀釋適當(dāng)倍數(shù)后用MoxiZ細胞計數(shù)儀測量。

1.3.3糖蜜發(fā)酵期間失重測量方法

精確稱量0.05、0.1、0.5、1 g鮮酵母泥分別接種于100 mL糖蜜發(fā)酵培養(yǎng)基中，給三角瓶套上發(fā)酵栓，靜止發(fā)酵，每隔2～6 h搖勻并測失重，直至失重速率≤0.02 g/（100mL·h）時發(fā)酵結(jié)束，記錄發(fā)酵時間，繪制失重曲線。

1.3.4糖蜜發(fā)酵期間細胞數(shù)和錘度測量方法

精確稱量0.05、0.1、0.5、1 g鮮酵母泥分別接種于100 mL糖蜜發(fā)酵培養(yǎng)基中，給三角瓶套上發(fā)酵栓，靜止發(fā)酵，每隔2～6 h于無菌條件下取0.5 mL測細胞數(shù)和錘度，直至錘度不再下降時發(fā)酵結(jié)束，繪制細胞生長曲線和錘度曲線。

2　結(jié)果與討論

2.1接種量對糖蜜發(fā)酵失重、糖耗及細胞生長的影響

如圖1可知，隨著接種量的增大，發(fā)酵時間縮短，失重速率加快，0.05%、0.1%、0.5%、1%接種量分別在第 68、58、31、20 h時失重速率≤0.02 g/（100mL·h）。如表1可知，隨著接種量增大，最終發(fā)酵失重略微下降，0.05%、0.1%、0.5%、1%接種量發(fā)酵組的最終失重量依次為7.42、7.3、7.2、7.12 g，這是因為接種量大、細胞基數(shù)也就越多，用于維持細胞生命活動所消耗的能量就越多，所以用于轉(zhuǎn)化為酒精的糖相應(yīng)地減少，發(fā)酵率也略微下降。

如圖2可知，隨著接種量的增大，糖耗速率加快，0.05%、0.1%、0.5%、1%接種量發(fā)酵組分別在第68、58、31、20 h時錘度降到終點13 °Bx左右，這個時間點和失重停止的時間點是相互對應(yīng)的，因為根據(jù)葡萄糖酒精代謝反應(yīng)式，發(fā)酵失重量和酒精產(chǎn)量是成正比關(guān)系的。

如圖3可知，隨著接種量增大，細胞生長延滯期縮短，0.05%接種量發(fā)酵組延滯期長達 12 h，而1%接種量發(fā)酵組則直接進入對數(shù)生長期，0.05%、0.1%、0.5%、1%接種量發(fā)酵組進入平穩(wěn)期的時間點依次為第40、32、16、8 h，結(jié)合圖1發(fā)現(xiàn)這些時間點對應(yīng)的失重都為4.3 g左右，間接反應(yīng)了發(fā)酵液累積產(chǎn)生的酒精到達一定濃度后便抑制酵母繁殖，據(jù)測量失重4.3 g左右時對應(yīng)的酒精濃度約為6%（v/v）。

圖1　接種量對糖蜜發(fā)酵失重的影響

圖2　接種量對糖蜜發(fā)酵液錘度的影響

圖3　接種量對糖蜜發(fā)酵期間細胞生長的影響

2.2接種量對酵母細胞增量和增殖系數(shù)的影響

如表1所示，4組不同接種量發(fā)酵組的細胞增量處于0.706億～0.734億個/mL，近乎于相等，所以細胞增殖系數(shù)也就隨接種量的增大而減少。酵母繁殖和發(fā)酵是同時進行的，初始階段抑制酵母生長的因素只有滲透壓，隨著發(fā)酵代謝活動的進行，產(chǎn)生的酒精累積到一定濃度便可抑制酵母生長，此后階段酵母只能進行發(fā)酵而不能繁殖。由此可知接種量大的發(fā)酵液組累積產(chǎn)生的酒精較先達到酵母生長抑制濃度，與此同時接種量小的發(fā)酵液組還在繼續(xù)增殖，直至發(fā)酵酒分累積至細胞生長抑制濃度，綜合細胞繁殖時間和細胞基數(shù)兩者對細胞增量的相互作用效果，推測各組的細胞增量可接近同一值。

表1　不同接種量發(fā)酵液組的發(fā)酵參數(shù)

2.3平均酵母數(shù)和發(fā)酵周期的關(guān)系

如表1所示，經(jīng)統(tǒng)計初始、最終細胞數(shù)、發(fā)酵周期各組數(shù)據(jù)，進一步觀察發(fā)現(xiàn)4組接種量發(fā)酵組的平均酵母數(shù)和發(fā)酵周期的乘積K處于27～28，考慮計數(shù)誤差，K值可視作為常量，說明平均酵母數(shù)和發(fā)酵周期成反比關(guān)系，隨著接種量增大，平均酵母數(shù)也增大，發(fā)酵周期則相應(yīng)地縮短，K值常量與此現(xiàn)象是吻合的，此發(fā)現(xiàn)國內(nèi)文獻鮮有報道。

3　結(jié)論與探討

目前國內(nèi)糖蜜酒精連續(xù)發(fā)酵一般有5～10級，種子罐兼作酵母培養(yǎng)罐和前發(fā)酵罐，酵母濃度 0.8億～1.5億個/mL，酒度4%～6%（v/v），后發(fā)酵罐經(jīng)過高濃糖蜜沖稀后酵母濃度只有 0.5億～1億個/mL，一般種子罐發(fā)酵時間10 h，后發(fā)酵時間30～40 h。高密度細胞培養(yǎng)技術(shù)現(xiàn)在已經(jīng)非常成熟，筆者常年與廣東梅山—馬利酵母有限公司、廣東丹寶利酵母有限公司、廣西湘桂酵母科技有限公司合作，據(jù)了解采用高密度細胞培養(yǎng)技術(shù)時細胞濕重可達到150～200 g/L發(fā)酵液，細胞濃度可以達到20億～30億個/mL，如果采用高密度細胞發(fā)酵，根據(jù) K值理論發(fā)酵周期可縮短至10 h以內(nèi)，也就是說只需配備2～3個發(fā)酵罐，可大大減少設(shè)備和場地投資費用，高密度細胞快速發(fā)酵亦可大幅增加酒精產(chǎn)能，是一項非常有市場前景的生物技術(shù)。

［1］陳學(xué)鵬. 固定化酵母在（糖蜜）酒精連續(xù)發(fā)酵生產(chǎn)中的應(yīng)用［J］. 釀酒科技，2001（2）：43-44.

［2］徐日益，梁磊，尚紅巖，等. 糖蜜酒精發(fā)酵過程酵母結(jié)團及低酒分解決措施［J］. 甘蔗糖業(yè)，2009（4）：38-39.

［3］吳振強，梁世中. 糖蜜酒精蒸餾廢液色素研究［J］. 環(huán)境污染與防治，2002，24（1）：13-15.

［4］王湘茹，于淑娟. 甘蔗糖蜜澄清處理及處理前后組分分析［J］. 中國調(diào)味品，2010，35（2）：64-68.

［5］陳雪，甄玉國，趙小麗. 以糖蜜為碳源對釀酒酵母發(fā)酵條件的優(yōu)化［J］. 中國飼料，2015（6）：14-16.

［6］梁磊，張遠平，浦躍武，等. 高酵母接種量的抑菌特性及其在蔗汁生產(chǎn)乙醇中的應(yīng)用［J］. 食品與發(fā)酵工業(yè)，2007，33（12）：1-3.

［7］張鋒，劉鉞，李勇，等. 不同接種量對酒精發(fā)酵的影響淺析［J］. 創(chuàng)新科技，2014（20）：84-85.

（本篇責(zé)任編校：鄧丹丹）

Feasibility Study on Rapid Fermentation Technology Based on High Cell Concentration

XU Ri-yi1，2，3，4， SHANG Hong-yan1，2，3，4， HUANG Xiang-yang1，2，3，4， LIANG Lei1，2，3，4， SU Jiang-bing1，2，3，4，CHEN Qi-qiu5
（1Guangdong Provincial Bioengineering Institute （Guangzhou Sugarcane Industry Research Institute）/Guangdong Key Lab of Sugarcane Improvement & Biorefinery， Guangzhou 510316；2Guangdong Engineering Research & Development Center for Comprehensive Utilization of Plant Fiber， Guangzhou 510316；3Guangzhou Key Laboratory for Comprehensive Utilization of Plant Fiber， Guangzhou 510316；4Guangdong Provincial Engineering Laboratory of Biomass High Value Utilization， Guangzhou 510316；5Guangdong Xuwen Sanhe Development Co. Ltd.， Zhanjiang 524132）

Various quantities of fresh yeast cells were inoculated in molasses medium to ferment alcohol. The results suggested that with inoculum concentration increasing， the cell proliferation rate， fermentation period and distillation yield decreased. Further analysis showed the product of fermentation period and mean cell numbers which were calculated by initial cell numbers and final cell numbers was constant within limits， which indicated that the rapid fermentation technology based on high cell concentration was feasible and promising.

High cell concentration；Rapid fermentation；Alcohol

TS249.3

A

1005-9695（2016）05-0029-04

2016-06-22；

2016-10-09

廣東省省級科技計劃項目（2013B010102002、2014A010107017、2016B070701005）；廣東省科學(xué)院科研平臺環(huán)境與能力建設(shè)專項資金項目（2016GDASPT-0208）

徐日益（1984-），男，江西人，工學(xué)碩士，高級工程師，研究方向：發(fā)酵工程

引文格式：徐日益，尚紅巖，黃向陽，等. 基于高密度細胞的快速發(fā)酵酒精技術(shù)可行性研究［J］. 甘蔗糖業(yè)，2016（5）：29-32.