羅敏婷吳克剛 黃偉乾

(1. 廣東工業(yè)大學(xué)輕工化工學(xué)院食品科學(xué)與工程系，廣東 廣州 510006；2. 廣州質(zhì)量監(jiān)督檢測(cè)研究院，廣東 廣州 510110)

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嬰幼兒輔食營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充品中葉酸的測(cè)定方法

羅敏婷1吳克剛1黃偉乾2

(1. 廣東工業(yè)大學(xué)輕工化工學(xué)院食品科學(xué)與工程系，廣東 廣州 510006；2. 廣州質(zhì)量監(jiān)督檢測(cè)研究院，廣東 廣州 510110)

采用微生物法、固相萃取—高效液相色譜法和直接氨水提取—高效液相色譜法3種方法分別對(duì)嬰幼兒輔食營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充品中葉酸進(jìn)行檢測(cè)，選出最為準(zhǔn)確、快速的方法。結(jié)果表明：采用pH 6.3的甲醇—0. 05 mol/L磷酸二氫鉀(體積比為5∶95)作為流動(dòng)相，控制葉酸在6.5 min出峰的氨水提取—高效液相色譜法，其標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)為0.999 8，檢出限為0.019 0 mg/L。與另外兩種方法相比，該方法具有簡(jiǎn)便、快速、靈敏、重現(xiàn)性好等優(yōu)點(diǎn)，為建立嬰幼兒輔食營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充劑中葉酸含量的測(cè)定方法提供了理論依據(jù)。

嬰幼兒輔食；營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充品；葉酸；微生物法；固相萃取；氨水提??；高效液相色譜

葉酸(folic acid)又稱維生素B9，是一種重要的水溶性維生素，必須從日常食物中獲取來(lái)維持人體正常的生理功能，人體內(nèi)缺乏葉酸會(huì)引起巨幼紅細(xì)胞貧血、新生胎兒神經(jīng)管畸形等疾病[1]。2015年9月，北京舉辦的第四屆中國(guó)出生缺陷防控論壇再次強(qiáng)調(diào)了葉酸在預(yù)防神經(jīng)管畸形及其他出生缺陷中的重要性。輔食營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充品是由多種微量營(yíng)養(yǎng)素混合成的粉末或顆粒狀補(bǔ)充品，其中含或不含食物基質(zhì)和其他輔料，是應(yīng)用于嬰幼兒輔食家庭強(qiáng)化使用的營(yíng)養(yǎng)素補(bǔ)充品[2-3]。隨著人民生活水平的提高和營(yíng)養(yǎng)知識(shí)的廣泛普及，人們通過(guò)服用膳食補(bǔ)充劑來(lái)彌補(bǔ)膳食中攝入不足的營(yíng)養(yǎng)素。但是目前國(guó)內(nèi)外尚未有此類產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)，而基質(zhì)復(fù)雜膳食補(bǔ)充劑的監(jiān)督監(jiān)測(cè)工作尚處于起步階段，尚無(wú)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)和國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)對(duì)其葉酸進(jìn)行檢測(cè)的方法[4]。所以研發(fā)一種快速靈敏的、可以用于檢測(cè)低質(zhì)量分?jǐn)?shù)、基質(zhì)復(fù)雜的營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充品中葉酸的方法成為當(dāng)務(wù)之急。

針對(duì)食品中葉酸含量檢測(cè)方法的研究，國(guó)內(nèi)外的科技工作者近年來(lái)已進(jìn)行了深入的研究，根據(jù)檢測(cè)食品的類型不同而開發(fā)出多種檢測(cè)葉酸含量的分析方法[5]。目前，測(cè)定葉酸的分析方法主要有微生物法、分子熒光法等，這些前處理方法往往較復(fù)雜、重現(xiàn)性差、檢測(cè)周期長(zhǎng)等，而微生物法靈敏度高、結(jié)果準(zhǔn)確，所以許多國(guó)際機(jī)構(gòu)仍將微生物法作為葉酸分析的標(biāo)準(zhǔn)方法或第一方法[6]；對(duì)于檢測(cè)限較低的蔬菜、保健食品等的檢測(cè)，中國(guó)多采用高效液相色譜法[7-9]；據(jù)報(bào)道[10]國(guó)外對(duì)于強(qiáng)化葉酸的產(chǎn)品的檢測(cè)，一般都通過(guò)固相萃取小柱富集、純化，然后用檢出限高、選擇性好的高效液相色譜法紫外檢測(cè)器檢測(cè)。上述常用的3種葉酸的檢測(cè)方法都各有優(yōu)缺點(diǎn)，而目前研究工作中針對(duì)基質(zhì)復(fù)雜的嬰幼兒輔食營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充劑葉酸測(cè)定方法的研究尚少見報(bào)道。本研究針對(duì)中國(guó)基質(zhì)復(fù)雜的嬰幼兒輔食營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充劑中葉酸分析方法的不足，擬采用了微生物法、固相萃取—液相色譜和氨水提取—液相色譜3種不同的檢測(cè)方法比較分析測(cè)定的差異性，用氨水提取—液相色譜法建立了一個(gè)適用于此類樣品葉酸定量檢測(cè)的快速、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確的分析方法，為實(shí)際檢測(cè)提供有效的數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

干酪乳桿菌(Lactobacillus casei)ATCC 7469：美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心；

乳酸桿菌瓊脂(/肉湯)培養(yǎng)基、葉酸酪蛋白培養(yǎng)基：美國(guó)碧迪醫(yī)療器械(上海)有限公司；

嬰幼兒輔食營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充品：葉酸聲稱含量4 000 μg/100 g，市售；

葉酸標(biāo)準(zhǔn)品：99.9%，上海安譜科學(xué)儀器有限公司；

抗壞血酸：分析純，廣州化學(xué)試劑廠；

甲醇：色譜純，美國(guó)Fisher公司；

磷酸二氫鉀：分析純，廣州化學(xué)試劑廠；

氨水(氫氧化銨)：分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司；

試驗(yàn)用水為蒸餾水，流動(dòng)相經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

高壓滅菌鍋：HVE-50型，日本平山公司；

隔水式恒溫培養(yǎng)箱：GNP-9270型，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；

紫外—可見分光光度計(jì)：UV-1800型，日本島津公司；

高效液相色譜儀(配二極管陣列檢測(cè)器)：1260型，美國(guó)安捷倫Agilent公司；

超聲波清洗機(jī)：JP-080S型，深圳潔盟清潔設(shè)備有限公司；

萃取柱：Waters Sep-Pak○RVac 6cc C18-500 mg型，美國(guó)Waters公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 微生物法

(1) 標(biāo)準(zhǔn)曲線制作：葉酸標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的濃度為0.60 ng/mL。在無(wú)菌條件下，按照表1的順序在滅菌試管中進(jìn)行葉酸標(biāo)準(zhǔn)工作液的稀釋，從而制備一系列濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液[11]。

表1 葉酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液的制備

(2) 樣品測(cè)定溶液的制備：準(zhǔn)確稱取約2 g(精確到0.000 1 g)樣品于100 mL燒杯中，用25～30 mL二級(jí)水復(fù)原樣品，定容至100 mL。然后吸取1 mL該樣液于試管中，加19 mL含抗壞血酸的磷酸緩沖液，并于100 ℃水浴加熱5 min。再用磷酸鹽緩沖液稀釋，定容至100 mL，作為葉酸樣品溶液。制備完樣品測(cè)定溶液后，在無(wú)菌條件下，按照表2的順序在滅菌試管中進(jìn)行樣品工作液的稀釋，從而制備相應(yīng)濃度梯度的樣品測(cè)定溶液[12]。

表2 樣品測(cè)定溶液的制備

(3) 接種培養(yǎng)：在已滅菌的小管中每管加入300 μL系列標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液(或樣品測(cè)定溶液)和300 μL含有0.05%濃度試驗(yàn)用菌懸液的無(wú)菌葉酸酪蛋白培養(yǎng)基，加蓋，充分振蕩混勻置于(36±1) ℃恒溫箱中培養(yǎng)16～24 h[11]。

(4) 測(cè)定：混合均勻，使用紫外—可見分光光度計(jì)于550 nm下測(cè)定各小管溶液的吸光度(A)。

1.2.2 固相萃取—液相色譜法

(1) 色譜分析條件：色譜柱，迪馬C18(2)柱(250 mm×4.6 mm)；流動(dòng)相，甲醇—0.05 mol/L磷酸二氫鉀(體積比為5∶95，0.1 mol/L KOH溶液調(diào)節(jié)pH值為6.3)；柱溫，30 ℃；流速，1.0 mL/min；進(jìn)樣量，20 μL；波長(zhǎng)選擇，二極管陣列檢測(cè)器對(duì)葉酸標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，結(jié)果顯示出的最大吸收峰為278 nm[13]。

(2) 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：葉酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液濃度為114 μg/mL，貯于4 ℃冰箱中避光保存。

(3) 樣品前處理：準(zhǔn)確稱取5 g左右(精確到0.000 1 g)樣品于50 mL錐形瓶中，加約30 mL pH 6.3的0.05 mol/L磷酸二氫鉀溶液(不含甲醇)、0.25 mL濃氨水和2 mL 1% VC溶液，振蕩溶解再超聲提取20 min，搖勻后用磷酸二氫鉀溶液(不含甲醇)將超聲后溶液定容至100 mL比色管中，混勻，過(guò)濾。

活化：先用10 mL甲醇(色譜純)活化C18萃取柱，再用5 mL蒸餾水沖去甲醇；

上樣：取10 mL樣品清液加到活化的C18小柱柱床上，控制流速在40滴/min；

淋洗：待樣液全部通過(guò)固相萃取柱后，用5 mL蒸餾水淋洗，棄去濾液；洗脫：用3 mL的氨水—甲醇水(5∶95)進(jìn)行洗脫，直至C18萃取柱上的肉眼可見的色素全部洗脫下來(lái)，收集洗脫液，再用1 mL蒸餾水再次洗脫，氮?dú)獯蹈桑ㄈ莸? mL?；靹?，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾。

(4) 測(cè)定：按照1.2.2(1)中的色譜分析條件，等待儀器自檢穩(wěn)定后，則分別注入標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品溶液。以保留時(shí)間定性，記錄峰面積(或峰高)，用標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中待測(cè)組分的含量。

1.2.3 氨水提取—液相色譜法

(1) 色譜分析條件：按照1.2.2方法。

(2) 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：按照1.2.2方法。

(3) 樣品前處理：精確稱取1 g(精確到0.000 1 g)樣品，置于50 mL比色管中，加約20 mL流動(dòng)相、0.25 mL濃氨水和1 mL 1% VC溶液，振蕩均勻后超聲提取20 min，用流動(dòng)相定容至刻度。混勻，靜置，取上清液經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾后進(jìn)樣。整個(gè)試驗(yàn)操作過(guò)程用鋁箔紙避光，以免葉酸見光分解。

(4) 測(cè)定：按照1.2.2方法中(4)進(jìn)行測(cè)定。

2 結(jié)果與討論

2.1 微生物法

2.1.1 線性分析 表1中葉酸的濃度作為橫坐標(biāo)，吸光度值(A)作為縱坐標(biāo)，根據(jù)四參數(shù)方程來(lái)擬合微生物法的標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見圖1。其中標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)達(dá)到R2=0.999 4，表明相關(guān)性較好。

圖1 微生物法測(cè)葉酸標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.1.2 結(jié)果 按照GB 5413.16—2010方法和上述方法步驟，根據(jù)測(cè)定數(shù)據(jù)的平均值進(jìn)行計(jì)算，得到樣品中葉酸的量為(1 000.0±12.5) μg/100 g。

2.1.3 討論 在制作微生物法標(biāo)準(zhǔn)曲線的過(guò)程發(fā)現(xiàn)，在圖中描繪的各檢測(cè)點(diǎn)不是形成一條直線，而是隨著葉酸濃度的增加其相應(yīng)的吸光度值(A)緩慢增加。為了能進(jìn)行更加精確的計(jì)算，本試驗(yàn)則采用四階方程進(jìn)行擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線。

雖然微生物法是檢測(cè)葉酸含量的第一法，但是檢測(cè)出來(lái)的結(jié)果為(1 000.0±12.5) μg/100 g，與樣品的明示值4 000 μg/100 g存在較大的偏差。從標(biāo)準(zhǔn)曲線看，其相關(guān)性良好說(shuō)明試驗(yàn)方法和試劑都不存在問(wèn)題。但通過(guò)與嬰幼兒配方奶粉的營(yíng)養(yǎng)配方表相比較，發(fā)現(xiàn)存在較大不同的就是嬰幼兒輔食營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充品中含有大量的維生素和礦物質(zhì)，所以可以初步判定結(jié)果差異在于樣品基質(zhì)，而是否因?yàn)榫S生素和礦物質(zhì)含量過(guò)多導(dǎo)致微生物生長(zhǎng)不起來(lái)則需進(jìn)一步的研究。

在馮阿姨家一年多的工作中，我認(rèn)為自己可以勝任這些零碎的家務(wù)活了，想挑戰(zhàn)自己換家客戶試試，換個(gè)工作環(huán)境，提高自己的工作水平，當(dāng)然也希望在工資待遇方面可以更高。幾經(jīng)考慮之后，我和阿姨商量，阿姨同意了我的請(qǐng)求，就這樣我懷著不舍和對(duì)未來(lái)的期待離開了我的第一個(gè)客戶家。在門店短暫休息后，我很快去了第二個(gè)客戶家——一個(gè)三口之家。客戶黃女士懷有身孕，我的工作是給他們做飯，打掃衛(wèi)生，照顧孕婦，接送八歲的孩子上學(xué)。他們是山東人，喜歡吃面食，正好我擅長(zhǎng)做面食，加上在馮阿姨家學(xué)到的做菜方法，這些工作對(duì)我來(lái)說(shuō)得心應(yīng)手。特別是她家的孩子很喜歡吃我做的土豆沙拉、 油餅、蛋卷。

2.2 固相萃取—液相色譜法

2.2.1 前處理?xiàng)l件的確定 與氨水提取—液相色譜法相比，由于固相萃取—液相色譜法的提取液在空氣停留的時(shí)間較長(zhǎng)，特別是富集過(guò)程，所以將1%抗壞血酸添加量增加到2 mL；再由于固相萃取—液相色譜法中的洗脫液為氨水—甲醇水(體積比為5∶95)，所以提取液的溶劑不應(yīng)該含有甲醇，以免影響檢測(cè)的結(jié)果。

2.2.2 流動(dòng)相組成的選擇 為了使固相萃取—液相色譜法能與氨水提取—液相色譜法具有有效的可比性，所以選擇相同的流動(dòng)相組成進(jìn)行試驗(yàn)，即采用pH 6.3的甲醇—磷酸二氫鉀(體積比為5∶95)作為流動(dòng)相。

2.2.3 方法線性范圍與檢出限 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制及線性范圍：準(zhǔn)確移取114 μg/mL葉酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液稀釋，用流動(dòng)相配制成含葉酸的濃度為0.0，0.1，0.5，1.0，2.5，5.0，7.5，10.0 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)系列，各個(gè)濃度重復(fù)進(jìn)樣3次，取相應(yīng)3次峰面積的平均值。然后以葉酸的質(zhì)量濃度(C)作為橫坐標(biāo)，峰面積(A)為縱坐標(biāo)來(lái)繪制線性關(guān)系曲線。根據(jù)圖2可得到結(jié)果的線性回歸方程為：y=51.79x+2.869 4，相關(guān)系數(shù)R2為0.999 7，表明在0～10 μg/mL時(shí)，葉酸的質(zhì)量濃度(C)和峰面積(A)的線性關(guān)系良好，適合用來(lái)做定量分析。

檢出限：以3倍信噪比條件下對(duì)應(yīng)的樣品濃度計(jì)算檢測(cè)限，S/N=2.638 3/0.034 56=76.33(濃度為0.501 6 μg/mL)。所以儀器S/N=3時(shí)，檢出限LOQ為0.019 7 μg/mL；S/N=10時(shí)，定量限為0.065 6 μg/mL。

圖2 固相萃取—液相色譜法測(cè)葉酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2.4 加標(biāo)回收率 采用加標(biāo)回收率評(píng)價(jià)方法的準(zhǔn)確度：取樣品4份，向其中一份樣品加入1 mL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，按前處理方法處理后重復(fù)進(jìn)樣3次，測(cè)定其相應(yīng)的3次峰面積，計(jì)算其相應(yīng)的回收率及RSD，結(jié)果見表3。

由表3可知，葉酸的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.88%～1.76%，但是其回收率僅為37.7%～42.8%，說(shuō)明本方法的準(zhǔn)確性有待研究和驗(yàn)證。

表3 固相萃取—液相色譜法測(cè)葉酸的回收率和RSD值

2.2.5 精密度 取標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液進(jìn)樣20 μL，按上述色譜條件連續(xù)重復(fù)進(jìn)樣6次，峰面積分別是6 064，6 080，6 006，6 044，6 032，6 076，計(jì)算出峰面積的平均值為6 046.8，其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.18%，表明儀器精密度良好。

2.2.6 重現(xiàn)性試驗(yàn) 取葉酸樣品適量，共6份，按前處理制備樣品溶液，進(jìn)樣20 μL，計(jì)算葉酸的含量及RSD，結(jié)果測(cè)得葉酸含量分別是1.135，1.016，1.043，1.021，1.048，1.122 mg/100 g，其平均含量為1.064 mg/100 g，RSD為0.86%，表明重復(fù)良好。

2.2.7 討論 此方法與氨水提取—液相色譜法的前處理基本相同，根據(jù)理論同一個(gè)樣品兩種方法測(cè)定出來(lái)的結(jié)果應(yīng)該相同的，然而兩者得出的結(jié)果卻截然不同，可能與樣品的基質(zhì)、提取不完全、洗脫不充分等影響的因素有關(guān)。

本試驗(yàn)根據(jù)固相萃取的提取方法得到的回收率僅為30%～40%，但測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)曲線、精密度、準(zhǔn)確度和重現(xiàn)性都良好，結(jié)果說(shuō)明了葉酸的標(biāo)準(zhǔn)品及儀器的精密度及準(zhǔn)確性不存在任何問(wèn)題，僅僅是對(duì)樣品提取的方法出現(xiàn)問(wèn)題，需要進(jìn)一步進(jìn)行改善。影響其測(cè)定結(jié)果的因素也很多，例如樣品中葉酸含量少、樣品的基質(zhì)、洗脫液的性質(zhì)、洗脫終點(diǎn)的判定等。

2.3 氨水提取—液相色譜法

2.3.1 前處理?xiàng)l件的確定 葉酸具有光不穩(wěn)定性、易被氧化等性質(zhì)，這些均會(huì)影響試驗(yàn)的準(zhǔn)確性，所以操作過(guò)程中用鋁箔紙避光；因?yàn)槿~酸在中性偏堿性情況下較為穩(wěn)定，所以選取0.5%氨水作為提取液，使提取液處于弱堿性狀態(tài)；因?yàn)榭寡趸瘎￢c對(duì)葉酸的穩(wěn)定性具有明顯的保護(hù)作用，所以在提取液中加入1% Vc溶液。

2.3.2 流動(dòng)相組成優(yōu)化試驗(yàn) 葉酸屬于極性的兩性化合物，流動(dòng)相的酸堿性是影響葉酸存在形式的關(guān)鍵因素。查閱大量高效液相色譜法測(cè)定食品中的葉酸含量相關(guān)文獻(xiàn)[1,13]及GB 5413.16—2010標(biāo)準(zhǔn)時(shí)發(fā)現(xiàn)，流動(dòng)相大多采用磷酸鹽緩沖液與有機(jī)溶劑按一定比例混合的溶液，同時(shí)也有資料[14]采用乙酸銨作為流動(dòng)相。經(jīng)試驗(yàn)分析研究磷酸二氫鉀和乙酸銨的分離效果，得出的結(jié)果與趙雯瑋等[14]研究的結(jié)果一致：當(dāng)流動(dòng)相為乙酸銨時(shí)，不僅會(huì)出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象，而且其分離度也不如磷酸二氫鉀溶液。

有機(jī)溶劑的選擇方面，相比乙腈，甲醇毒性比較低，價(jià)格也相當(dāng)廉價(jià)，在吸光度等各方面的表現(xiàn)也毫不遜色。盡管使用時(shí)對(duì)柱子會(huì)產(chǎn)生較大的壓力，但若能使用普遍壓力較低的色譜柱，依然可以達(dá)到理想的分析效果。

根據(jù)葉酸的性質(zhì)，試驗(yàn)主要采用甲醇與磷酸二氫鉀體系作為流動(dòng)相。在研究甲醇—磷酸二氫鉀不同比例混合的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，如果流動(dòng)相中甲醇的量增加時(shí)，葉酸的保留時(shí)間會(huì)提前，但是其色譜峰不能有效分離。當(dāng)甲醇—磷酸二氫鉀的體積比為5∶95時(shí)，葉酸的色譜峰在6.5 min出現(xiàn)，且能有效分離出來(lái)。

本研究最終采用甲醇—磷酸二氫鉀(體積比為5∶95)作為流動(dòng)相，固定其他試驗(yàn)條件不變，改變流動(dòng)相的pH值，比較了不同pH值對(duì)葉酸分離情況，結(jié)果表明當(dāng)流動(dòng)相的pH 6.3時(shí)，葉酸的保留時(shí)間和分離度都較好。

2.3.3 方法線性范圍與檢出限 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制及線性范圍：準(zhǔn)確移取114 μg/mL葉酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液稀釋，用流動(dòng)相配制成含葉酸的濃度為0.0，0.1，0.5，1.0，2.5，5.0，10.0 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)系列，各個(gè)濃度重復(fù)進(jìn)樣3次，取相應(yīng)3次峰面積的平均值。然后以葉酸的質(zhì)量濃度(C)作為橫坐標(biāo)，峰面積(A)為縱坐標(biāo)來(lái)繪制線性關(guān)系曲線。根據(jù)圖3可得到結(jié)果的線性回歸方程為：y=68.591x-0.712 3，相關(guān)系數(shù)R2為0.999 8，從而表明在0～10 μg/mL時(shí)，葉酸的質(zhì)量濃度(C)和峰面積(A)的線性關(guān)系良好，適合用來(lái)做定量分析。

檢出限：以3倍信噪比條件下對(duì)應(yīng)的樣品濃度計(jì)算檢測(cè)限，S/N=2.236 8/0.028 39=78.79(濃度=0.5 μg/mL)。所以儀器S/N=3時(shí)，檢出限LOQ為0.019 0 μg/mL；S/N=10時(shí)，定量限為0.063 4 μg/mL。

圖3 氨水提取—液相色譜法測(cè)葉酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線

Figure 3 Folic acid standard curve of direct-ammonia-extraction-HPLC method

2.3.4 加標(biāo)回收率 采用加標(biāo)回收率評(píng)價(jià)方法的準(zhǔn)確度：取樣品4份，向其中一份樣品加入1 mL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，按前處理方法處理后重復(fù)進(jìn)樣3次，測(cè)定其相應(yīng)3次峰面積，計(jì)算其相應(yīng)的回收率及RSD，結(jié)果見表4。

由表4可知，葉酸的回收率為91.65%～99.4%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.76%～1.50%，說(shuō)明本方法比較準(zhǔn)確。

2.3.5 精密度 取標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液進(jìn)樣20 μL，按上述色譜條件連續(xù)重復(fù)進(jìn)樣6次，峰面積分別是7 822，7 878，7 732，7 594，7 892，8 004，計(jì)算出峰面積的平均值為7 820.3，其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為 0.69%，表明儀器精密度良好。

表4 氨水提取—液相色譜法測(cè)葉酸的回收率和RSD值

Table 4 The recovery rates and determination precision of folic acid of direct-ammonia-extraction-HPLC method

序號(hào)加入值/(10-2μg·g-1)測(cè)定平均值/(10-2μg·g-1)RSD/%回收率/%1054241．45-2049521．76-3045461．00-411330158081．4591．65～99．4

2.3.6 重現(xiàn)性試驗(yàn) 取葉酸樣品適量，共6份，按前處理制備樣品溶液，進(jìn)樣20 μL，計(jì)算葉酸的含量及RSD，測(cè)得葉酸含量分別是5.022，4.950，4.946，4.943，5.011，4.945 mg/100 g，其平均含量為 4.969 mg/100 g，RSD為1.22%，表明重復(fù)良好。2.3.7 討論 葉酸在酸性溶液中對(duì)熱不穩(wěn)定，溶于熱水、堿性溶液，而選擇流動(dòng)相pH值呈弱酸性的第一個(gè)原因是葉酸在堿性溶液中易被氧化，第二原因是配制的標(biāo)準(zhǔn)品溶液和樣品溶液均為弱堿性，葉酸大部分以離子形式存在，若流動(dòng)相是偏弱酸性，則可抑制葉酸的電離，使葉酸以分子形式在柱中分離，防止出現(xiàn)拖尾峰，提高試驗(yàn)的準(zhǔn)確性。

2.4 三種方法測(cè)定嬰幼兒輔食營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充品葉酸含量的比較

按照上述三種方法對(duì)嬰幼兒輔食營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充品的葉酸含量進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見表5。由表5可知，只有氨水提取—高效液相色譜測(cè)定出來(lái)的結(jié)果最靠近試驗(yàn)樣品的明示值。直接用氨水提取—液相色譜測(cè)定嬰幼兒輔食營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充劑中的葉酸更為準(zhǔn)確，且前處理簡(jiǎn)單，分析速度快、適用的基質(zhì)范圍廣、實(shí)用性強(qiáng)，為嬰幼兒輔食營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充劑中葉酸含量的測(cè)定提供了有效的數(shù)據(jù)支撐。

表5 三種方法測(cè)定結(jié)果比較

3 結(jié)論

雖然微生物法被中國(guó)定為檢測(cè)食品中葉酸的第一法，但是由于嬰幼兒輔食營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充品的基質(zhì)與傳統(tǒng)的食品不同，所以檢測(cè)出來(lái)的結(jié)果與樣品的明示值有所偏差。再加上微生物法的前處理較復(fù)雜、干擾物質(zhì)多、檢測(cè)周期較長(zhǎng)等因素，與社會(huì)需求的快速高效檢測(cè)不相符合。由于嬰幼兒輔食營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充劑中含有的葉酸比較少，從理論上通過(guò)固相萃取后進(jìn)行洗脫，會(huì)使得檢測(cè)葉酸的結(jié)果更加準(zhǔn)確。但實(shí)際上，洗脫過(guò)程難以控制，難以判斷洗脫終點(diǎn)；加上樣品中含有大量的礦物質(zhì)；可能洗脫液的洗脫能力不夠強(qiáng)而導(dǎo)致葉酸不能洗脫完全等因素導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果有所偏差。

方法學(xué)考察結(jié)果表明，采用pH 6.3的甲醇—0.05 mol/L磷酸二氫鉀(體積比為5∶95)作為流動(dòng)相，控制葉酸在6.5 min出峰的氨水直接提取—液相色譜法檢測(cè)嬰幼兒輔食營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充品中葉酸含量，操作簡(jiǎn)便迅速、準(zhǔn)確度和精密度均較理想，方法的線性范圍廣。在針對(duì)嬰幼兒輔食營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充品葉酸含量的實(shí)際檢測(cè)工作中，采用快速、準(zhǔn)確的氨水直接提取—液相色譜法更為合適，為建立嬰幼兒輔食營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充劑中葉酸含量測(cè)定的方法提供有效的理論依據(jù)。

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Methods of detecting the content of folic acid in infant complementary food supplements

LUO Min-ting1WUKe-gang1HUANGWei-qian2

(1.DepartmentofFoodScienceandEngineering,FacultyofChemicalEngineeringandLightIndustry,GuangdongUniversityofTechnology,Guangzhou,Guangdong510006,China; 2.GuangzhouQualitySupervisionandTestingInstitute,Guangzhou,Guangdong510110,China)

To detect infant complementary food supplements of folic acid, methds of microbiological method, solid-phase-extraction-HPLC and direct-ammonia-extraction-HPLC were utilized respectively. Analyses among the three methods were compared and the most accurate and rapid one was determined. The results showed the direct-ammonia-extraction-HPLC analysis by using the CH3OH-0.05 mol/L KH2PO4(volum ratio,5∶95; pH 6.3) as mobile phase and controlling the peak time at 6.5 min, and the standard curve coefficient was 0.999 8 with detection limit 0.019 0 mg/L. Compared with the other two methods, this method was simple, rapid, sensitive and reproducible characteristics, and provided an effective theoretical basis to establish method of folic acid detections in infant complementary food supplements.

infant complementary food; nutritional supplements; folic acid; microbiological method; solid phase extraction; ammonia extraction; HPLC

國(guó)家科技支撐計(jì)劃(編號(hào)：2015BAD16B08)；廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目(編號(hào)：2014B020205005，2015B020204002)

羅敏婷，女，廣東工業(yè)大學(xué)在讀碩士研究生。

吳克剛(1969—)，男，廣東工業(yè)大學(xué)教授，博士。

E-mail：wukegang2003@163.com

2016-02-09