拮抗菌Burkholderia contaminans對(duì)玫瑰香葡萄采后灰霉病的抗性誘導(dǎo)

范三紅，李 靜，施俊鳳

（1.山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西 太原 030006；2.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品貯藏保鮮研究所，山西 太原 030031）

拮抗菌Burkholderia contaminans對(duì)玫瑰香葡萄采后灰霉病的抗性誘導(dǎo)

范三紅1，李 靜1，施俊鳳2

（1.山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西 太原 030006；2.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品貯藏保鮮研究所，山西 太原 030031）

以玫瑰香葡萄為實(shí)驗(yàn)試材，研究洋蔥霍爾德氏菌（Burkholderia contaminans B-1）對(duì)玫瑰香葡萄采后灰霉病的抗性誘導(dǎo)機(jī)理，對(duì)經(jīng)拮抗菌處理貯藏后果實(shí)的腐爛率及其抗性相關(guān)物質(zhì)進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果表明：拮抗菌B. contaminans B-1可有效降低玫瑰香葡萄采后腐爛率，與對(duì)照相比，果梗腐爛率降低69.58%，果肉腐爛指數(shù)降低63.93%。拮抗菌處理對(duì)果實(shí)苯丙烷代謝途徑、活性氧代謝途徑和其他抗性相關(guān)酶類活性均有影響。與對(duì)照相比，B. contaminans B-1處理可提高葡萄果實(shí)苯丙氨酸解氨酶（PAL）、過氧化物酶（POD）、超氧化物歧化酶（SOD）和多酚氧化酶（PPO）活性，促進(jìn)過氧化氫（H2O2）含量積累，延緩過氧化氫酶（CAT）活性峰值出現(xiàn)的時(shí)間。此外， 拮抗菌處理也可以誘導(dǎo)果實(shí)病程相關(guān)蛋白幾丁質(zhì)酶（CHI）和β-1,3葡聚糖酶（GLU）活性的上升。

玫瑰香葡萄；生物防治；抗性誘導(dǎo)

玫瑰香葡萄又名麝香葡萄，因其含糖量高、著色好、麝香味濃而受到消費(fèi)者喜愛[1]，與其他品種相比，玫瑰香葡萄皮薄、含汁量大，在貯藏保鮮期間極易發(fā)生腐爛[2]?；颐共∈酋r食葡萄采后常見的一種病害，其病原菌灰葡萄孢霉（Botrytis cinerea）寄主范圍廣，耐低溫，在葡萄貯藏環(huán)境中極易繁殖，直接影響其商品價(jià)值及食用價(jià)值[3]。果實(shí)采后生防技術(shù)是近年來發(fā)展起來的一種“綠色防腐”技術(shù)，與傳統(tǒng)的SO2熏蒸處理相比，該技術(shù)具有對(duì)人畜安全無殘毒、對(duì)環(huán)境無污染、對(duì)病原菌無抗性、且不破壞生態(tài)平衡等優(yōu)點(diǎn)[4]。

果實(shí)采后抗性激發(fā)子主要包括生物因子和非生物因子。這些因子通過激發(fā)植物自身的抗病能力來有效抵御或殺死病原菌，從而降低腐爛[5]。生物因子主要指一些生防菌株，目前已有多種生防菌株誘導(dǎo)果實(shí)產(chǎn)生抗性的相關(guān)報(bào)道，如酵母拮抗菌P. membrunefacaen可以降低桃果實(shí)由葡枝根霉（Rhizopus stolonafer）引起的采后軟腐病的發(fā)病率，還可提高果實(shí)過氧化物酶（peroxidase，POD）、多酚氧化酶（polyphenloxidase，PPO）、苯丙氨酸解氨酶（phenylalanine ammonia-lyase，PAL）等酶活性[6]；Droby等[7]采用拮抗菌Candida oleophila噴灑葡萄表面，可顯著提高其果實(shí)組織中幾丁質(zhì)酶（chitinase，CHI）和β-1,3葡聚糖酶（β-1,3-glucanase，GlU）活性。本實(shí)驗(yàn)以洋蔥霍爾德氏菌（Burkholderia contaminans B-1）為生防菌株，研究其對(duì)玫瑰香葡萄采后抗病性的誘導(dǎo)機(jī)理，以期為葡萄采后生物防治技術(shù)的發(fā)展提供一定的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、菌種與試劑

玫瑰香葡萄采自山西省太谷縣玫瑰香種植基地，達(dá)到商品成熟期時(shí)進(jìn)行采摘，采摘當(dāng)天運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室預(yù)冷并貯藏于0 ℃冷庫中。

洋蔥霍爾德氏菌由本實(shí)驗(yàn)室分離于杏果實(shí)表面，并根據(jù)核糖體26S D1/D2區(qū)和ITS區(qū)核甘酸序列比對(duì)及生理生化特性進(jìn)行鑒定；灰葡萄孢霉（Botrytis cinerea）分離于自然發(fā)病的葡萄果實(shí)，并通過ITS區(qū)和形態(tài)特征進(jìn)行鑒定。

細(xì)菌培養(yǎng)基為L(zhǎng)B培養(yǎng)基[8]：酵母膏10.0 g/L、蛋白胨 10.0 g/L、氯化鈉5.0 g/L、pH 7.2；真菌培養(yǎng)基為PDA培養(yǎng)基[9]：馬鈴薯200 g/L、葡萄糖20 g/L、瓊脂15 g/L、pH 7.0。

對(duì)氨基苯磺酸、3,5-二硝基水楊酸、酒石酸鉀鈉、鄰苯二酚 天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所；愈創(chuàng)木酚、a-萘胺、昆布多糖、甲殼素、核黃素、蝸牛酶 北京索萊寶科技有限公司；β-巰基乙醇、四氮唑藍(lán) 美國(guó)Amresco公司。

1.2 儀器與設(shè)備

LS-B50L-I型立式壓力蒸汽滅菌器 江陰濱江醫(yī)療設(shè)備有限公司；DHP-9272型電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海一恒科技有限公司；HPG-280BX光照培養(yǎng)箱 哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司；GL-20G-II離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠；Ultrospec 2000紫外-可見分光光度計(jì)美國(guó)Pharmacia公司。

1.3 方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)材料的制備與果實(shí)處理

1.3.1.1 洋蔥霍爾德氏菌發(fā)酵原液的制備

將-80 ℃保存的拮抗菌B-1在LB固體培養(yǎng)基活化后，挑取經(jīng)活化的LB固體培養(yǎng)基上的拮抗菌B. contaminans B-1單菌落在300/1 000 mL LB液體培養(yǎng)基中28 ℃條件下200 r/min振蕩培養(yǎng)24 h。

1.3.1.2 霉菌孢子懸浮液制備

將灰葡萄孢霉（Botrytis cinerea）于PDA平板培養(yǎng)7 d后，刮取分生孢子，采用血球計(jì)數(shù)法用無菌水配制成濃度為1.0×l05spores/mL的孢子懸浮液。

1.3.1.3 果實(shí)貯藏效果樣品處理

挑選外觀無機(jī)械傷且成熟度一致的玫瑰香葡萄于拮抗菌LB不同濃度（a.發(fā)酵原液；b.稀釋5 倍發(fā)酵液；c.稀釋10 倍發(fā)酵液）培養(yǎng)液中浸泡2 min（對(duì)照不進(jìn)行處理）后分別置于滅菌塑料筐（每筐20 串，每串約20 粒果實(shí)）中，于0 ℃條件下保濕貯藏70 d后檢查。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.3.1.4 果實(shí)抗性相關(guān)物質(zhì)指標(biāo)測(cè)定樣品處理

挑選無機(jī)械傷且成熟度一致的玫瑰香葡萄約750 粒，將其隨機(jī)等量分為對(duì)照組和處理組，將兩組果實(shí)于2%的次氯酸鈉溶液中浸泡2 min，無菌風(fēng)吹干，用滅菌針在其赤道部位刺直徑4 mm深度3 mm的傷口，每個(gè)葡萄各刺1 個(gè)傷口。處理組在傷口處加30 μL B. contaminans的24 h發(fā)酵液，對(duì)照組加30 μL無菌水。2 h后于各傷口處再加15 μL霉菌孢子懸浮液，無菌風(fēng)吹干后于25 ℃培養(yǎng)箱中保濕培養(yǎng)6 d。每天分別取50 粒處理組和對(duì)照組果實(shí)，于其傷口處病斑與健康組織交接部位的果肉作為實(shí)驗(yàn)材料，液氮處理后于-80 ℃條件下貯存待用。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.3.2 果實(shí)貯藏效果測(cè)定

對(duì)貯藏70 d后的果實(shí)和果梗腐爛程度進(jìn)行調(diào)查，根據(jù)腐爛程度將果實(shí)分級(jí)后稱質(zhì)量，并按（1）、（2）分別計(jì)算果梗腐爛率、果實(shí)腐爛指數(shù)。

果梗發(fā)生霉變?yōu)楦癄€，未發(fā)生霉變?yōu)檎！?/p>

根據(jù)果實(shí)腐爛程度分為5 個(gè)等級(jí)，分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)如下：其中0級(jí)：果實(shí)完好，無任何腐爛；1級(jí)：果實(shí)表面現(xiàn)輕微斑點(diǎn)，腐爛面積占果面的1/3以下；2級(jí)：果實(shí)果面有明顯腐爛，腐爛面積約占果實(shí)表面的1/3～1/2；3級(jí)：果實(shí)超過果面的1/2腐爛，但果實(shí)尚有一定硬度；4級(jí)：果實(shí)整體完全潰爛。將果實(shí)分級(jí)后分別稱質(zhì)量。

1.3.3 果實(shí)抗性相關(guān)物質(zhì)指標(biāo)測(cè)定

1.3.3.1 苯丙烷類代謝途徑相關(guān)酶的活性測(cè)定

在植物抗病反應(yīng)中，許多重要的抗菌物質(zhì)都可在苯丙烷類代謝途徑中產(chǎn)生，PAL和POD、PPO分別是該代謝途徑的第一關(guān)鍵酶和末端相關(guān)酶[10]。實(shí)驗(yàn)中PAL活性測(cè)定方法參照Assis等[11]的方法加以改進(jìn)，酶活性以每小時(shí)波長(zhǎng)290 nm處吸光度增加0.01為一個(gè)酶活單位（U）。PPO活性測(cè)定采用鄰苯二酚法[12]，以每分鐘波長(zhǎng)398 nm處吸光度上升0.1作為一個(gè)酶活單位（U）。POD活性測(cè)定采用愈創(chuàng)木酚法[13]，以每分鐘波長(zhǎng)460 nm處吸光度上升0.01作為一個(gè)酶活單位（U）。

1.3.3.2 活性氧代謝途徑相關(guān)指標(biāo)的測(cè)定

活性氧與植物的抗病性密切相關(guān)，植物受病原菌侵染時(shí)體內(nèi)會(huì)積累過氧化氫（H2O2）超氧陰離子自由基（O2-·)，同時(shí)活性氧清除和保護(hù)相關(guān)酶過氧化氫酶（catalase，CAT）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）和POD活性也會(huì)隨之發(fā)生變化。CAT活性參照Wang等[14]的方法加以改進(jìn)，以每分鐘波長(zhǎng)240 nm處吸光度下降0.001作為一個(gè)酶活單位（U）。SOD活性參照Prochazkova等[15]方法加以修改，以每毫克蛋白的反應(yīng)體系抑制氮藍(lán)四唑光化還原的50%為一個(gè)SOD活性單位（U/g）。H2O2含量參考杜淑紅等[16]的方法進(jìn)行改進(jìn)，含量以μmol/mL表示?！ぎa(chǎn)生速率的測(cè)定參照王愛國(guó)等[17]方法加以修改，產(chǎn)生速率以nmol/（min·g）表示。

1.3.3.3 其他抗性相關(guān)酶活測(cè)定

CHI和GlU是植物中普遍存在的抗性物質(zhì)，它們可分別水解真菌細(xì)胞壁主要組分幾丁質(zhì)和1,3-葡聚糖。CHI和GLU活性分別參考趙妍[18]的方法加以改進(jìn)，CHI以每毫升上清液每小時(shí)分解膠體幾丁質(zhì)所釋放1 μmol N-乙酰葡萄糖胺作為一個(gè)酶活單位（U），GLU以每毫升上清液每小時(shí)分解產(chǎn)生1 mg葡萄糖作為一個(gè)酶活單位（U）。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

用軟件DPS 7.0進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析和差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 拮抗菌對(duì)玫瑰香葡萄采后貯藏自然腐爛抑制效果

由圖1可知，采用拮抗菌的發(fā)酵液處理玫瑰香葡萄，于0 ℃條件下貯藏70 d后，3 個(gè)不同濃度的發(fā)酵液均能有效抑制葡萄的腐爛（P＜0.05）。對(duì)照果梗和果肉大部分發(fā)生霉變腐爛，而采用拮抗菌（Burkholderia contaminans）處理后，腐爛程度顯著降低。其中稀釋5 倍的發(fā)酵液貯藏效果最好，發(fā)酵原液效果次之，稀釋10 倍發(fā)酵液效果相對(duì)差些。對(duì)照果梗的腐爛率達(dá)到100%，果肉腐爛指數(shù)為67.14%；而稀釋5 倍的發(fā)酵液其果梗腐爛率僅為30.42%，果肉腐爛指數(shù)僅為3.21%，果梗腐爛率降低69.58%，果肉腐爛指數(shù)降低63.93%。

圖1 拮抗菌對(duì)葡萄采后貯藏腐爛的抑制效果Fig.1 Inhibitory effect of antagonistic bacterial treatment on postharvest rot rate of grapes

2.2 拮抗菌處理對(duì)葡萄果實(shí)PAL、POD、PPO活性的影響

PAL作為苯丙烷類代謝第一步反應(yīng)的關(guān)鍵酶，參與植物木質(zhì)素、植保素和酚類等抗病相關(guān)物質(zhì)的生物合成，PPO氧化酚類物質(zhì)生成的高毒性醌類物質(zhì)可限制和毒殺入侵的病原微生物，POD與植物內(nèi)木質(zhì)素和植保素的合成及對(duì)植物細(xì)胞有害的H2O2和O2-·的清除密切相關(guān)[19]。

圖2 拮抗菌處理對(duì)葡萄采后PAL（A）、POD（BB）和PPO（CC）活性的影響Fig.2 Effect of antagonist bacterial treatment on the activities of PAL (A), POD (B) and PPO (C) of postharvest grape

由圖2A可知，對(duì)照和處理的PAL活性均在第1天時(shí)達(dá)到高峰，且有一個(gè)相近的峰值，在隨后的1～5 d，拮抗菌處理過的果實(shí)PAL活性穩(wěn)定高于對(duì)照，處理后5 d時(shí)，兩者間差異縮小。圖2B中處理組和對(duì)照組的POD活性整體呈上升趨勢(shì)，前3 d該酶活性差異不大，從第3天開始，處理組的POD活性迅速上升，且數(shù)值顯著高于對(duì)照，到第5天時(shí)，兩者差別縮小。從圖2C可看出，在整個(gè)貯藏期間處理組果實(shí)的PPO活性顯著高于對(duì)照，相比對(duì)照不明顯的變化趨勢(shì)，實(shí)驗(yàn)組的PPO活性在第1天就開始快速上升，在第3天時(shí)達(dá)到高峰然后開始下降。

2.3 拮抗菌處理對(duì)葡萄果實(shí)CAT、SOD活性、H2O2含量和·產(chǎn)生速率的影響

圖3 拮抗菌處理對(duì)葡萄采后O2·產(chǎn)生速率（A）、SOD活性（BB）、H2O2含量（C）和CAT活性（D）的影響Fig.3 Effect of antagonist bacterial treatment on· production rate (A), SOD activity (B), H2O2content (C) and CAT activity (D) of postharvest grape

在逆境脅迫下，植物組織最快的抗病反應(yīng)就是形成大量的活性氧（reactive oxygen species，ROS），主要包括H2O2和·等?；钚匝醪粌H能直接殺害入侵的病原微生物，還與植物的過敏反應(yīng)密切相關(guān)。SOD是防御生物體發(fā)生氧化損傷的一種酶類，可通過催化·發(fā)生反應(yīng)生成H2O2和分子氧，在隨后的反應(yīng)中，H2O2在CAT等物質(zhì)的作用下轉(zhuǎn)變?yōu)樗头肿友鮗20]。

2.4 拮抗菌處理對(duì)葡萄果實(shí)CHI、GLU活性的影響

圖4 拮抗菌處理對(duì)葡萄采后CHI（A）和GLU（B）活性的影響Fig.4 Effect of antagonist bacterial treatment on the activities of CHI (A) and GLU (B) in postharvest grape

由圖4A可知，拮抗菌處理的葡萄果實(shí)CHI活性顯著高于對(duì)照組，隨著貯藏期的延長(zhǎng)，對(duì)照組CHI活性快速下降，而處理組在第1天的CHI活性略有上升，形成了一個(gè)高峰而后下降。由圖4B可知，處理組和對(duì)照組在貯藏第1、2天和第4、5天時(shí)兩者GLU活性差別不太大，除第1天外處理組較對(duì)照組稍有增加。但是兩者區(qū)別明顯在于第3天，在第3天時(shí)對(duì)照組酶活達(dá)到最低點(diǎn)，而處理組酶活明顯升高，達(dá)到最高點(diǎn)，在該時(shí)間點(diǎn)處理組酶活是對(duì)照組的3 倍左右。

3 討 論

近年來國(guó)內(nèi)外對(duì)葡萄采后貯藏灰霉病的控制主要采用低溫結(jié)合SO2熏蒸，此技術(shù)雖效果顯著，應(yīng)用廣泛，但會(huì)產(chǎn)生病原微生物抗藥性增加、有害人體健康、環(huán)境污染等一系列問題[21]。在本研究中，經(jīng)洋蔥霍爾德氏菌發(fā)酵液浸泡后的玫瑰香葡萄貯藏后其果梗的霉變及果肉的腐爛率顯著低于對(duì)照，其中果梗腐爛率降低69.58%，果肉腐爛指數(shù)降低63.93%，說明此拮抗菌對(duì)葡萄果實(shí)具有很好的貯藏保鮮效果。在果蔬貯藏生物防治技術(shù)中，誘導(dǎo)抗性是其一個(gè)重要方面[22]，苯丙烷代謝活性增強(qiáng)是植物誘導(dǎo)抗性后的典型反應(yīng)，實(shí)驗(yàn)中經(jīng)拮抗菌處理的葡萄果實(shí)苯丙烷類代謝中第一關(guān)鍵酶PAL和末端酶POD、PPO均高于對(duì)照，其活性的增強(qiáng)了有利于木質(zhì)素、植保素、酚類等抗性物質(zhì)的生物合成，提高了植物對(duì)病原菌侵染的抵抗能力，這一結(jié)論與前人研究[23]一致。其次拮抗菌處理的玫瑰香果實(shí)活性氧代謝較為活躍，一般情況下，在動(dòng)植物細(xì)胞中活性氧的產(chǎn)生與清除均存在著一個(gè)動(dòng)態(tài)平衡[24]。實(shí)驗(yàn)中，和對(duì)照組相比，拮抗菌處理的葡萄果實(shí)在貯藏期的第1天其SOD活性快速上升而CAT活性顯著減少，該變化促使了H2O2在葡萄果實(shí)細(xì)胞中的積累。因此，在貯藏期的第1天，處理組果實(shí)細(xì)胞中H2O2含量較高。已有研究[25]證明，H2O2的快速積累在植物的抗病反應(yīng)中有著重要作用，它不僅具有直接的抗病原微生物功能，且其存在本身就可對(duì)病原菌產(chǎn)生傷害。而在貯藏后期處理組的CAT活性顯著高于對(duì)照組，使果肉中積累的過多H2O2得到清除，從而避免了果實(shí)內(nèi)活性氧過多而引起的機(jī)體損傷。另外本實(shí)驗(yàn)中處理組的CHI、GLU活性均高于對(duì)照，該結(jié)果與Yao Hongjie等[26]的研究結(jié)果符合，他們?cè)谘芯恐幸沧C實(shí)CHI和GLU活性的升高與果蔬在貯藏期間表現(xiàn)出的抗病性密切相關(guān)。綜上所述，拮抗菌（Burkholderia contaminans B-1）處理作為一種生物防治技術(shù)在葡萄采后貯藏中可顯著提高果實(shí)的抗病能力，達(dá)到防腐保鮮的目的。

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Induction of Disease Resistance against Botrytis cinerea in Postharvest Muscat Grape by Antagonistic Bacterium Burkholderia contaminans

FAN Sanhong1, LI Jing1, SHI Junfeng2
(1. College of Life Science, Shanxi University, Taiyuan 030006, China; 2. Institute of Agricultural Product Storage and Fresh Keeping, Shanxi Academy of Agricultural Sciences, Taiyuan 030031, China)

In this study, the mechanism by which the antagonistic bacterium Burkholderia contaminans B-1 induces resistance to Botrytis cinerea in postharvest Muscat grape berry was investigated. The results showed that B. contaminans B-1 reduced significantly the rot rate of postharvest grape berries. Compared with the control, the rot rates of the stem and fruit treated with B. contaminans were decreased by 69.58% and 63.93%, respectively. B. contaminans B-1 could affect the phenylpropanoid metabolic pathway, reactive oxygen species metabolic pathway, and the activities of resistance-related enzymes. Treatment with B. contaminans B-1 enhanced the activities of phenylalanine ammonia-lyase (PAL), peroxidase (POD), superoxide dismutase (SOD) and polyphenloxidase (PPO). B. contaminans B-1 also increased hydrogen peroxide (H2O2) content and delayed the peak time of catalase (CAT) activity, and enhanced the activities of resistance-related enzymes, chitinase (CHI) and β-1,3-glucanase (GLU), in grapes.

Muscat grape; biological control; induced disease resistance

10.7506/spkx1002-6630-201602047

Q939.92；TS255.3

A

1002-6630（2016）02-0266-05

范三紅, 李靜, 施俊鳳. 拮抗菌Burkholderia contaminans對(duì)玫瑰香葡萄采后灰霉病的抗性誘導(dǎo)[J]. 食品科學(xué), 2016, 37(2): 266-270. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201602047. http://www.spkx.net.cn

FAN Sanhong, LI Jing, SHI Junfeng. Induction of disease resistance against Botrytis cinerea in postharvest muscat grape by antagonistic bacterium Burkholderia contaminans[J]. Food Science, 2016, 37(2): 266-270. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201602047. http://www.spkx.net.cn

2015-07-09

山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院博士后基金項(xiàng)目（BSH-2015JJ-003）；山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院自主創(chuàng)新項(xiàng)目（2015ZZCX-16）；國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（31371868）

范三紅（1963—），男，副教授，碩士，研究方向?yàn)槭称房茖W(xué)。E-mail：fsh729@sxu.edu.cn