重慶煙區(qū)青枯雷爾氏菌生化變種及序列變種的特性研究

劉穎，唐元滿，張淑婷，郭兵，谷紀(jì)濤，丁偉,2

1 西南大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，重慶市北碚區(qū)天生路2號 400715；2 重慶煙草科學(xué)研究所，重慶市北碚區(qū)天生路2號 400715

生物技術(shù)

重慶煙區(qū)青枯雷爾氏菌生化變種及序列變種的特性研究

劉穎1，唐元滿1，張淑婷1，郭兵1，谷紀(jì)濤1，丁偉1,2

1 西南大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，重慶市北碚區(qū)天生路2號 400715；2 重慶煙草科學(xué)研究所，重慶市北碚區(qū)天生路2號 400715

為進(jìn)一步明確重慶煙區(qū)煙草青枯菌的遺傳及生化特性，采用生化變種分類標(biāo)準(zhǔn)及演化型復(fù)合PCR、系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化分析對重慶10個(gè)煙草青枯病發(fā)生區(qū)縣青枯雷爾氏菌的種下分化情況進(jìn)行了研究。結(jié)果表明：46株煙草青枯雷爾氏菌均屬于生化變種3和亞洲分支菌株（演化型Ⅰ）。內(nèi)切葡聚糖酶基因（egl）和DNA修復(fù)蛋白基因（mutS）部分序列的系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析表明：46株供試菌株可聚類到青枯雷爾氏菌演化型Ⅰ的3個(gè)序列變種，分別為序列變種15、17和44，其中序列變種17和44為優(yōu)勢菌株。表明重慶煙草青枯雷爾氏菌具有一定的遺傳分化和地理區(qū)域特性。

煙草青枯菌；生化變種；演化型；系統(tǒng)進(jìn)化分析；內(nèi)切葡聚糖酶基因；DNA修復(fù)蛋白基因

煙草青枯病是由青枯雷爾氏菌（Ralstonia solanacearum；以下簡稱青枯菌）引起的一種細(xì)菌性病害[1]。青枯菌廣泛分布于熱帶、亞熱帶及溫帶地區(qū)，能侵染54個(gè)科450余種植物[2]。煙草青枯病在我國許多煙區(qū)，如福建、湖南、云南、貴州、四川、湖北、重慶等地普遍發(fā)生[3-4]。近年來，由于環(huán)境、氣候、種植結(jié)構(gòu)調(diào)整等方面的原因，該病的危害范圍有逐漸向北和冷涼地區(qū)擴(kuò)展蔓延之勢[4]。

青枯菌因其寄主范圍、地理分布、致病性以及生理特性的多樣性和復(fù)雜性而被公認(rèn)為是多變的復(fù)合種（species complex）[5]。根據(jù)傳統(tǒng)的分類框架青枯菌可分為不同的生理小種（race）和生化變種（biovar），生理小種是依據(jù)不同菌株對不同植物種類的致病性差異來劃分的，而生化變種則是根據(jù)其利用3種雙糖和3種己醇的能力差異來分類的[6-9]。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的廣泛應(yīng)用，F(xiàn)egan和Prior（2005年）共同提出了以演化型分類框架來描述青枯菌種以下的差異，該分類框架依次將青枯菌劃分為種(Species)、演化型(Phylotype)、序列變種(Sequevar)以及克隆(Clone)4種不同水平的分類單元，并分別建立了與之相對應(yīng)的鑒定方法[10]。

青枯菌的種水平鑒定采用以lpxC基因?yàn)榘袠?biāo)的引物對759/760；演化型(Phylotype)為亞種水平，分為演化型Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ，可由基于ITS區(qū)域的演化型特異性復(fù)合PCR(Phylotype speci fi c multiplex PCR，Pmx-PCR)鑒定；每個(gè)演化型則又是由多個(gè)序列變種(Sequevar)組成的，一個(gè)序列變種可作為一組在特定基因范圍內(nèi)序列高度保守的菌株集合體，目前用于界定序列變種的基因包括內(nèi)切葡聚糖酶基因(Endoglucanase,egl)、Ⅲ型分泌系統(tǒng)調(diào)節(jié)基因(hrpB)和一個(gè)編碼錯(cuò)配糾正蛋白的基因(mutS)等[11]。演化型分類框架與傳統(tǒng)的生理小種及生化變種分類方法相比可以更精確地反映青枯菌這一復(fù)合種的地理起源及種內(nèi)的遺傳多樣性。

重慶是我國主要的植煙區(qū)，煙草種植分布在武陵山區(qū)和大巴山區(qū)的黔江、石柱、彭水、酉陽、武隆、南川、涪陵、豐都、萬州、巫溪、巫山、奉節(jié)等12個(gè)區(qū)縣，除巫山和奉節(jié)外，其余10個(gè)區(qū)縣均有青枯病發(fā)生。本研究分別采用生化變種和演化型分類框架對重慶煙草青枯菌群體進(jìn)行種下分類研究，旨在了解重慶煙區(qū)煙草青枯菌的遺傳及生化特性，解釋該地區(qū)的青枯菌生態(tài)多樣性，揭示煙草青枯菌在地理環(huán)境、生態(tài)條件以及種植結(jié)構(gòu)影響下的多樣性分化情況，為有針對性的控制病害提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 青枯菌株的分離及DNA的提取

供試煙草青枯病菌株由西南大學(xué)天然產(chǎn)物農(nóng)藥研究實(shí)驗(yàn)室2013年以及2015年在重慶地區(qū)采集分離，分別采自黔江、石柱、彭水、酉陽、武隆、南川、涪陵、豐都、萬州、巫溪，共46株，供試菌株信息見表1。應(yīng)用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒（TIANGEN,DP302）提取菌株DNA，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 生化變種鑒定

供試菌株生化變種測定參照Hayward的方法[7]?；九囵B(yǎng)基包括：NH4H2PO4， 1.0 g·L-1； KCl， 0.2 g·L-1；MgSO4·7H2O， 0.2 g·L-1；蛋白胨， 1.0 g·L-1；溴百里酚藍(lán)， 0.03 g·L-1；瓊脂， 1.5 g·L-1（最終用1M NaOH調(diào)節(jié)pH值到7.1）。分別將3種雙糖（乳糖、麥芽糖和纖維二糖）和3種己醇（甘露醇、山梨醇和甜醇）配成10%的溶液，滅菌（3種雙糖用過濾法滅菌，3種己醇經(jīng)121℃蒸氣滅菌）后分別加入基本培養(yǎng)基中，使其終濃度為1%。按實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)將含不同碳水化合物的培養(yǎng)基垂直分布于96孔板上前6孔，不含碳水化合物的培養(yǎng)基作為對照放于垂直的第7、8孔[12]。取200 μL培養(yǎng)基注入每個(gè)孔中，每孔接種青枯菌菌懸液5 μL（菌懸液濃度約2 × 109CFU·mL-1），第8孔作為對照不接種，置30℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)21 d。根據(jù)供試菌株對3種雙糖和3種己醇的利用情況，即培養(yǎng)基的顏色變化，確定各菌株的生化變種分類歸屬。

表1 供試煙草菌株相關(guān)信息Tab.1 Tobacco Ralstonia solanacearum strains used in the study

續(xù)表1

1.3 演化型鑒定

根據(jù)演化型分類框架所設(shè)計(jì)的復(fù)合PCR引物對青枯菌菌株進(jìn)行了演化型鑒定[9]。PCR擴(kuò)增采用25 μL反應(yīng)體系：2×Taq PCR MasterMix（TIANGEN,KT201）、 引 物 Nmult:21:1F，Nmult:21:2F和 Nmult:22:InF各 6 pmoles，Nmult:23:AF和Nmult:22:RR 各 18 pmoles，759/760各 4 pmoles， 青枯菌DNA，ddH2O。反應(yīng)程序?yàn)?6℃預(yù)變性5 min；94℃變性15 s，59℃退火30 s和72℃延伸30 s，30個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10 min ，4℃保存。取5 μL PCR產(chǎn)物于1%的瓊脂糖凝膠中電泳，電壓4 V/cm，通過Biorad凝膠成像儀觀察結(jié)果。實(shí)驗(yàn)所用引物均由華大基因科技股份有限公司合成，引物序列見表2。

表2 用于遺傳多樣性分析的引物序列Tab.2 The primers used for genetic diversity analysis

1.4 部分egl基因擴(kuò)增

用引物Endo-F和Endo-R（表2）擴(kuò)增內(nèi)源葡聚糖酶基因（egl）內(nèi)部的750 bp片段。egl基因擴(kuò)增PCR反應(yīng)體系（25 μl）：2×Taq PCR MasterMix（TIANGEN, KT201），青枯菌DNA 50 ng，引物Endo-F和Endo-R各10 pmoles，ddH2O補(bǔ)足。egl擴(kuò)增的PCR反應(yīng)程序?yàn)?6℃預(yù)變性9 min；95℃變性1min，64℃退火1 min，72℃延伸2 min，30個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10 min ，4℃保存。將PCR產(chǎn)物送華大基因科技股份有限公司測序。

1.5 部分mutS基因擴(kuò)增

用引物mutS-RsF.1570和mutS-RsR.1926（表2）擴(kuò)增DNA蛋白修復(fù)基因mutS，其擴(kuò)增PCR反應(yīng)體系（25 μL）：2×Taq PCR MasterMix （TIANGEN,KT201），青枯菌DNA 50 ng，引物mutS-RsF.1570和 mutS-RsR.1926各10 pmoles，ddH2O補(bǔ) 足。PCR反應(yīng)程序?yàn)?6℃預(yù)變性5 min；94℃變性1 min，66℃退火1 min，72℃延伸90 s，35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸5 min，4℃保存。將PCR產(chǎn)物送華大基因科技股份有限公司測序。

1.6 序列分析

將所測得的供試青枯菌株egl和mutS基因序列與GenBank上已登錄的青枯菌核酸序列進(jìn)行比對（參考序列信息見表3），構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。698 bp的egl基因和682 bp的mutS基因的測序結(jié)果用Clustal x軟件比對后，再用MEGA 5軟件進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，采用Jukes and Cantor模型鄰接法(neighbor-joining，NJ)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，1000次重復(fù)取樣作出Bootstrap樹狀圖。序列之間的遺傳距離用Kimura-2-parameter方法計(jì)算。并將所有的序列提交到GenBank數(shù)據(jù)庫中。

表3 參考序列信息Tab.3 Reference strains used for sequence analysis

續(xù)表3

2 結(jié)果與分析

2.1 生化變種鑒定結(jié)果

測定了46株供試菌株對乳糖、麥芽糖、纖維二糖和甘露醇、山梨醇、甜醇的利用能力（圖1）。結(jié)果表明，所有的供試菌株均能利用3種雙糖和3種己醇，參照生化變種劃分標(biāo)準(zhǔn)，重慶地區(qū)的煙草青枯菌均屬于生化變種3（表1）。

圖1 部分菌株生化變種結(jié)果展示Fig.1 Results of biovar test of R. solanacearum

2.2 Pmx-PCR的演化型鑒定結(jié)果

供試菌株演化型特異性復(fù)合PCR結(jié)果表明，所有菌株均可同時(shí)擴(kuò)增得到144 bp和281 bp的2條特異性片段，其中281 bp的片段為青枯菌種特異性擴(kuò)增條帶，144 bp的片段為演化型Ⅰ的特異性擴(kuò)增條帶。從而在種和演化型分類單元水平上，揭示出供試菌株屬于青枯菌演化型Ⅰ型，即亞洲分支菌株。

2.3 egl基因分析

對供試菌株的egl基因部分序列（698 bp）進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，并從GenBank 上選取32個(gè)菌株的egl基因的序列（表3）來確定供試菌株在系統(tǒng)發(fā)育結(jié)構(gòu)中的位置。由系統(tǒng)發(fā)育分析知，青枯菌被分為4個(gè)分支，即4個(gè)演化型分支，而我國煙草青枯菌均被聚類到演化型Ⅰ型分支中（圖2），這與Pmx-PCR的鑒定結(jié)果一致。

供試46株菌株被聚類在演化型Ⅰ型之下的3個(gè)分支中，它們分別與序列變種15、17和44對應(yīng)（圖2）。其中，序列變種15的參考菌株為中國番茄菌株P(guān)SS358，僅包含了2株菌，分別是酉陽的CQYY1和萬州的CQWZ2。序列變種17以分離自中國花生的P11為參考菌株，包含18株供試菌，分別為彭水的CQPS1、CQPS2、CQPS3、CQPS4，酉陽的 CQYY2， 武 隆 的 CQWL2、CQWL3、CQWL4、CQWL6，豐都的CQFD1、CQFD2，黔江的CQQJ4、CQQJ9、CQQJ10、CQQJ11， 石 柱 的 CQSZ-3、CQSZ-4，以及萬州的CQWZ1。而序列變種44包含了2個(gè)小分支，1個(gè)分支以中國煙草青枯菌Tb28和Tb43為參考菌株，共9株菌，其中酉陽2株（CQYY5、CQYY6）、黔江 7株（CQQJ1、CQQJ2、CQQJ3、CQQJ6、CQQJ7、CQQJ8、CQQJ12）；1個(gè)分支以中國木槿菌株Bd11為參考菌株，共有17株，其中彭水2株（CQPS5、CQPS6）、酉陽2株（CQYY3、CQYY4）、 武 隆 3株（CQWL1、CQWL5、CQWL7）、 南 川 2株（CQNC2、CQNC2）、 涪陵 2株（CQFL1、CQFL2）、黔江3株（CQQJ5、CQQJ13、CQQJ14）、石柱2株（CQSZ-1、CQSZ-2）以及巫溪1株（CQWX-1）。

2.4 mutS基因分析

對供試菌株的mutS基因部分序列（682 bp）進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，并從GenBank 上選取27個(gè)菌株的mutS基因的序列（表2）作為參考序列進(jìn)行比較。由系統(tǒng)發(fā)育分析可知，所有的供試菌株可聚到2個(gè)分支中，如圖3所示，第一分支與egl基因的系統(tǒng)發(fā)育圖中的序列變種44分支對應(yīng)。第二分支則與egl基因的系統(tǒng)發(fā)育圖的序列變種15和17對應(yīng)。

圖2 基于egl基因部分序列的系統(tǒng)發(fā)育分析Fig.2 Phylogenetic neighbor-joining tree based on partial sequences of the egl gene

圖3 基于mutS基因部分序列的系統(tǒng)發(fā)育分析Fig.3 Phylogenetic neighbor-joining tree based on partial sequences of the mutS gene

3 結(jié)論與討論

青枯菌受不同的環(huán)境、寄主植物和各種農(nóng)藝操作的影響，自身不斷進(jìn)化，形成了一個(gè)復(fù)合種[14]。Fegan和Prior所提出的演化型分類框架表明青枯菌的種下分化與地理起源密切相關(guān)[10]。在分析美國東南部的青枯菌多樣性時(shí)，分離自北卡羅來納州和佐治亞州的煙草青枯菌均屬于生化變種1和演化型Ⅱ（美洲分支）[15]。Wang等在研究中指出中國煙草青枯菌屬于生化變種3[16]。對我國青枯菌遺傳多樣性分析中9株分離自煙草的菌屬于演化型Ⅰ[17]。福建煙草青枯菌被鑒定出均屬于演化型Ⅰ[18]?？傮w來看，我國的煙草青枯菌屬于演化型Ⅰ（亞洲分支），與美國的煙草青枯菌（演化型Ⅱ即美洲分支）屬于不同的地理起源。Wicker等利用多位點(diǎn)序列分析（multilocus sequence analysis, MLSA）追溯了世界范圍內(nèi)的青枯菌的進(jìn)化歷史，發(fā)現(xiàn)該世系中存在21個(gè)重組事件，而演化型Ⅰ是多態(tài)性持續(xù)發(fā)展的分支之一[19]。重慶地區(qū)種下分化情況也屬于生化變種3及演化型Ⅰ,并在序列變種上存在分化。

重慶12個(gè)煙草種植區(qū)縣中，除巫溪、巫山和奉節(jié)地處大巴山區(qū)外，其余9個(gè)區(qū)縣均處于武陵山區(qū)。其中，巫山、奉節(jié)目前尚未發(fā)現(xiàn)青枯病，巫溪縣有零星發(fā)生，而另外的9個(gè)區(qū)縣均發(fā)生青枯病，且較嚴(yán)重。巫山和奉節(jié)所種植的煙草品種與重慶其他植煙地并無差異。同時(shí)，本研究的結(jié)果未發(fā)現(xiàn)青枯菌序列變種分化與煙草品種有直接關(guān)系，由此推測，煙草品種可能不是青枯菌種下分化的直接原因。而武陵山區(qū)與大巴山區(qū)的氣候、土壤條件等地理區(qū)域因子存在明顯差異。鄂西煙區(qū)也大多屬于武陵山區(qū)。劉海龍等對湖北地區(qū)煙草青枯菌系統(tǒng)發(fā)育分析的結(jié)果表明，湖北煙草青枯菌菌株屬于青枯菌亞洲分支（演化型Ⅰ）的3個(gè)序列變種，分別為序列變種15、17和44，其優(yōu)勢菌株也為序列變種17和44[20]。本研究結(jié)果與這個(gè)結(jié)果基本一致。福建和貴州的煙草青枯菌系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果證實(shí)，福建的煙草青枯菌菌株包含序列變種15、17、34和44，而貴州的供試菌株僅被聚到序列變種17分支中[21]。比起重慶、湖北及靠近武陵山區(qū)的貴州，距離較遠(yuǎn)的福建省所分離的煙草青枯菌菌株除序列變種15、17和44外還存在序列變種34。而其他地區(qū)是否存在異同還需進(jìn)一步驗(yàn)證，因此，對于全國煙草青枯菌分化情況的全面評估是很有必要的。青枯菌與寄主協(xié)同進(jìn)化過程中，地域分布是否是其種內(nèi)遺傳分化的主要驅(qū)動力，尚有待于大尺度范圍內(nèi)進(jìn)一步深入研究。

掌握各地?zé)煵萸嗫菥木唧w分化情況，對今后進(jìn)一步深入研究青枯菌的系統(tǒng)演化及防治措施具有重要意義。本研究分析了重慶地區(qū)的煙草青枯菌生化變種、演化型及系統(tǒng)發(fā)育情況，證實(shí)重慶地區(qū)46株供試菌株均屬于生化變種3和演化型Ⅰ；系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化分析結(jié)果表明重慶煙草青枯菌可聚類到3個(gè)序列變種（序列變種15、17和44）中。為進(jìn)一步研究影響青枯菌分化的關(guān)鍵因子及其遺傳多樣性機(jī)制提供了相應(yīng)的依據(jù)。

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Biovar and sequevar ofRalstonia solanacearumin tobacco growing areas in Chongqing

LIU Ying1, TANG Yuanman1, ZHANG Shuting1, GUO Bing1, GU Jitao1, DING Wei1,2
1 College of Plant Protection, Southwest University, Chongqing 400715, China;2 Chongqing Tobacco Research Institute, Chongqing 400715, China

46 isolates were assessed to explore the diversity of tobaccoRalstonia solanacearumin Chongqing by using biovar, phylotype speci fi c multiplex PCR, and phylogenetic relationships (eglandmutS). Results showed that all tested isolates belonged to biovar 3 and phylotype I. The phylogenetic neighbor-joining tree based on partial sequences ofeglandmutSgenes indicated that the tested isolates were clustered into phylotype I, and were further divided into 3 sequevars, namely sequevars 15, 17, and 44. Sequevar 17 and 44 were predominant.R.solanacearumstrains on tobacco showed genetic differentiation to some extent, which provided basis for studying relationship between classi fi cation and geographic areas.

tobacco;Ralstoniasolanacearum; biovar; phylogenetic analysis;egl;mutS

劉穎，唐元滿，張淑婷，等. 重慶煙區(qū)青枯雷爾氏菌生化變種及序列變種的特性研究[J]. 中國煙草學(xué)報(bào)，2016,22（4）

中國煙草總公司重點(diǎn)項(xiàng)目(110201202002)；中國煙草總公司重慶市公司重點(diǎn)項(xiàng)目(NY20130501070005)

劉穎（1991—），碩士研究生，研究方向：天然產(chǎn)物農(nóng)藥及植物與病原菌互作， Email: lyying1201@163.com

丁偉（1966—），博士，教授，研究方向：天然產(chǎn)物農(nóng)藥和煙草有害生物系統(tǒng)控制，Email: dwing818@163.com

2015-12-11

:LIU Ying, TANG Yuanman, ZHANG Shuting, et al. Biovar and sequevar ofRalstoniasolanacearumin tobacco growing areas in Chongqing [J]. Acta Tabacaria Sinica, 2016,22(4)