金 露,李一帆,何 韜,胡 佳,劉家駒,桂耀庭,楊尚琪,毛向明,來永慶
長鏈非編碼RNA PANDAR在腎癌中的表達(dá)分析及臨床意義
金 露1,2,3,李一帆1,2,3,何 韜2,3,胡 佳2,3,劉家駒2,3,桂耀庭2,3,楊尚琪2,3,毛向明2,3,來永慶2,3
目的 檢測長鏈非編碼RNA PANDAR在腎癌及癌旁組織中的表達(dá)水平,探討其在腎癌中的臨床意義。方法 提取48對組織(腎癌及對應(yīng)癌旁組織)中的總RNA,經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA后通過實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(qRTPCR)方法檢測PANDAR表達(dá)量,分析正常組織與腎癌組織中的表達(dá)差異,探討其表達(dá)水平與患者臨床特征之間的聯(lián)系。結(jié)果 腎癌組織中PANDAR的表達(dá)水平明顯低于配對癌旁正常組織(P<0.001),標(biāo)本中共有38例(79.17%)腎癌標(biāo)本PANDAR表達(dá)下調(diào),癌組織中PANDAR表達(dá)與患者TNM分期和AJCC分級相關(guān),與患者年齡、性別及腎癌病理類型無明顯相關(guān)性(P>0.05),PANDAR低表達(dá)組患者生存率低于高表達(dá)組患者(P<0.05)。結(jié)論 PANDAR在腎癌組織中表達(dá)明顯下調(diào),且和腎癌TNM、AJCC分級和預(yù)后相關(guān),提示其有作為腎癌標(biāo)志物應(yīng)用于臨床的可能。
腎癌;腫瘤分期;長鏈非編碼RNA;PANDAR
腎細(xì)胞癌(renal cell carcinoma,RCC)又稱腎癌,是泌尿系統(tǒng)常見的惡性腫瘤,約占成人惡性腫瘤的3%[1]。腎癌對放療和化療均不敏感,手術(shù)切除是主要的治療方式,但術(shù)后復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移率極高[2]。目前在臨床尚無可用于腎癌早期診斷或治療的生物標(biāo)志物,因此有必要對腎癌的發(fā)生機(jī)制進(jìn)行深入研究,以期找到相關(guān)腎癌標(biāo)志物。近年來,長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA,lncRNA)引起了人們的廣泛關(guān)注。lncRNA是一類不具有蛋白質(zhì)編碼功能的RNA,長度在200個核苷酸以上,一般低于20 000個核苷酸[3]?;蚪M學(xué)的研究[4]表明,哺乳動物的基因可以轉(zhuǎn)錄出大量不具有蛋白編碼功能的RNA,有生物活性并在多種疾病中存在異常表達(dá)。另外,LncRNA可在轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達(dá)[5]。該研究選擇lncRNA PANDAR(promoter of CDKN1A antisense DNA damage activated RNA)作為研究對象,探討其在腎癌中的臨床意義。
1.1 組織標(biāo)本 選取安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院和北京大學(xué)深圳醫(yī)院手術(shù)切除的48對腎癌組織及配對癌旁組織,標(biāo)本均得到醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)且患者已簽署知情同意書。每對標(biāo)本包括腎癌組織及癌旁正常組織(取自根治性腎切除術(shù)距腎癌組織>2 cm的腎組織)各1份,病理切片證實腎癌組織含癌組織80%以上,癌旁組織中無癌組織侵犯。標(biāo)本切除后保存于-80℃冰箱中備用。患者臨床資料完整(表1),術(shù)后均進(jìn)行了常規(guī)隨訪。腎癌臨床分期參考國際抗癌組織(UICC)/美國癌癥聯(lián)合會(AJCC)2010年腎癌分期。
1.2 RNA提取 在液氮下碾磨標(biāo)本組織,加入TRIzol試劑(美國Invitrogen公司),說明書所述提取腎癌標(biāo)本組織中的總RNA,使用ND-2000/2000c紫外分光光度計測定其濃度,提取后的總RNA保存于-80℃冰箱。
1.3 逆轉(zhuǎn)錄 根據(jù)RNA反轉(zhuǎn)錄試劑PrimeScriptTMRT reagent Kit(日本TaKaRa公司)說明書所述,取1 μg總RNA,加入反應(yīng)試劑,使用普通PCR儀完成逆轉(zhuǎn)錄。反應(yīng)條件:42℃ 15 min,之后85℃ 5 s。產(chǎn)物稀釋10倍后保存于-80℃。
1.4 實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(real-time quantitative polymerase chain reaction,qRT-PCR)檢測PANDAR表達(dá)量 根據(jù)熒光定量PCR試劑SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ(日本TaKaRa公司)說明書所述,以合成的cDNA為模板,加入反應(yīng)試劑進(jìn)行qPCR反應(yīng)。反應(yīng)體系包括:模板cDNA 1 μl,2* SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ10 μl,PANDAR正向引物1 μl,PANDAR反向引物1 μl,加無菌蒸餾水至總反應(yīng)體積20 μl。PANDAR F:5'-CAATGCCTTGCTTCACAGTC-3',R:5'-TGGGGTTCTTAGAAGTGGTGA-3';內(nèi)參選用GAPDH基因,GAPDH F:5'-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3', R: 5'-GAAGATGGTGGGATTTC-3'。qPCR反應(yīng)條件:95℃ 2 min預(yù)變性;之后95℃ 5 s,60℃30 s,然后70℃ 30 s,共計完成45個循環(huán)。
1.5 統(tǒng)計學(xué)處理 PANDAR相對表達(dá)量采用ΔΔCt法分析,以GAPDH為內(nèi)參進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理:ΔCt= CtPANDAR-CtGAPDH,ΔΔCt=ΔCtRCC-ΔCtNormal。通過2-ΔΔCt計算PANDAR在腎癌組織與癌旁正常組織表達(dá)量比值,使用SPSS 17.0完成統(tǒng)計分析。采用配對t檢驗分析配對組織間PANDAR表達(dá)量的差異;將患者按PANDAR表達(dá)水平及臨床特征分組列出四格表,采用χ2檢驗分析;采用Kaplan-Meier法和Log-rank檢驗比較兩組患者生存率差異;P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
2.1 PANDAR在腎癌組織中表達(dá)下調(diào) 48對腎癌組織中共有38例腎癌標(biāo)本表達(dá)量低于配對癌旁組織,腎癌組織與配對癌旁組織中PANDAR表達(dá)量比值經(jīng)對數(shù)轉(zhuǎn)換后如圖1所示,縱坐標(biāo)為 log2Ratio (T/N),橫坐標(biāo)以下表示腎癌組織表達(dá)量低于配對癌旁組織;腎癌組織中PANDAR表達(dá)量明顯低于癌旁正常組織(t=-4.016,P<0.001),癌旁正常組織中PANDAR表達(dá)量是腎癌組織的2.42±0.25倍。
2.2 PANDAR的表達(dá)水平和患者臨床分期、分級相關(guān) 以腎癌組織中PANDAR的-ΔΔCT平均值-1.27為界將患者分為高表達(dá)組、低表達(dá)組,其中低表達(dá)組26例;根據(jù)患者年齡中位數(shù)將患者分為高齡組、低齡組。列出四格表,行 χ2檢驗,結(jié)果顯示PANDAR表達(dá)水平和患者年齡、性別以及腎癌組織類型無關(guān),在TNM分期和AJCC分級較高的患者PANDAR表達(dá)水平更低(P<0.05)。見表1。
圖1 標(biāo)本組織中PANDAR的表達(dá)
圖2 PANDAR低表達(dá)組和高表達(dá)組患者生存率比較
2.3 PANDAR低表達(dá)的患者預(yù)后較差 納入研究的患者均進(jìn)行了常規(guī)隨訪,隨訪期內(nèi)死亡18例(37.5%)。將患者分為高表達(dá)組、低表達(dá)組,采用Kaplan-Meier法和Log-rank檢驗比較兩組患者生存率,生存曲線見圖2,PANDAR低表達(dá)組患者的中位生存時間為58個月,低表達(dá)組5年生存率(42.31%)明顯低于高表達(dá)組(72.73%)(P<0.05)。
腎癌是預(yù)后較差的一種腫瘤,已經(jīng)發(fā)生轉(zhuǎn)移的腎癌患者五年生存率約為10%[6],早期診斷對于提高其預(yù)后有很大的幫助,因此有必要尋找可用于腎癌早期診斷的生物標(biāo)志物。雖然截至目前只發(fā)現(xiàn)了少數(shù)有功能的lncRNA,但綜合現(xiàn)有研究可以發(fā)現(xiàn)lncRNA和一系列的生物進(jìn)程相關(guān),如癌基因的激活、X染色體失活、劑量失活效應(yīng)、基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯、蛋白質(zhì)的活性調(diào)控等[5]。因此,lncRNA在基因調(diào)節(jié)中發(fā)揮著重要作用。
表1 PANDAR表達(dá)水平和腎癌臨床分期、分級相關(guān)
目前關(guān)于lncRNA PANDAR在腫瘤中的相關(guān)研究較少,只在肝細(xì)胞癌、非小細(xì)胞肺癌中有相關(guān)報道,且lncRNA PANDAR表達(dá)水平均和患者預(yù)后相關(guān)[7-8]。在腎細(xì)胞癌中尚無關(guān)于lncRNA PANDAR的研究,本研究首次在腎細(xì)胞癌組織中利用qPCR檢測PANDAR的表達(dá)。現(xiàn)有關(guān)于PANDAR的研究[7-8]主要在非小細(xì)胞肺癌和肝細(xì)胞癌。研究[8]顯示,在非小細(xì)胞肺癌組織中PANDAR表達(dá)下調(diào),且表達(dá)量和腫瘤分期、腫瘤體積以及患者預(yù)后相關(guān)。在非小細(xì)胞癌細(xì)胞中,PANDAR可通過調(diào)節(jié)Bcl-2的表達(dá)影響細(xì)胞凋亡。在肝細(xì)胞癌中,PANDAR表達(dá)上調(diào)且表達(dá)水平和患者預(yù)后、TNM分級相關(guān),且在肝癌細(xì)胞中敲除PANDAR可抑制癌細(xì)胞的增殖[7]。本研究首次利用qPCR在腎癌及配對癌旁組織中檢測了lncRNA PANDAR的表達(dá),發(fā)現(xiàn)PANDAR在腎癌組織中表達(dá)明顯下調(diào)。且PANDAR在腎癌中的表達(dá)和腎癌TNM分期、AJCC分級相關(guān),PANDAR低表達(dá)組患者生存率低于高表達(dá)組患者,提示PANDAR與腎癌患者預(yù)后相關(guān),在腎癌的發(fā)生發(fā)展中起著一定的作用,有作為腎癌生物標(biāo)志物應(yīng)用于腎癌診斷、判斷預(yù)后及治療的可能性。但本研究病例數(shù)偏少,其所致偏倚不能排除,下一步的研究目標(biāo)將是擴(kuò)大樣本量驗證PANDAR的表達(dá),并對PANDAR在腎癌組織細(xì)胞中的功能、機(jī)制進(jìn)行研究。
目前在腎癌中關(guān)于lncRNA的研究較少,已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在腎癌細(xì)胞中具有功能的lncRNA有GAS5、MEG3、MALAT1、RCCRT1、HOTAIR[9-14],其中高表達(dá)的MALAT1、RCCRT1發(fā)揮著促癌基因的作用,低表達(dá)的MEG3、GAS5則發(fā)揮著抑癌基因的作用。另外,研究[13]表明RCCRT1的表達(dá)水平和腫瘤大小、TNM分級以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)量相關(guān)。因此lncRNA的異常表達(dá)和腎癌的發(fā)生以及進(jìn)展存在著一定的關(guān)系。
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Expression and clinical significance
of long non-coding RNA PANDAR in renal cell carcinoma
Jin Lu1,2,3,Li Yifan1,2,3,He Tao2,3,et al
(1The Second Clinical Medical College,Anhui Medical University,Hefei 230032;
2Dept of Urology,Peking University Shenzhen Hospital,Shenzhen 518036;3Guangdong and
Shenzhen Key Laboratory of Male Reproductive Medicine and Genetics,Shenzhen 518036)
Objective To detect the expression level of long non-coding RNA(lncRNA)PANDAR in paired renal cell carcinoma(RCC)and normal tissues and explore PANDAR's clinical significance in renal cell carcinoma. Methods Total RNA was isolated from 48 paired tissues,and the total RNA was used to get cDNA by performing reverse transcription.Then real time quantitative PCR(RT-qPCR)was performed to detect the expression of PANDAR.Statistical analysis was performed to explore the differences of PANDAR's expression level and the relationships between the expression of PANDAR and clinical characteristics.Results The expression level of lncRNA PANDAR was significantly lower in RCC tissues(P<0.001)than paired normal tissues and PANDAR was downregulated in 38(79.17%)RCC tissues.The results showed that the expression of PANDAR was associated with the TNM and AJCC stage.However,no relationships were found between the expression of PANDAR and patients'age,sex and pathological types of RCC.Overall survival rate of patients with lower expression of PANDAR was significantly lower than patients with higher expression of PANDAR(P<0.05).Conclusion In RCC tissues PANDAR is down-regulated,and the expression of PANDAR is associated with prognosis,TNM and AJCC stage of RCC,which indicates that it may be involved in the tumorigenesis and development of RCC.
renal cell carcinoma;neoplasm staging;lncRNAs;PANDAR
R 737.11
A
1000-1492(2016)09-1342-04
時間:2016-8-1 14:07
http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20160801.1407.048.html
2016-05-04接收
國家自然科學(xué)基金(編號:81101922);深圳市科技研發(fā)資 金知識創(chuàng)新計劃基礎(chǔ)研究項目 (編號:JCYJ20150403091443304);廣東省重點醫(yī)學(xué)??平?jīng)費(fèi)
1安徽醫(yī)科大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院,合肥 2300322北京大學(xué)深圳醫(yī)院泌尿外科,深圳 5180363廣東省男性生殖與遺傳重點實驗室,深圳 518036
金 露,男,碩士研究生; 來永慶,男,副教授,主任醫(yī)師,碩士生導(dǎo)師,責(zé)任作者,E- mail:yqlord@163.com