李　智，張七斤，安維雪，涂明亮，張志丹，李　娜，仲　亮

（內蒙古農業(yè)大學獸醫(yī)學院，內蒙古呼和浩特　010018）

羊口瘡疫苗對兔體液免疫和細胞免疫的影響

李智，張七斤，安維雪，涂明亮，張志丹，李娜，仲亮

（內蒙古農業(yè)大學獸醫(yī)學院，內蒙古呼和浩特010018）

為深入研究羊口瘡疫苗誘導機體產生免疫效應的分子機理，用羊口瘡疫苗免疫兔，并對其血清中的特異性抗體水平和外周血免疫相關細胞因子的表達水平進行研究。將500 mL滅活的羊口瘡病毒感染細胞毒液和經超聲波破碎的滅活羊口瘡病毒感染細胞毒液分別濃縮至100 mL，按照佐劑說明書比例，分別與弗氏佐劑、201VG、1313VG、GEL01、11R VG混勻。另外，取滅活的羊口瘡痂皮毒液10 mL與201 VG混勻，制備成疫苗。用所制備的不同佐劑疫苗各免疫2只兔子。在免疫后不同時間采集外周血，應用瓊脂免疫擴散方法檢測血清中特異性抗體效價，同時應用實時熒光定量PCR方法檢測外周血中細胞因子表達水平。結果顯示：在兔子接種羊口瘡疫苗后期，血清中抗體效價除了“1313VG+未破碎病毒”組為1:8之外，其他組別的抗體效價均達到1:16或 1:32；各組別外周血中Th1型細胞因子（IL-2 、IFN-?、TNF-α）的表達量與對照組相比總體上升，而Th2型細胞因子（IL-4、IL-6）的表達量總體呈下降趨勢。結果表明，羊口瘡疫苗可以同時誘導機體產生細胞免疫應答和體液免疫應答，但對該兩種免疫應答的誘導水平不同。

羊口瘡疫苗；體液免疫；細胞免疫；特異性抗體；細胞因子；佐劑

羊傳染性膿皰（Contagious Ecthyma，CE）又稱羊口瘡（ORF），是由羊口瘡病毒（ORF virus，ORFV）引起的山羊和綿羊的一種急性、接觸性傳染病，人和其他動物也可感染［1］。近年來，隨著我國養(yǎng)羊業(yè)的快速發(fā)展，羊口瘡引起的經濟損失越來越嚴重。目前還沒有治療羊口瘡的特效藥。由于羊口瘡病毒免疫的特殊性和其他一些原因，至今為止尚未研制成功安全、高效的羊口瘡病毒疫苗。目前預防羊口瘡的弱毒疫苗存在毒力返強等缺點［2］。除此之外，人們對羊口瘡疫苗的免疫應答機理尚不十分清楚。為了降低羊口瘡帶來的經濟損失，研究羊口瘡病毒的免疫應答機理和研制免疫效果良好的羊口瘡疫苗十分必要。

本研究根據(jù)瓊脂免疫擴散試驗具有的簡便、快捷、低廉等特點，將其用于特異性抗體檢測；利用實時熒光定量PCR具有的重復性好、特異性強、敏感性高等特點，將其用于mRNA檢測［3］。通過檢測兔外周血中特異性抗體和上述幾種細胞因子的表達水平，為探究羊口瘡疫苗的免疫機制和研發(fā)新型羊口瘡疫苗提供有益的理論參考依據(jù)。

1　材料與方法

1.1 病毒

羊口瘡病毒株，2015年由涂明亮分離到并命名為ORFV-Q株。通過病毒滴度測定，其TCID50為10-5.5/0.1 mL。毒株由內蒙古農業(yè)大學傳染病實驗室保存。

1.2 試驗動物

健康的26只成年雌性兔子購自呼和浩特市周邊某集約化養(yǎng)殖場。

1.3 主要試劑

弗氏完全佐劑和弗氏不完全佐劑，購自SIGMA公司；MONTANIDETMISA 201 VG、MONTANIDETMIMS 1313 N PR VG、MONTANIDETMGEL01、MONTANIDETMISA 11R VG，均由賽彼科公司饋贈；2×Easy Taq SuperMix，購自北京全式金生物技術有限公司；兔外周血淋巴細胞分離液試劑盒，購 自 Solarbio公 司；RNAiso Plus、PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser、SYBRRPremix Ex TaqTM， 均購自寶生物工程（大連）有限公司。

1.4 主要儀器

250D型數(shù)字式細胞粉碎儀，購自美國BRANSON公司；5417R型低溫高速離心機，購自德國Eppendorf公司；22331型PCR儀，購自德國Eppendorf公司；Syngene G:BOX凝膠成像儀，購自英國SYNGENE公司；恒溫水浴鍋，購自北京市長風儀器儀表公司；CFX? 96 Real-Time PCR儀，購自Bio-Rad公司。

1.5 引物設計及合成

根據(jù)GenBank 中IL-2、IL-4、IL-6、TNF-α和IFN-?基因的序列，分別在各基因的保守區(qū)設計特異性引物［4］。引物由生工生物工程（上海）有限公司合成（表1）。

表1　本實驗所用各引物序列及產物大小

1.6 疫苗的制備

取500 mL滅活的羊口瘡細胞毒液（用0.4%甲醛37 ℃滅活48 h，4 ℃保存，滅活病毒接種于羊睪丸細胞上觀察3～5 d無病變）和經超聲波破碎的500 mL滅活的羊口瘡細胞毒液，分別裝入透析袋內，包埋于PEG-6000濃縮至100 mL［5］。按照佐劑說明書比例，將濃縮后的病毒液分別與弗氏佐劑、201 VG、1313 N PR VG、GEL01、ISA 11R VG佐劑用研缽混合均勻；稱取病羊痂皮1 g，加入10 mL Hanks液研磨后凍融3次，離心后取上清，用甲醛同上述方法滅活后，與201 VG混合均勻。以上疫苗4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.7 動物免疫

用1.6制備的11種疫苗免疫兔子，每種疫苗免疫2只，共22只，空白對照4只。分群飼養(yǎng)，每間隔14～15 d免疫1次，共3次。免疫途徑為背部皮下分點注射和腹股溝皮下注射。免疫劑量為1 mL/只。其中弗氏佐劑組的一免為完全弗氏佐劑，二免為不完全弗氏佐劑，三免不加佐劑［6］。

1.8 血清抗體檢測

1.8.1 瓊脂板的制作。用0.15 mol/L PBS （pH7.2）配制1.0%瓊脂，制作厚度0.3～0.4 mm的平皿，待瓊脂凝固后打梅花孔，孔徑3～5 mm，孔間距4～7 mm，用針頭挑出孔內瓊脂，火焰封底，4 ℃?zhèn)溆茫?］。

1.8.2 瓊脂免疫擴散試驗。免疫后每隔7 d，從兔子耳緣靜脈采血后分離血清；在制作好的瓊脂板中央孔，用移液槍加滅活羊口瘡病毒液60 μL，在周圍孔加倍比稀釋血清60 μL，每個稀釋度加一孔；加樣完畢后，將瓊脂板放入濕盒內，置37 ℃中擴散24～36 h后，觀察結果并記錄。

1.9 細胞因子檢測

1.9.1 兔外周血淋巴細胞的分離。三免后10 d，從兔子耳緣靜脈采血2 mL（加肝素抗凝），加入淋巴細胞分離液混合，分離出淋巴細胞。

1.9.2 RNA提取與反轉錄。按照RNAiso Plus說明書提取淋巴細胞總RNA，并將總RNA按照PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser說明書反轉錄為cDNA，-20 ℃保存，用于常規(guī)PCR和熒光定量PCR。

1.9.3 普通PCR檢測細胞因子表達。以上述提取的cDNA為模板，用2×EasyTaq SuperMix試劑盒配制25 μL普通PCR反應體系：2×EasyTaq SuperMix 12.5 μL、上游引物（10 μM）1 μL、下游引物（10 μM）1 μL、cDNA模板1 μL、ddH2O 9.5 μL。PCR擴增反應條件為：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性30 s；59 ℃退火45 s；72 ℃延伸30 s；72 ℃延伸10 min。取5 μL上述PCR產物在3%瓊脂糖凝膠上電泳，電壓110 V，時間30 min，電泳結束后用紫外凝膠成像系統(tǒng)鑒定、拍照。

1.9.4 細胞因子熒光定量PCR及溶解曲線的繪制。20 μL PCR反應體系為：2×SYBR Premix Ex Taq 10 μL、上游引物（10 μM）0.5 μL、下游引物（10 μM）0.5 μL、cDNA模板2 μL、ddH2O 7 μL。 根據(jù)引物退火溫度，確定熒光定量PCR反應條件為：95 ℃ 30 s，95 ℃ 10 s，59 ℃ 30 s，72 ℃ 10 s，40個循環(huán)；在72 ℃反應時采集熒光光信號；然后采用60 ℃至95 ℃，以0.5 ℃為一個單位，6 s采集巧光信號，繪制烙解曲線［8-9］。

2　結果

2.1 瓊擴試驗結果

瓊擴試驗結果顯示，三免10 d后，血清中抗體效價除了“1313VG+未破碎病毒”組為1:8之外，其余組別均達到1:16，“GEL01+未破碎病毒”組達到 1:32。三免后“弗氏佐劑+破碎病毒”組瓊擴試驗樣品效價見圖1。

圖1　瓊擴試驗結果

2.2 細胞因子的普通PCR擴增和熒光定量PCR擴增結果

普通PCR結果顯示，檢測的所有細胞因子（包括β-actin、IL-2、IL-4、IL-6、IFN-?、TNF-α）樣品均可擴增出特異性目的條帶，大小分別在150～200 bp、100～150 bp、100～150 bp、100～150 bp、100～150 bp、100～150 bp之間，分別與預期大?。ǚ謩e為185 bp、118 bp、128 bp、107 bp、121 bp、107 bp）相符，表明以上6種細胞因子均已表達。普通PCR結果見圖2，細胞因子熒光定量PCR擴增結果見圖3。

圖2　各細胞因子普通PCR擴增結果

圖3　細胞因子熒光定量PCR擴增結果

2.3 熒光定量PCR檢測兔子外周血中各種細胞因子表達量變化結果

用所配制的疫苗在第3次免疫結束10 d后，使用熒光定量PCR方法，檢測外周血中IL-2、IL-4、IL-6、 IFN-?及TNF-α的表達。將所有細胞因子使用熒光定量PCR所得的Ct值與內參基因β-actin使用熒光定量PCR檢測所得的Ct值進行比較，最終得到外周血液中IL-2、IL-4、IL-6、IFN-?及TNF-α的表達量變化，縱坐標為2-△△Ct值，所得數(shù)據(jù)使用SPASS 17.0進行顯著性分析［10］，結果如下：

2.4.1 免疫后兔子外周血中IL-2表達量變化結果。由圖4可知，各組別免疫后外周血中IL-2表達量都高于對照組。軟件分析后得到“弗氏+破碎病毒”組、“弗氏+未破碎病毒”組、“201VG+未破碎病毒”組、“201VG+破碎病毒”組、“GEL01+破碎病毒”組分別與對照組相比差異顯著（P＜0.05），其他組別差異不顯著。

圖4　兔子外周血中IL-2表達量變化結果

2.4.2 免疫后兔子外周血中IL-4表達量變化結果。由圖5可知，各組別免疫后外周血中只有“GEL01+破碎病毒”組中的IL-4表達量上升，與對照組相比差異顯著（P＜0.05）；其他組中的IL-4表達量都低于對照組，與對照組相比差異不顯著（P＞0.05）。

圖5　兔子外周血中IL-4表達量變化結果

2.4.3 免疫后兔子外周血中IL-6表達量變化結果。由圖6可知，各組別免疫后外周血中IL-6表達量都低于對照組，各組別與對照組相比無顯著差異（P＞0.05）。

圖6　兔子外周血中IL-6表達量變化結果

2.4.4 免疫后兔子外周血中IFN-?表達量變化結果。由圖7可知，各組別免疫后外周血中IFN-?表達量都高于對照組，“GEL01+破碎病毒”組與對照組相比差異顯著（P＜0.05）。

圖7　兔子外周血中IFN-?表達量變化結果

2.4.5 免疫后兔子外周血中TNF-α表達量變化結果。由圖8可知，各組別免疫后外周血中TNF-α表達量都高于對照組。經過SPASS軟件分析后得到“弗氏+破碎病毒”組、“201VG+未破碎病毒”組、“GEL01+未破碎病毒”組、“1313VG+破碎病毒”組分別與對照組差異顯著（P＜0.05），其他組別與對照組無顯著差異（P＞0.05）。

圖8　兔子外周血中TNF-α表達量變化結果

3　討論

本研究發(fā)現(xiàn)，兔子在接種羊口瘡病毒后70 d內，其血清中特異性抗體效價不斷上升。并且在三免10 d后使用瓊擴試驗檢測特異性抗體效價，發(fā)現(xiàn)整體上效價可達到1:16，與鮮思美等［5］的研究結果一致：不同疫苗產生抗體的時間可能不同，產生的抗體水平也不一樣，但整體呈現(xiàn)上升趨勢，表明羊口瘡疫苗可以很好地誘導機體產生體液免疫。本研究中，在實驗設計之初，為了研究是否由病毒囊膜內部的某些物質誘導機體產生特異性抗體，將疫苗分為超聲波破碎組和未進行超聲波破碎組。最終瓊擴結果顯示，各組別均誘導機體產生良好的體液免疫，推斷羊口瘡特異性抗體是由羊口瘡病毒囊膜表面某種蛋白誘導產生的。

IL-2、TNF-α、IFN-?與Th1類細胞發(fā)育與分化有關。它們可以促進機體產生細胞免疫應答，在抗病毒過程中發(fā)揮著十分重要的作用。Th2型細胞因子主要有IL-4、IL-6，而Th2類細胞主要介導體液免疫［11］。研究中，在三免10 d后，使用實時熒光定量PCR儀檢測這幾類細胞因子的表達水平。結果顯示，各類疫苗組的IL-2、IFN-?、TNF-α表達水平有差異，但與對照組相比均呈上升趨勢，而且個別疫苗組和對照組差異顯著。除了“GEL01+破碎病毒”組中IL-4表達和對照組相比差異顯著，呈現(xiàn)升高狀態(tài)外，其他各類疫苗組的IL-4表達量均低于對照組，無顯著差異。各類疫苗組的IL-6表達量均低于對照組，但沒有顯著差異。因此認為羊口瘡疫苗誘導機體產生了細胞免疫，這與張冰冰等［12］的研究結果相似。免疫后期的Th1類細胞因子上升，Th2類細胞因子下降，可能是因為羊口瘡疫苗接種動物以后，會誘導Th1型免疫應答，而抑制Th2型免疫應答，這與國內外的一些相關報道一致［11］。由于滅活疫苗主要誘導體液免疫，因此本研究在賽彼科公司的推薦下，選擇了這幾種可以提高機體細胞免疫應答的佐劑，可能Th1型細胞因子表達量上升明顯和佐劑的選擇也有一定的關系。根據(jù)熒光定量結果可以看出，“GEL01+破碎病毒”組誘導細胞免疫效果最好，但是IL-4表達和對照相比卻呈現(xiàn)升高狀態(tài)，其具體原因需要進一步研究。

本研究也存在一些不足，例如熒光定量檢測的時機可能不是最佳時間段，未做縱向對比。對研究羊口瘡疫苗的免疫機制來說，研究羊口瘡病毒的免疫逃避機制也很重要。vIL-10是多功能因子，主要表現(xiàn)為阻止一系列刺激免疫反應的細胞因子合成，如巨噬細胞分泌的TNF-α和IL-8，淋巴細胞分泌的IFN-?；GIF主要抑制粒細胞巨噬細胞集落刺激因子和IL-2 來發(fā)揮其作用［13-14］。因而，如果在一免后的不同時間節(jié)點，采集樣品，檢測細胞因子的表達量，尤其分析IL-2、IFN-?、TNF-α的變化趨勢，則可以揭示免疫逃避機制和細胞免疫應答機制。在熒光定量PCR檢測的重復性方面也需要進行研究和摸索，進行更多的重復性試驗，這樣將使研究數(shù)據(jù)更加可靠。

綜上所述，羊口瘡疫苗在免疫后期，既可以誘導體液免疫應答產生特異性抗體，也可以誘導機體產生細胞免疫應答，改變相關細胞因子的表達量。但是，這兩種免疫應答機制如何通過抗體和細胞因子相互作用和影響尚不得而知，需要進一步研究。

［1］ 李旭東. 羊傳染性膿皰實時熒光定量PCR方法的建立［D］. 呼和浩特：內蒙古農業(yè)大學，2015.

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（責任編輯：朱迪國）

The Infl uence of Sheep Ecthyma Vaccine on Humoral Immune Response and Cellular Immune Response of Rabbits

Li Zhi，Zhang Qijin，An Weixue，Tu Mingliang，Zhang Zhidan，Li Na，Zhong Liang
（College of Veterinary Medicine，Inner Mongolia Agricultural University，Hohhot，Inner Mongolia 010018）

In order to better understand the molecular mechanism of immune response induced by sheep ecthyma vaccine，the level of specifi c antibodies in serum and expression of related cytokines in peripheral blood of rabbits immunized with sheep ecthyma vaccine were detected. 500 mL inactivated sheep ecthyma virus-infected cell suspensions were condensed into 100 mL，as well as another 500 mL suspensions with ultrasonic fragmentation treatment. Then the two portions of concentrated solutions were respectively mixed with Freund's adjuvant，201 VG，1313 VG，GEL01 and 11R VG to prepare different vaccines. In addition，10 mL inactivated sheep ecthyma crust venom was also used to generate vaccine by being mixed with 201 VG. Each kind of vaccine was applied to immunize two rabbits，and then blood samples were collected at different time to detect the level of specifi c antibodies in serum by agar immunodiffusion assay and the expression of cytokines in peripheral blood by real-time fl uorescence quantitative PCR. The results showed that the serum antibody titer all reached 1:16 or 1:32 in later period of immunization except the vaccine“1313VG+inactivated virus-infected cell suspensions”，antibody titer of which was 1:8. Interestingly，the expression quantity of Th1 cytokines（IL-2，IFN-? and TNF-α）in peripheral blood of all experimented rabbits increased in comparison with the control group. By contrast，the expression of Th2 cytokines（IL-4，IL-6）decreased. In conclusion，both humoral immune response and cellular immune response of rabbits were induced by sheep ecthyma vaccines prepared，and the changes of the two kinds of immune responses varied.

sheep ecthyma vaccine；humoral immune response；cellular immune response；specific antibody；cytokine；adjuvant

852.23

B

1005-944X（2016）11-0089-06

10.3969/j.issn.1005-944X.2016.11.024

張七斤