HPLC測(cè)定心脈隆注射液中3組分的含量

邵維在，段治尚，萬(wàn)德生，闕玉玲，周永斌

（云南騰藥制藥股份有限公司研發(fā)部，云南騰沖679100）

HPLC測(cè)定心脈隆注射液中3組分的含量

邵維在，段治尚，萬(wàn)德生，闕玉玲，周永斌

（云南騰藥制藥股份有限公司研發(fā)部，云南騰沖679100）

目的：建立心脈隆注射液中尿嘧啶，次黃嘌呤，肌苷的含量測(cè)定方法。方法：采用HPLC法對(duì)心脈隆注射劑中3組分進(jìn)行含量測(cè)定，色譜柱∶Agilent C18色譜柱；流動(dòng)相∶0.05 mol/L乙酸鈉緩沖液（pH 5.0）為流動(dòng)相A，甲醇-0.05 mol/L乙酸鈉緩沖液（pH 5.0）（80∶20）混合液為流動(dòng)相B，進(jìn)行梯度洗脫；流速∶0.5 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)∶254 nm；柱溫∶30℃。結(jié)果：尿嘧啶，次黃嘌呤，肌苷分別在0.038～2.404 μg，0.055～3.524 μg，0.089～5.716 μg范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，r=0.999 97、r=0.999 94、r=0.999 92；尿嘧啶平均回收率為99.30%，RSD=1.22%（n=9）；次黃嘌呤平均回收率為99.39%，RSD=0.91%（n=9）；肌苷平均回收率為99.61%，RSD=0.93%（n=9）。結(jié)論：此法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確，適用于心脈隆注射液中3種成分的同時(shí)測(cè)定。

心脈隆注射液；尿嘧啶；次黃嘌呤；肌苷

［DOI］10.3969/j.issn.2096-2266.2016.10.004

心脈隆注射液是由美洲大蠊〔1-2〕干品經(jīng)過浸漬、減壓濃縮、分離得到心脈隆浸膏再溶解后制得，有效成分為小分子肽類、復(fù)合核苷堿基和結(jié)合氨基酸類等〔3〕，具有促進(jìn)心肌細(xì)胞Ca2+內(nèi)流，溫和持久地增加心肌收縮力，擴(kuò)張血管，降低肺動(dòng)脈壓、肺毛細(xì)血管壓〔4〕；擴(kuò)張冠脈、增加冠脈流量〔5〕，抑制氧自由基介導(dǎo)的心肌損傷；擴(kuò)張腎血管、增加腎血流量、利尿；改善微循環(huán)；糾正神經(jīng)內(nèi)分泌失衡〔6〕。主治慢性充血性心力衰竭引起的心悸、浮腫、氣短、面色晦暗、口唇發(fā)紺等癥狀〔7〕。本文對(duì)心脈隆注射液3組分尿嘧啶，次黃嘌呤，肌苷含量測(cè)定方法進(jìn)行再研究，完善心脈隆注射液的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，為有效控制產(chǎn)品質(zhì)量提供科學(xué)依據(jù)。

1　儀器與試藥

三用紫外儀ZF-2型（上海市安亭電子儀器廠）；美國(guó)Agilent-1100液相色譜儀（安捷倫科技有限公司）；UV1700紫外分光光度計(jì)（島津蘇州有限公司）；用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑Agilent C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；電子分析天平AE240（梅特勒-托利多儀器上海有限公司）；數(shù)顯恒溫水浴鍋DRHH-S4（上海雙捷實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；尿嘧啶對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)∶100469-201308，供含量測(cè)定用）；次黃嘌呤對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)∶140861-200903，供含量測(cè)定用）；肌苷對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)∶140669-201305，供含量測(cè)定用）；心脈隆注射液3批（批號(hào)∶140681、140682、140683，云南騰藥制藥股份有限公司生產(chǎn)）。

2　試驗(yàn)方法與結(jié)果

2.1色譜條件色譜柱Agilent C18色譜柱（250 mm× 4.6 mm）；流動(dòng)相A為0.05 mol/L乙酸鈉緩沖液（pH 5.0），流動(dòng)相B為甲醇∶流動(dòng)相A（80∶20），按表1進(jìn)行梯度洗脫；檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm，流速0.5 mL/min，進(jìn)樣量10 μL〔8〕。理論板數(shù)按尿嘧啶、次黃嘌呤、肌苷峰計(jì)算均應(yīng)不低于5 000。

表1　HPLC法測(cè)定心脈隆注射液梯度洗脫程序表

2.2對(duì)照品溶液的制備精密稱取尿嘧啶對(duì)照品15.03 mg、次黃嘌呤對(duì)照品22.02 mg、肌苷對(duì)照品35.72 mg，置50 mL量瓶中，加流動(dòng)相A使溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密取10 mL置100 mL量瓶中，加流動(dòng)相A至刻度，搖勻，即得（每1 mL中含尿嘧啶30.06 μg、次黃嘌呤44.04 μg、肌苷71.44 μg）。

2.3供試品溶液的制備精密量取本品1 mL，置50 mL量瓶中，加流動(dòng)相A至刻度，搖勻，即得。

2.4陰性對(duì)照溶液的制備按處方量取除心脈隆浸膏外的其他藥材和輔料，按制法制備陰性樣品，按“2.3”項(xiàng)下制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果在對(duì)照品出峰位置未見其它雜質(zhì)干擾峰，說明處方中其他成分對(duì)尿嘧啶、次黃嘌呤、肌苷的測(cè)定無(wú)干擾。見圖1～3。

圖3　“心脈隆注射液”供試品HPLC色譜圖

2.5線性范圍的考察精密吸取對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，加流動(dòng)相A制成尿嘧啶濃度為3.760，7.510，15.025，30.050，60.100，120.200，240.400 μg/mL，次黃嘌呤濃度為5.506，11.013，22.025，44.050，88.100，176.200，352.400 μg/mL，肌苷濃度為8.930，17.860，35.725，71.450，142.900，285.800，571.600 μg/mL的對(duì)照液，按上述色譜條件進(jìn)行測(cè)定。分別以3組分的進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，以相應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，尿嘧啶、次黃嘌呤、肌苷的回歸方程分別為Y=79.802 965 5X+47.529 797（r=0.999 97）；Y=82.299 309 9X+87.022 488（r=0.999 94）；Y= 42.998 944 7X+100.221 86（r=0.999 92）。結(jié)果表明，3組分濃度分別在0.038～2.404 μg；0.055～3.524 μg；0.089～5.716 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好〔9〕。

2.6精密度試驗(yàn)精密吸取對(duì)照品溶液制備項(xiàng)下的尿嘧啶、次黃嘌呤、肌苷對(duì)照品溶液連續(xù)進(jìn)樣6次，每次10 μL，按“2.1”色譜條件進(jìn)樣，分別測(cè)定尿嘧啶、次黃嘌呤、肌苷的峰面積，計(jì)算精密度。結(jié)果尿嘧啶峰面積的RSD=0.03%（n=6），次黃嘌呤峰面積的RSD=0.10%（n=6），肌苷峰面積的RSD=0.08%（n=6），表明尿嘧啶、次黃嘌呤、肌苷進(jìn)樣精密度均良好〔10〕。

2.7穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)取同一批號(hào)（批號(hào)∶140681）樣品制備的供試品溶液，并分別于0、1、2、4、6、8、12、24 h按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣1次，測(cè)定峰面積。結(jié)果∶尿嘧啶、次黃嘌呤、肌苷峰面積RSD分別為1.54%、1.25%和1.77%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定〔11〕。

2.8重復(fù)性實(shí)驗(yàn)取同一批號(hào)樣品（批號(hào)∶140681）6份，按“2.3”項(xiàng)下方法制成供試品溶液，并按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，測(cè)得尿嘧啶、次黃嘌呤、肌苷的含量分別為1.230 7 mg/mL、2.434 3 mg/mL、3.189 1 mg/mL，RSD分別為0.98%（n=6），1.14%（n=6），1.21%（n=6）。表明測(cè)定結(jié)果的重復(fù)性良好。

2.9加樣回收率試驗(yàn)取同一批號(hào)樣品（批號(hào)∶140681）9份，每份精密量取1 mL，置100 mL容量瓶中。精密加入對(duì)照品溶液1、2、3 mL各3份（含尿嘧啶0.502 1 mg/mL、次黃嘌呤1.000 3 mg/mL、肌苷1.301 2 mg/mL），按“2.3”供試品溶液制備方法制備，并按“2.1”色譜條件測(cè)定。結(jié)果尿嘧啶平均回收率為99.30%，RSD=1.22%（n=9）；次黃嘌呤平均回收率為99.39%，RSD=0.91%（n=9）；肌苷平均回收率為99.61%，RSD=0.93%（n=9），均符合定量分析的要求〔12〕。見表2～4。

表2　尿嘧啶回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=9）

表3　次黃嘌呤回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=9）

表4　肌苷回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=9）

2.10樣品的含量測(cè)定依法對(duì)3批樣品（20140681、20140682、20140683）進(jìn)行含量測(cè)定。見表5。

表5　樣品含量測(cè)定結(jié)果

3　討論

心脈隆注射液歷經(jīng)15年的研究開發(fā)，自1992年云南騰藥制藥股份有限公司與大理大學(xué)合作開發(fā)，并由大理大學(xué)藥理學(xué)專家李樹楠教授及中科院昆明植物研究所生化專家胡忠教授主持研發(fā)。2004年7月心脈隆注射液獲得國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局頒發(fā)的藥品《新藥證書》；2006年8月獲得《藥品注冊(cè)批件》；2007年獲藥品GMP證書之后產(chǎn)品正式投放市場(chǎng)，并按國(guó)家藥監(jiān)局的要求進(jìn)行了大量的標(biāo)準(zhǔn)提升研究工作，于2009年11月獲得國(guó)家藥典委員會(huì)轉(zhuǎn)正標(biāo)準(zhǔn)。主要成分為復(fù)合核苷堿基、結(jié)合氨基酸，并建立了相應(yīng)的含量檢測(cè)項(xiàng)目。近幾年，企業(yè)開展了大量外協(xié)合作項(xiàng)目，對(duì)心脈隆注射液物質(zhì)成分進(jìn)行研究，標(biāo)準(zhǔn)修訂提高工作也在籌劃中，保證該藥品的安全、有效、可控，任重道遠(yuǎn)。

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Determination of Three Components in XML Injection by HPLC

Shao Weizai，Duan Zhishang，Wan Desheng，Que Yuling，Zhou Yongbin
（Research and Development Department，Yunnan Tengyao Pharmaceutical Co.，Ltd.，Tengchong，Yunnan 679100，China）

Objective:To develop a method for determination of uracil，hypoxanthine and inosine of XML injection.Methods:HPLC method was adopted in the determination of three components in XML injection.The analysis was performed on an Agilent C18column with the mobile phase consisting of 0.05 mol/L sodium acetate buffer solution（A）（pH=5.0），methanol and 0.05 mol/L sodium citrate butter mixed solution（80∶20）（B）（pH=6.5）by gradient elution at a flow rate of 0.5 mL/min.The detection wavelength was set at 254 nm and the column temperature was 30℃.Results:The linear ranges were 0.038 to 2.404 μg（r=0.999 97）for uracil，0.055 to 3.524 μg（r=0.999 94）for hypoxanthine and 0.089 to 5.716 μg（r=0.999 92）for inosine.The average recoveries（n=9）of three components were 99.30%for uracil，RSD=1.22%；99.39%for hypoxanthine，RSD=0.91%；and 99.61%for inosine，RSD=0.93%.Conclusion:This method is simple，convenient and accurate，which is suitable for the quantitative analysis of uracil，hypoxanthine and inosine in the XML injection.

XML injection；uracil；hypoxanthine；inosine

R917

A

2096-2266（2016）10-0014-04

（責(zé)任編輯李楊）

2015-07-06

2015-10-13

邵維在，工程師，主要從事新產(chǎn)品研發(fā)、產(chǎn)品工藝優(yōu)化、中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究.