邵建宏 趙福振 羅寶正 薄清如 沙才華 廖秀云 徐海聶

(珠海出入境檢驗檢疫局，國家外來病檢測重點實驗室，珠海，519015)

犀牛源性成分PCR檢測方法的建立

邵建宏 趙福振 羅寶正*薄清如 沙才華 廖秀云 徐海聶

(珠海出入境檢驗檢疫局，國家外來病檢測重點實驗室，珠海，519015)

犀牛源性成分；

(Zhuhai Entry-Exit Inspection & Quarantine Bureau，State Key Laboratory of Exotic Animal Diseases，Zhuhai，519015，China)

根據(jù)國際上物種分類研究，犀牛歸類于哺乳綱(Mammalia)奇蹄目(Perissodactyla)角型亞目(Ceratomorpha)犀科(Rhinocerotidae)，現(xiàn)存犀牛包括白犀(Ceratotheriumsimum)、黑犀(Dicerosbicornis)、印度犀(Rhinocerosunicornis)、爪哇犀(Rhinocerossondaicus)、蘇門答臘犀(Dicerorhinussumatrensis)5個物種。在生物學史上，犀牛曾遍布全球，其物種將近30個屬[1]。兩千多年來，犀牛被全人類視為珍稀藥用動物，尤其是犀牛角，具有解熱、涼血、解痙、解毒、定驚等奇效[2]。在巨大利益的驅使下，獵殺犀牛、販賣犀牛角等非法行徑在全球范圍內(nèi)廣泛存在，犀牛數(shù)量急劇下降。國際動物保護組織已禁止犀牛角的交易，并將犀牛所有物種列入《瀕危野生動植物種國際貿(mào)易公約》附錄。國務院于1993年發(fā)布的第39號文件也明確禁止了犀牛角在我國的進出境、貿(mào)易、郵寄、攜帶、制藥等行為。但是迄今為止，世界各國對于檢測和鑒定犀牛源性樣品的研究卻非常有限。為進一步加強對現(xiàn)存犀科物種的保護，提高對非法販賣犀牛角及其制品的打擊力度，提升鑒定真假犀牛角及其制品的效率和準確性，建立一種更加合適的對來源于犀牛的可疑樣品的檢測方法十分必要。

目前國內(nèi)外對于犀牛源性成分的分子生物檢測主要是基于線粒體DNA的Cytb和12S RNA基因的研究[3-4]，對犀牛角、犀牛皮的鑒定常局限于形態(tài)觀察法[5]、顯微鏡觀察比對法[6]、紫外燈熒光分析法[7]、紅外光譜分析法[8]。上述各種方法均具有一定的代表性，但在某些情況下也存在自身的劣勢，例如，形態(tài)觀察法過于淺表、局限性大且受到主觀因素和經(jīng)驗主義的影響，無法鑒定非原始形狀的樣品和微量樣品；顯微鏡觀察比對法無法滿足快速和大批量檢測的需要，同時對檢驗人員的要求較高，不易標準化和規(guī)范化；紅外光譜分析法需要特定的參照物，對成分的判斷和鑒定特異性較差；近年來也有利用DNA條形碼對動物物種進行鑒定的技術[9-10]，這種技術較為客觀，準確性較高，但它受到DNA數(shù)據(jù)庫中現(xiàn)有物種種類的限制，也可能由于種內(nèi)最大遺傳距離和種間最小遺傳距離的重疊交叉導致得出錯誤的鑒定結論；而目前關于犀牛源性成分檢測的分子生物學方法，其引物和擴增產(chǎn)物均只包含于一種基因區(qū)域，在某些情況下可能較難區(qū)分相近物種。本研究擬建立一種PCR方法用以快速、準確檢測犀牛源性成分。

1 材料與方法

1.1 樣品采集與保存

犀牛角樣品1份，粉末狀，為本實驗室留存樣品，使用標準方法(ZH2006-1，CNAS認可標準)擴增測序確認為白犀，用作陽性對照。

參考動物樣品13份，為鮮肉、熟肉、角制品和熟制標本，均為本實驗室留存樣品，使用標準方法(ZH2006-1，CNAS認可標準)擴增并測序，確認為黃牛(Bostaurus)、水牛(Bubalusbubalis)、野牦牛(Bosgrunniens)、斑羚(Naemorhedusgoral)、山羊(Capraaegagrushircus)、綿羊(Ovisaries)、野馬(Equuscaballus)、驢(Equusasinus)、原麝(Moschusmoschiferus)、鹿(Cervidae)、野豬(Susscrofa)、貘(Tapiridae)和虎(Pantheratigris)。參考樣品用于驗證方法的特異性。

送檢動物樣品5份，為動物頭角2份、骨骼1份、皮張2份，檢測項目為犀牛源性成分。

1.2 主要試劑

DNA提取試劑盒：E.Z.N.A.TM Tissue DNA Kit，美國OMEGA公司產(chǎn)品。

PCR反應試劑：TianGenTaqPCR Mastermix，中國天根生化科技(北京)有限公司產(chǎn)品。

DNA Marker：DNA Marker DL 2000，日本TaKaRa公司產(chǎn)品。

1.3 主要儀器設備

PCR儀：Veriti 96-Well Thermal Cycler，美國Applied Biosystems公司產(chǎn)品。

凝膠成像分析系統(tǒng)：Alpha Imager HP，美國Alpha Innotech公司產(chǎn)品。

高速冰凍臺式離心機：Sigma 3-18 K，德國Sartorius公司產(chǎn)品。

紫外分光光度計：NanoDrop ND - 1000 Spectrophotometer，美國 NanoDrop Technologies 公司產(chǎn)品。

1.4 DNA提取

使用經(jīng)高溫高壓處理的鑷子和藥匙對樣品取50 mg置于1.5 mL離心管中，使用DNA提取試劑盒對樣品進行DNA提取。

1.5 PCR引物的設計與合成

GenBank中公布的犀科物種線粒體全基因序列共有6個，分別為白犀(GenBank：Y07726.1)、黑犀(GenBank：FJ905814.1)、印度犀(GenBank：X97336)、爪哇犀(GenBank：FJ905815.1)、蘇門答臘犀(GenBank：FJ905816.1)和披毛犀(Coelodontaantiquitatis，GenBank：Y07726.1)。下載以上6個線粒體全基因序列，使用分子生物學軟件DNAMAN8.0進行多序列比對，使用Oligo7.0在其保守區(qū)域設計1對特異性PCR引物，其中上游引物在ND2基因區(qū)域，下游引物橫跨tRNA-Asn和tRNA-Ala基因區(qū)域。PCR產(chǎn)物橫跨多個基因的設計方法，有利于遺傳相近物種的區(qū)分。同時，上游引物中加入了兼并堿基，保證不同物種即使有序列差異，在擴增過程中效率也不會下降或者漏檢。為了與鹿科動物和馬科動物的區(qū)分，設計下游引物的時候，在3′端3個堿基中設計了1個犀科動物的特異性堿基，保證擴增的特異性。引物由上海輝睿生物科技有限公司合成，序列見表1。

表1 PCR引物序列

Tab.1 Sequences of primers for PCR

1.6 PCR檢測方法建立

使用1.5中引物配制PCR反應體系：2×TaqPCR Master mix 12.5 μL、10 μmol/L的F-primer 1.0 μL、10 μmol/L的R-primer 1.0 μL、DNA模版2.0 μL，余補水至總容積25 μL。PCR反應程序：94℃預變性5 min；94℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，共35個循環(huán)；72℃延伸5 min。PCR擴增結束后，取5 μL擴增產(chǎn)物置于2 %瓊脂糖凝膠中，以110 V電壓進行30 min電泳檢測，電泳結束后使用凝膠成像分析系統(tǒng)記錄結果。

1.7 PCR產(chǎn)物測序確認

將電泳后有目的條帶的PCR產(chǎn)物送北京六合華大基因科技股份有限公司廣州分公司進行測序，使用NCBI中BLAST功能對序列進行比對，確定物種來源。

1.8 PCR方法特異性試驗

以13份參考動物樣品提取的DNA為模板，采用上述方法進行PCR檢測，驗證所建立的PCR方法的特異性。

1.9 PCR方法靈敏度試驗

將犀牛陽性對照樣品PCR擴增目的條帶送北京六合華大基因科技股份有限公司武漢分公司進行TA克隆，并以此重組質粒作為陽性標準品。將重組質粒用紫外分光光度計測定質粒濃度，根據(jù)阿伏伽德羅常數(shù)換算為目的基因拷貝數(shù)。提取陽性克隆質粒并測定濃度后，按10倍梯度倍比稀釋，對經(jīng)梯度稀釋后的陽性對照進行PCR檢測，所能檢出的最低模板拷貝數(shù)為PCR方法的靈敏度。

1.10 樣品檢測和鑒定

以5份送檢樣品提取的DNA為模板進行PCR擴增和電泳檢測，將電泳后有目的條帶的PCR產(chǎn)物送北京六合華大基因科技股份有限公司廣州分公司進行測序，使用NCBI中的BLAST功能對序列進行檢索比對，確定樣品物種。

2 結果與分析

2.1 PCR檢測方法建立

使用設計的引物配制PCR反應體系，按照反應條件對陽性對照犀牛的DNA進行PCR擴增和凝膠電泳，得到了明顯的電泳條帶，產(chǎn)物大小約360 bp，與預期基本一致(圖1)。

2.2 特異性試驗

特異性試驗的比對物種涵蓋?？啤ⅠR科、鹿科、豬科、獏科和貓科。其中，?？啤⒙箍?麝、獐除外)和本研究對象犀科涵蓋了現(xiàn)存已知的所有有角哺乳動物(包括洞角、實角、叉角羚角、長頸鹿角、表皮角)，馬科、獏科和本研究對象犀科涵蓋了現(xiàn)存已知的所有奇蹄目動物，所選特異性試驗的比對物種具有高度代表性和廣泛性。特異性試驗結果顯示，僅犀牛樣品出現(xiàn)特異性的擴增條帶，其他動物樣品均未呈現(xiàn)擴增條帶(圖2)。

圖1 犀牛樣品PCR檢測結果Fig.1 PCR Results for sample of rhinoceros 注：M：DNA Marker DL2 000；1：犀牛樣品1；2：犀牛樣品2；N：陰性對照；B：空白對照 Note：M：DNA Marker DL2 000；1：sample of rhinoceros 1；2：sample of rhinoceros 2；N：negative control；B：blank control

圖2 PCR方法特異性試驗Fig.2 Specificity assay for the PCR assay 注：M：DNA Marker DL2 000；1～14依次為犀牛、黃牛、水牛、牦牛、羚羊、山羊、綿羊、馬、驢、麝、鹿、豬、獏、虎；N：陰性對照；B：空白對照 Note：M：DNA Marker DL2 000；1 to 14：the sample of rhinoceros，scalper，buffalo，yak，antelope，goat，sheep，horse，donkey，musk，deer，pig，tapirus and tiger by order；N：negative control；B：blank control

2.3 靈敏度試驗

靈敏度試驗結果顯示犀牛樣品在100個拷貝仍呈現(xiàn)較明顯的擴增條帶，10 拷貝所呈現(xiàn)的擴增條帶微弱，判定該方法靈敏度為100個拷貝(圖3)。

2.4 樣品檢測

樣品檢測結果顯示，有2份樣品呈現(xiàn)特異性擴增條帶，即判定為含有犀牛源性成分，另外3份樣品未呈現(xiàn)擴增條帶，則判定為不含有犀牛源性成分(圖4)。檢測陽性的2份樣品經(jīng)PCR產(chǎn)物測序結果證實均為白犀。

圖3 PCR方法靈敏度試驗Fig.3 Sensitivity assay for the PCR assay 注：M：DNA Marker DL2 000；1～9依次為109、108、107、106、105、104、103、102、101拷貝；N：陰性對照；B：空白對照 Note：M：DNA Marker DL2 000；1 to 9：109，108，107，106，105，104，103，102 and 101 copies of recombinant plasmids by order；N：negative control；B：blank control

圖4 樣品檢測Fig.4 Sample detection 注：M；DNA Marker DL2 000；1～5：5份待檢測樣品；P：陽性對照；N：陰性對照；B：空白對照 Note：M：DNA Marker DL2 000；1 to 5：the samples to be tested；P：positive control；N：negative control；B：blank control

3 討論

PCR技術以其能將微量DNA大幅擴增且高特異性、高靈敏度的特點，普遍被應用于分子生物學領域的檢測[11-14]。無論是古生物化石、殘骸，還是若干前遺留的毛發(fā)、皮膚或血液等所有“微量證據(jù)”，只要能夠在DNA完全分解前(DNA半衰期為521 a)對其進行分離提取，結合所設計的特異性引物，通過PCR技術的應用都能對其進行擴增，并通過后續(xù)的電泳、測序、比對流程對目標樣品的成分進行準確鑒定。

本研究所建立的方法對犀牛樣品的檢測結果顯示，樣品DNA序列與GenBank中白犀的線粒體序列同源性最高為100 %，準確性高。從擴增條帶判斷，本方法在現(xiàn)存已知的所有有角哺乳動物、現(xiàn)存已知的所有奇蹄目動物當中都具有高度特異性，與其他常見偶蹄動物如豬科的豬、野生保護動物如貓科的老虎也能有效進行區(qū)分，所能檢出的最低模板為100個拷貝，具有較高靈敏度。

本方法可用于動物、動物產(chǎn)品、加工工藝品等物品中犀牛源性成分的檢測和鑒定，在動物保護、取締各類非法行徑和打擊假冒偽劣產(chǎn)品方面都具有顯著的實際意義。值得注意的是，我們在引物設計的時候，包括了犀科的所有物種，包括已經(jīng)滅絕1萬年的披毛犀。所以在司法鑒定需要的時候可以進行PCR產(chǎn)物測序，確認截獲到該物種再出具相應的檢測報告。本方法檢測過程中需要取樣，將會對物品本身產(chǎn)生一定破壞，故對部分名貴物品、觀賞品的取樣過程應謹慎操作或應進一步對其可能產(chǎn)生的破壞情況做出預評估。同時，由于犀牛樣品的稀缺，本研究未能收集到所有犀科物種的樣品，需要在檢測中進一步驗證。

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Rhinoceros-derived ingredients；

Establishment of PCR Assay for the Detection ofRhinoceros-Derived Ingredients

Shao Jianhong Zhao Fuzhen Luo Baozheng*Bo Qingru Sha Caihua Liao Xiuyun Xu Hainie

To effectively identify rhinoceros-derived ingredients，we designed specific PCR primers using software Oligo 7.0 based on the mitochondrial DNA sequence of rhinoceros.We established PCR assay for the detection of rhinoceros-derived ingredients with newly designed primers.The sample of rhinoceros was amplified using rhinoceros-specific PCR primers，and specific bands were observed after gel electrophoresis.The assay had high specificity and results for all other thirteen samples were negative.This assay method was highly sensitive：the minimum amount of DNA detectable was 100 copies of recombinant plasmid DNA template.Five samples were examined with this assay.Two samples were positive and three were negative，which was consistent with the result of DNA sequencing.The result indicated that this newly established assay can be used for detecting rhinoceros-derived ingredients in samples.

稿件運行過程

2016-04-22

修回日期：2016-06-01

發(fā)表日期：2016-11-10

PCR；

檢測

PCR；

Detecting

Q953+.5

A

2310-1490(2016)04-316-05

為了對犀牛源性成分進行有效鑒定，根據(jù)犀科(Rhinocerotidae)動物線粒體DNA(mitochondrial DNA)序列，使用分子生物學軟件Oligo 7.0設計了特異性引物，用來建立PCR檢測犀牛源性成分的方法。結果顯示，建立的PCR方法可以對犀牛陽性樣品進行擴增，凝膠電泳呈現(xiàn)特異性條帶。方法特異性好，13份其他物種的樣品均為陰性結果。方法靈敏度較高，可檢測到100拷貝重組質粒DNA模板。對5份送檢樣品檢測發(fā)現(xiàn)2份犀牛樣品，與測序結果一致。結果表明，新建立的方法可應用于樣品中犀牛源性成分的檢測。

國家質檢總局科技項目(項目編號2014IK234)資助

邵建宏，男，33歲，學士，獸醫(yī)師；主要從事動物源性成分檢測方向研究。

*通訊作者：羅寶正，E-mail：bzluo@163.com