曹怡+王超群+徐風(fēng)+賈秀虹+劉廣學(xué)+楊生超+龍光強(qiáng)+陳中堅(jiān)+魏富剛+楊紹周+福田浩三+王璇+蔡少青

[摘要]該研究旨在建立三七質(zhì)量評(píng)價(jià)半微量方法并應(yīng)用于三七連作障礙樣品分析。采用100倍量水飽和正丁醇超聲提取0.1 g三七樣品，所建立的半微量提取方法相比于甲醇常量提取法對(duì)5個(gè)主要皂苷類(lèi)成分及三七皂苷K和Fa提取效率高9.6%～20.6%，且重復(fù)性良好，RSD<2.5%。LC-MS-IT-TOF技術(shù)指認(rèn)指紋圖譜16個(gè)皂苷類(lèi)成分特征峰，包括8個(gè)人參二醇型皂苷和8個(gè)人參三醇型皂苷。利用HPLC指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)及對(duì)特征峰峰面積提取可進(jìn)行三七的質(zhì)量分析。應(yīng)用所建立的方法對(duì)人工干預(yù)克服連作障礙三七樣品質(zhì)量評(píng)價(jià)的結(jié)果表明：指紋圖譜相似度、三七皂苷Fa的相對(duì)含量及三七皂苷K與三七皂苷Fa的比值（N-K/Fa值）均可作為評(píng)價(jià)連作地三七質(zhì)量恢復(fù)程度的指標(biāo)，其中N-K/Fa值同樣適用于不同生長(zhǎng)年限三七樣品的區(qū)分。正常（無(wú)連作栽培）組樣品三七皂苷K與三七皂苷Fa的峰面積比值為0.45～1.33；連作組樣品個(gè)頭小于正常組，指紋圖譜與正常組相似度均低于0.87，三七皂苷Fa的峰面積顯著低于正常組，N-K/Fa值顯著高于正常組，為2.35～4.74，與正常組三七樣品質(zhì)量存在差異。人工干預(yù)一組的樣品與正常組相似度均高于0.87，且16個(gè)特征峰的峰面積和分布模式均與正常組無(wú)顯著差異，N-K/Fa值為0.42～2.06。人工干預(yù)二組的樣品除重量較小的樣品外，其余均與正常組指紋圖譜相似度較高，三七皂苷K顯著高于正常組，N-K/Fa值為0.96～6.16。連作障礙經(jīng)人工干預(yù)后三七的質(zhì)量均有不同程度的恢復(fù)和提高，其中人工干預(yù)一組的三七質(zhì)量恢復(fù)情況優(yōu)于人工干預(yù)二組。該研究建立的三七質(zhì)量評(píng)價(jià)半微量方法，采用指紋圖譜及峰面積比值作為評(píng)價(jià)指標(biāo)可避免含量測(cè)定的繁瑣及昂貴，為連作障礙三七樣品的質(zhì)量分析提供了簡(jiǎn)便、快速和準(zhǔn)確的評(píng)價(jià)方法，且可應(yīng)用于三七不同年限等樣品的質(zhì)量評(píng)價(jià)。

[關(guān)鍵詞]三七； 半微量高效提?。?連作障礙； LC-MS-IT-TOF； HPLC指紋圖譜； 特征峰； 三七皂苷K/三七皂苷Fa

[Abstract]Panax notoginseng is a commonly used traditional Chinese medicine with blood activating effect while has continuous cropping obstacle problem in planting process. In present study， a semimicroextraction method with water-saturatedN-butanol on 0.1 g notoginseng sample was established with good repeatability （RSD<2.5 %） and 9.6 %-20.6 % higher extraction efficiency of seven saponins than the conventional method. A total of 16 characteristic peaks were identified by LC-MS-IT-TOF， including eight 20（S）-protopanaxatriol （PPT） type saponins and eight 20（S）-protopanaxadiol （PPD） type saponins. The established method was utilized to evaluate the quality of notoginseng samples cultivated by manual intervened methods to overcome continuous cropping obstacles.As a result， HPLC fingerprint similarity， content of Fa and ratio of notoginsenoside K and notoginsenoside Fa （N-K/Fa） were found out to be as valuatable markers of the quality of samples in continuous cropping obstacle research， of which N-K/Fa could also be applied to the analysis of notoginseng samples with different growth years.Notoginseng samples with continuous cropping obstacle had HPLC fingerprint similarity lower than 0.87， in consistent with normal sample， and had significant lower content of notoginsenoside Fa and significant higher N-K/Fa （2.35-4.74） than normal group （0.45-1.33）. All samples in the first group with manual intervention showed high similarity with normal group （>0.87）， similar content of common peaks and N-K/Fa （0.42-2.06）. The content of notoginsenoside K in the second group with manual intervention was higher than normal group. All samples except two displayed similarity higher than 0.87 and possessed content of 16 saponins close to normal group. The result showed that notoginseng samples with continuous cropping obstacle had lower quality than normal sample. And manual intervened methods could improve their quality in different levels.The method established in this study was simple， fast and accurate， and the markers may provide new guides for quality control in continuous cropping obstacle research of notoginseng.

[Key words]Panax notoginseng； semimicro and highly efficient extraction method； continuous cropping obstacles； LC-MS-IT-TOF； HPLC fingerprint； characteristic peaks； notoginsenoside K/notoginsenoside Fa

doi：10.4268/cjcmm20162012

三七是常用中藥，來(lái)源于五加科植物三七Panax notoginseng （Burk.） F.H. Chen的干燥根及根莖，主要功效為散瘀止血、消腫定痛^[1]。2015年版《中國(guó)藥典》的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定三七皂苷R₁、人參皂苷Rg₁和Rb₁的總含量不少于5.0 %^[1]。

三七在種植環(huán)節(jié)中存在連作障礙（continuous cropping obstacles），即在同一塊土壤連續(xù)種植、正常栽培的情況下也會(huì)出現(xiàn)生長(zhǎng)勢(shì)變?nèi)?、產(chǎn)量降低、品質(zhì)下降、病蟲(chóng)害嚴(yán)重等現(xiàn)象^[2]。研究者們對(duì)于連作障礙的克服進(jìn)行了很多嘗試，研究的主要關(guān)注點(diǎn)在于土壤的成分變化及三七的產(chǎn)量恢復(fù)^[3]，但對(duì)于人工干預(yù)克服連作障礙的三七并未進(jìn)行質(zhì)量分析，其有效性及安全性如何有待評(píng)價(jià)。目前克服連作障礙的研究基本在試驗(yàn)田中開(kāi)展，所獲得的三七樣品數(shù)量有限，需要建立一種少量高效的分析方法來(lái)對(duì)其質(zhì)量進(jìn)行研究，同時(shí)找出可用于質(zhì)量評(píng)價(jià)的指標(biāo)。此外，由于三七個(gè)子藥材的個(gè)體差異大，為充分研究不同樣品之間的差異，宜對(duì)單個(gè)樣品分別進(jìn)行分析。本課題組前期已建立三七的HPLC指紋圖譜法^[4]、11種成分的定量^[5]和“一測(cè)多評(píng)”方法^[6-7]，為本研究的方法開(kāi)發(fā)提供基礎(chǔ)。

本研究建立了半微量高效提取方法，所用樣品量降至100 mg，指紋圖譜采用LC-MS-IT-TOF技術(shù)解析出16個(gè)特征峰，特征峰的峰面積和比值比較可用于三七的質(zhì)量評(píng)價(jià)。將其應(yīng)用于云南文山苗鄉(xiāng)三七科技園的三七連作地、人工干預(yù)地及無(wú)連作正常地收集三七樣品質(zhì)量對(duì)比，找到了可用以進(jìn)行評(píng)價(jià)的關(guān)鍵指標(biāo)。

1 材料

1.1 儀器與試劑

高效液相色譜儀Agilent 1200（Agilent，美國(guó)）；Shimadzu LCMS-IT-TOF 液質(zhì)聯(lián)用儀（Shimadzu，日本）；101-0AB型電熱鼓風(fēng)干燥箱（天津市泰斯特儀器有限公司）；FPV-S5，神奇超細(xì)珍珠機(jī)（佑崎有限公司）；國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)篩（浙江上虞市春耀儀器紗篩廠，65目，0.25 mm）；1/10萬(wàn)天平（BP211D，Sartorius）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（RE-52A，上海亞榮生化儀器廠）；KH-500DB型數(shù)控超聲波清洗器（昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司）。

正丁醇（分析純，北京化工廠）；甲醇（分析純，北京化工廠）；乙腈（色譜純，F(xiàn)isher Scientific）；娃哈哈純凈水（杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司）；甲酸（99% 色譜純，ROE）；甲酸（LC-MS級(jí)，F(xiàn)isher Scientific）；超純水（Milli-Q 系統(tǒng)）。

1.2 藥材信息

樣品來(lái)源為云南文山苗鄉(xiāng)三七科技園連作障礙研究試驗(yàn)田，由北京大學(xué)藥學(xué)院蔡少青教授鑒定為五加科植物三七P. notoginseng的新鮮地下部分。供研究的三七樣品共4組，均為同時(shí)生長(zhǎng)及處理的二年生三七，具體編號(hào)及各組分析樣品數(shù)量，見(jiàn)表1，其中連作組為種植于連作土壤的三七，人工干預(yù)的2個(gè)組為種植于以特定方式施加工人干預(yù)的連作土壤中的三七，正常組為種植于正常土壤中的三七各組樣品外觀及代表HPLC圖，見(jiàn)圖1，2，可見(jiàn)正常組與人工干預(yù)2個(gè)組的樣品個(gè)頭大小相近，而連作組的樣品個(gè)頭普遍較小，且存在著主根腐爛的現(xiàn)象。新鮮樣品清洗后于陰涼處晾干，對(duì)須根、主根、根莖進(jìn)行分離，取主根打粉，過(guò)65目篩，進(jìn)行后續(xù)的分析。

2 方法

2.1 供試品制備

在課題組前期研究^[4]的基礎(chǔ)上為提高提取效率，降低樣品用量，采用100倍量的水飽和正丁醇進(jìn)行提取，設(shè)計(jì)半微量提取方法：精密稱定粉末0.1 g，于50 mL錐形瓶中，精密加入水飽和正丁醇10 mL（水飽和正丁醇配制方法：于150 mL分液漏斗中加入80 mL正丁醇和20 mL水，混勻，靜置，取正丁醇層），20～40 ℃下超聲提取1 h（250 W），冷卻至室溫，濾過(guò)用8 mL甲醇（A.R.）洗滌濾紙和殘?jiān)?次（4 mL/次），濾液70 ℃下減壓蒸干，用甲醇（G.R.）復(fù)溶，于2 mL量瓶中稀釋至刻度，過(guò)0.45 μm濾膜，即得供試品溶液，生藥質(zhì)量濃度0.05 g·mL^-1。每份樣品平行提取2次，峰面積取平均值。

2.2 HPLC分析^[5]

Agilent 1200 高效液相色譜儀，Phenomenex Luna C₁₈色譜柱（4.6 mm × 250 mm，5 μm）。流動(dòng)相為0.005%甲酸水（A）和乙腈（B），梯度洗脫0～35 min，21% B；35～36 min，21～30% B；36～55 min，30～40% B；55～65 min，40～85% B；65～80 min，85～100% B；80～85 min，100% B。流速1 mL·min^-1；進(jìn)樣量10 μL；柱溫25 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)200 nm。

2.3 LC-MS-IT-TOF分析

Shimadzu LC-MS-IT-TOF 液質(zhì)聯(lián)用儀：包括LC-20AD 二元輸液泵，DGU-20A3 脫氣單元，SIL-20AC可制冷自動(dòng)進(jìn)樣器，CTO-20A 柱溫箱，SPD-M20A二極管陣列檢測(cè)器，CBM-20A 系統(tǒng)控制器，ESI 離子源和IT-TOF質(zhì)量分析器。數(shù)據(jù)的采集和處理采用Shimadzu software

LC-MS solution version 3.60，分子式和元素組成預(yù)測(cè)軟件Formula Predictor version 1.2 和 Accurate Mass Calculator （Shimadzu，日本）。

液相條件同2.2項(xiàng)。質(zhì)譜條件：流速0.2 mL·min^-1，超純N₂為霧化氣（1.5 mL·min^-1），超純He為碰撞氣，曲型脫溶劑管（CDL）和加熱模塊（Heat Block）溫度200 ℃，正負(fù)離子模式下的全掃描，掃描范圍m/z300～2 000（MS¹）， m/z50～2 000（MS²和MS3），接口電壓4.5 kV （+）/-3.5 kV （-），檢測(cè)器電壓1.7 kV，碰撞誘導(dǎo)解離能量（CID）50%，三氟乙酸鈉（2.5 mmol·L^-1）校正質(zhì)量范圍。

特征峰鑒定以負(fù)離子模式下的母離子及碎片信息進(jìn)行解析，并以正離子模式下的母核信息進(jìn)行進(jìn)一步的確認(rèn)。通過(guò)母離子的精確質(zhì)荷比推測(cè)分子式，推斷可能的結(jié)構(gòu)式，母核的信號(hào)判別皂苷的類(lèi)型，通過(guò)糖基的丟失信號(hào)及碎片相對(duì)強(qiáng)度確定糖的連接位置及種類(lèi)。同時(shí)以文獻(xiàn)報(bào)道的液相保留行為進(jìn)行輔助解析^[8-11]。

2.4 中藥三七質(zhì)量評(píng)價(jià)半微量方法的建立

2.4.1 樣品處理及HPLC分析 樣品處理如2.1項(xiàng)所述，HPLC方法同2.2項(xiàng)所述。

2.4.2 指紋圖譜相似度評(píng)價(jià) 采用中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（國(guó)家藥典委員會(huì)2004A版），對(duì)照譜生成方法為平均數(shù)，時(shí)間窗寬度0.5 min，剪切前5 min和最后5 min的數(shù)據(jù)，選取10個(gè)峰進(jìn)行多點(diǎn)校正。

2.4.3 特征峰數(shù)據(jù)的提取及分析 對(duì)特征峰的色譜峰面積數(shù)據(jù)進(jìn)行提取，對(duì)其各自的峰面積數(shù)據(jù)、峰面積加和數(shù)據(jù)及比值數(shù)據(jù)進(jìn)行組間的t檢驗(yàn)比較。

2.5 人工干預(yù)克服連作障礙三七樣品的質(zhì)量評(píng)價(jià)

1.2項(xiàng)中的三七藥材樣品按照2.4項(xiàng)所述步驟進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)研究。

3 結(jié)果

3.1 質(zhì)量評(píng)價(jià)方法建立

3.1.1 半微量提取法提取效率及重復(fù)性評(píng)價(jià) 對(duì)本研究中所建立的半微量提取法（0.1 g樣品，水飽和正丁醇提取，以下稱為A法）和課題組前期建立的常量提取法^[5]（0.5 g樣品，甲醇提取，以下稱為B法）進(jìn)行對(duì)比，所用樣品為三七粉（編號(hào)6748，產(chǎn)地云南），分別用2種提取方法重復(fù)提取3次，進(jìn)行峰面積的比較。在相同的生藥濃度下，半微量提取法對(duì)人參皂苷Rg₁， Re， Rb₁， Rd和三七皂苷R₁， Fa， K共7個(gè)成分的提取率分別提高17.5%， 16.6%， 15.0%， 9.6%， 13.8%， 20.6%， 19.0%，見(jiàn)表2。對(duì)半微量提取法的方法重復(fù)性進(jìn)行考察，同一份三七粉（編號(hào)6748）用本方法重復(fù)提取6次，人參皂苷Rg₁， Re， Rb₁， Rd和三七皂苷R₁， Fa， K的RSD分別為1.3%， 2.3%， 0.78%， 0.90%， 2.0%， 0.85%， 2.4%，證明方法重復(fù)性良好。

3.1.2 HPLC指紋圖譜建立及特征峰指認(rèn) 采用課題組前期建立的指紋圖譜方法^[5]，能夠?qū)υ碥疹?lèi)成分進(jìn)行有效分離。已證實(shí)0～60 min主要為皂苷類(lèi)成分，這個(gè)時(shí)間段中16個(gè)特征峰可進(jìn)行有效峰面積提取， 見(jiàn)圖3。采用LC-MS-IT-TOF技術(shù)對(duì)這16個(gè)特征峰進(jìn)行結(jié)構(gòu)指認(rèn)，母離子信息、碎片信息及解析結(jié)果見(jiàn)表3。16個(gè)特征峰的鑒定結(jié)果分別為三七皂苷R₁（1， 以下簡(jiǎn)稱 R₁）；人參皂苷Rg₁（2， Rg₁）；人參皂苷Re（3， Re）；乙酰人參皂苷Rg₁（4， Ace-Rg₁）；三七皂苷R₄（5， R₄）； 三七皂苷Fa（6， Fa）；人參皂苷Rf（7， Rf）；人參皂苷Rb₁（8， Rb₁）；三七皂苷R₂（9， R₂）；丙二酰人參皂苷Rb₁（10， Mal-Rb₁）；人參皂苷Rg₂（11， Rg₂）；人參皂苷Rh₁（12， Rh₁）；人參皂苷Rb₁異構(gòu)體（13， Iso-Rb₁）；人參皂苷Rd（14， Rd）；丙二酰人參皂苷Rd（15， Mal-Rd）；三七皂苷K（16， N-K）。其中8個(gè)為三醇型皂苷，分別為1， 2， 3， 4， 7， 9， 11， 12號(hào)化合物；8個(gè)為二醇型皂苷，分別為5， 6， 8， 10， 13， 14， 15， 16號(hào)化合物。對(duì)這16個(gè)特征峰進(jìn)行峰面積提取可用以進(jìn)行三七樣品的質(zhì)量評(píng)價(jià)。

3.2 質(zhì)量評(píng)價(jià)方法在人工干預(yù)克服連作障礙三七樣品質(zhì)量評(píng)價(jià)中的應(yīng)用

3.2.1 指紋圖譜相似度評(píng)價(jià) 利用3.1項(xiàng)建立的分析方法以單一主根個(gè)體為分析對(duì)象進(jìn)行半微量提取及HPLC指紋圖譜的建立。以正常組9個(gè)樣品建立對(duì)照?qǐng)D譜，各組樣品分別與其進(jìn)行相似度分析。結(jié)果見(jiàn)圖4，顯示正常組樣品個(gè)體間相似度均高于0.87；連作組樣品與對(duì)照?qǐng)D譜相似度均低于0.87，證明其在化學(xué)整體輪廓上質(zhì)量與正常組具有差異；人工干預(yù)一組相似度提高，均高于0.87，與正常組無(wú)差異；人工干預(yù)二組中有2個(gè)樣品相似度低于0.87，其余4個(gè)樣品相似度高于0.87。表明人工干預(yù)后連作樣品的化學(xué)輪廓差異得到改善，質(zhì)量接近于正常組。其中人工干預(yù)二組的三七中相似度最低的6號(hào)樣品（GY2-6）個(gè)頭較小，主根質(zhì)量為0.65 g，而該組其余樣品質(zhì)量分布范圍為0.91～3.95 g，連作障礙組樣品質(zhì)量為0.73～1.35 g，正常組樣品質(zhì)量為0.85～5.15 g，人工干預(yù)一組樣品質(zhì)量為0.84～3.22 g，樣品大小可能影響其次生代謝物的含量，因此GY2-6號(hào)樣品與正常對(duì)照?qǐng)D譜的相似度較低，與連作組的模式更接近。從目前分析樣品的相似度評(píng)價(jià)結(jié)果看人工干預(yù)一組的三七樣品質(zhì)量改善效果優(yōu)于人工干預(yù)二組。

3.2.2 特征峰峰面積及比值的組間比較 對(duì)16個(gè)特征峰的峰面積及峰面積比值在樣品間進(jìn)行比較， 見(jiàn)表4，可見(jiàn)連作組Rg₁， Re， R₄， Fa， Rb₁， Rh₁， Mal-Rd成分的峰面積低于正常組，而N-K， R₂， Rg₂高于正常組，N-K與Fa的峰面積比值顯著高于正常組。人工干預(yù)一組和人工干預(yù)二組與正常組基本無(wú)明顯差異，但其中人工干預(yù)二組的GY2-6樣品的N-K峰面積較高， 見(jiàn)表4，其余各成分的峰面積均較低，與連作組的模式較為接近，樣品個(gè)頭小同樣可能為其質(zhì)量偏離正常樣品的原因。

在各指標(biāo)中，僅N-K/Fa及Fa的相對(duì)含量在連作組中與正常組具有顯著性差異，且同組內(nèi)樣品差異較小，適合作為評(píng)價(jià)連作障礙三七質(zhì)量研究指標(biāo)，而其余成分在組間未見(jiàn)顯著性差異，且組內(nèi)樣品差異較大，難以作為特異性指標(biāo)。對(duì)Fa的峰面積進(jìn)行組間比較，見(jiàn)表4，圖5，可見(jiàn)連作組Fa顯著低于正常組，人工干預(yù)后的兩組Fa含量顯著上升。N-K與Fa峰面積比值在各組之間進(jìn)行比較，見(jiàn)表4，圖5，正常組的比值范圍為0.45～1.33，人工干預(yù)一組的比值范圍為0.42～2.06，人工干預(yù)二組的比值范圍為0.96～6.16，連作組的比值范圍為2.35～4.74。連作組的樣品N-K/Fa比值顯著高于正常組（P<0.01），人工干預(yù)一組與正常組N-K/Fa無(wú)顯著性差異，人工干預(yù)二組顯著高于正常組（P<0.05），其中2個(gè)樣品比值大于2，其余小于2。證明N-K/Fa或Fa的相對(duì)含量可作為評(píng)判三七克服連作障礙樣品質(zhì)量恢復(fù)情況的指標(biāo)，F(xiàn)a含量越高，N-K/Fa比值越低說(shuō)明其更接近于正常三七，質(zhì)量得到提升。

利用指紋圖譜相似度、Fa的相對(duì)含量及N-K/Fa比值的評(píng)價(jià)指標(biāo)，可證明連作組在化學(xué)成分含量與分布模式上與正常組樣品存在差異，人工干預(yù)一組樣品均顯著減小此差異，而人工干預(yù)二組的樣品質(zhì)量存在組內(nèi)差異，個(gè)別個(gè)頭較小樣品質(zhì)量較差，但大部分接近正常三七的質(zhì)量。

4 討論

本研究建立了半微量提取、指紋圖譜及16個(gè)特征峰的LC-MS-IT-TOF指認(rèn)及峰面積提取比較的三七質(zhì)量評(píng)價(jià)方法，并將其成功應(yīng)用于人工干預(yù)克服連作障礙的研究的三七樣品中。

常規(guī)三七質(zhì)量評(píng)價(jià)研究（不同生長(zhǎng)年限、不同產(chǎn)地等）獲得的樣品量較大，樣品批次多，可采用以批次為單位進(jìn)行分析。但在連作障礙等部分研究中所獲得的樣品數(shù)量較少，且采用混合打粉不能反映組內(nèi)樣品質(zhì)量的分布情況，因此宜對(duì)單個(gè)三七樣品逐個(gè)分析。在本研究中，采收的均為二年生三七樣品，大部分樣品個(gè)頭較小，針對(duì)此問(wèn)題采用所建立的水飽和正丁醇對(duì)0.1 g半微量樣品超聲提取方法，提高了提取效率，并且減少了樣品的耗費(fèi)，方法重復(fù)性良好。此方法可以應(yīng)用于樣品數(shù)量有限的三七質(zhì)量評(píng)價(jià)分析中，在本課題組目前的研究中發(fā)現(xiàn)此方法可推廣應(yīng)用至主要成分同樣為皂苷類(lèi)的貴重藥材人參、西洋參等質(zhì)量分析中。

皂苷類(lèi)為三七的主要活性成分，因此本研究選擇皂苷類(lèi)為特征峰進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)。利用課題組前期建立的HPLC指紋圖譜方法，并采用LC-MS-IT-TOF技術(shù)共在指紋圖譜中指認(rèn)16個(gè)可進(jìn)行峰面積提取的特征峰，均為皂苷類(lèi)成分，其中大部分成分本課題目前已證明為藥材原型活性成分或體內(nèi)吸收入血成分。指紋圖譜的相似度、16個(gè)成分的峰面積提取及組間比較可應(yīng)用于不同類(lèi)型三七樣品的質(zhì)量評(píng)價(jià)，并找到各自的特征指標(biāo)。

HPLC指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)結(jié)果顯示連作組的三七樣品均與正常組相似度較低，人工干預(yù)一組樣品與正常組均有較高的相似度，人工干預(yù)二組大部分樣品與正常組相似度較高，但存在部分樣品相似度較低的情況。16個(gè)特征峰的比較也顯示連作組與正常組的差異，而人工干預(yù)的兩個(gè)組均與正常組較為接近。

16個(gè)特征峰的峰面積及比值比較發(fā)現(xiàn)指標(biāo)Fa的含量及N-K與Fa的峰面積比值可用于評(píng)價(jià)人工干預(yù)克服連作障礙三七的質(zhì)量。在連作組中，N-K/Fa顯著升高，F(xiàn)a含量顯著降低，其余皂苷也呈降低趨勢(shì)，本課題組已證明三年生三七活血效果更好，N-K與三七活血藥效的相關(guān)性不強(qiáng)，隨著年限的增加有含量下降趨勢(shì)，而其余皂苷與活血藥效的相關(guān)性均較強(qiáng)，隨生長(zhǎng)年限的增加而含量增高^[5]，提示連作地樣品的生長(zhǎng)狀態(tài)差，有效成分含量低。而人工干預(yù)后的樣品Fa的含量均顯著提升，N-K/Fa在人工干預(yù)一組顯著下降，在人工干預(yù)二組略有下降，證明2種人工干預(yù)手段在不同程度提升了連作樣品質(zhì)量，活性成分含量上升接近于正常三七，但其中人工干預(yù)二組樣品存在質(zhì)量參差不齊，個(gè)別樣品質(zhì)量與正常組存在差異的情況。

對(duì)課題組前期測(cè)定的不同生長(zhǎng)年限三七樣品的N-K/Fa同樣進(jìn)行組間的比較，見(jiàn)圖6^[5]，可見(jiàn)N-K/Fa隨著生長(zhǎng)年限的升高而降低，三年生樣品中為0.17～2.88，二年生為1.55～4.97，一年生為2.17～6.57，三年生顯著低于一、二年生樣品，證明N-K與Fa的比值對(duì)于不同生長(zhǎng)年限的三七區(qū)分及質(zhì)量評(píng)價(jià)同樣具有指導(dǎo)意義。在本課題組前期研究中，采用R₄和Fa的定量分析后的總含量可對(duì)不同生長(zhǎng)年限三七進(jìn)行區(qū)分^[5]，本研究中新尋找到的N-K/Fa指標(biāo)直接利用峰面積比值作為指標(biāo)，減少了標(biāo)準(zhǔn)曲線建立的工作量，并解決了R₄和Fa的標(biāo)準(zhǔn)品昂貴不易得的問(wèn)題，可更方便地應(yīng)用于實(shí)際操作中。

5 結(jié)論

本研究建立了基于半微量提取法，以16個(gè)特征峰為指標(biāo)的三七質(zhì)量評(píng)價(jià)方法，應(yīng)用性強(qiáng)，適用于樣品量少的三七個(gè)體分析。將所建立的方法成功應(yīng)用于人工干預(yù)克服連作障礙三七的質(zhì)量評(píng)價(jià)中，找到指紋圖譜相似度、三七皂苷Fa相對(duì)含量及三七皂苷K與三七皂苷Fa的比值（N-K/Fa）可作為其特征評(píng)價(jià)指標(biāo)。其中N-K/Fa可同樣作為三七質(zhì)量評(píng)價(jià)標(biāo)志物應(yīng)用于不同生長(zhǎng)年限三七樣品的區(qū)分。

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