喬鐵+梁可+馬進(jìn)+林蔗茹+鄭冰元+張立德

[摘要]探討黃芪皂苷對(duì)化療貧血小鼠PI3K/Akt/mTOR相關(guān)基因mRNA表達(dá)的影響。選取6～7周齡BALB/c小鼠48只，雄性，隨機(jī)分為空白組、模型組、皂苷組、甲苷組，每組12只。采用環(huán)磷酰胺建立化療貧血模型，灌胃治療14 d后，摘眼球取血，QPCR法檢測(cè)脾臟中Akt，PI3K，BCL-xl，bad，F(xiàn)oxO，mTOR，PTEN的mRNA水平。結(jié)果表明，模型組血紅細(xì)胞計(jì)數(shù)，血紅蛋白含量與空白組、皂苷組和甲苷組比較，明顯降低（P<0.05）。與空白組、皂苷組、甲苷組相比，模型組Akt，PI3K，BCL-xl，bad，mTOR水平明顯降低（P<0.05或P<0.01）；皂苷組這5種基因水平均較空白組無(wú)明顯差別；除PI3K外的4種基因，甲苷組較空白組有明顯差別（P<0.05或P<0.01）；而皂苷組與甲苷組水平也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05或P<0.01）。模型組與空白組、皂苷組相比，F(xiàn)oxO，PTEN水平明顯升高（P<0.05或P<0.01），較甲苷組無(wú)明顯差異；甲苷組這2種基因水平均較空白組升高顯著（P<0.05）；而皂苷組的FoxO高于空白組（P<0.05），皂苷組的PTEN與空白組無(wú)明顯差異；皂苷組FoxO，PTEN水平與甲苷組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。因此，該研究結(jié)果顯示黃芪皂苷能提高Akt，PI3K，BCL-xl，bad，mTOR水平（P<0.01），降低 FoxO，PTEN水平（P<0.05）。黃芪皂苷可有效改善環(huán)磷酰胺所造成的貧血，其機(jī)制可能與影響PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路相關(guān)基因有關(guān)。

[關(guān)鍵詞]黃芪； PI3K/Akt/mTOR； mRNA； 化療貧血

[Abstract]To study the influence of astragaloside on mRNA expression of PI3K/Akt/mTOR signal transduction in anemia model mice induced by chemotherapy， 48 male BALB/c mice which were 6-7 week old were picked as the research objects and randomly divided into four groups， blank group， model group， astragaloside group and astragaloside IV group. Each group was 12 mice. Chemotherapy anemia model was established by cyclophosphamide. The mice were drawn blood from eyeball after 14 days treatment. The QPCR was used to test the mRNA concentrations of Akt， PI3K， BCL-xl， bad， FoxO， mTOR， PTEN in mouse spleen. In comparison of blank group， astragaloside group and astragaloside IV group，the erythrocyte counting and values of Hb in model group were significantly lower （P<0.05）. The volumes mRNA of Akt，PI3K，BCL-xl，bad，mTOR were lower in blank group， compared with other groups （P<0.05 or P<0.01）. The similar trend in astragaloside IV group except PI3K， comparing with blank group （P<0.05 or P<0.01）. The contents of these five genes were no significant differentiations between astragaloside group and blank group. The statistics were obvious between astragaloside group and astragaloside IV group （P<0.05 or P<0.01）. The concentrations of FoxO， PTEN were higher in model group，compared with blank group and astragaloside group （P<0.05 or P<0.01）， but no difference with astragaloside IV group. Comparing with blank group， the volumes of these two genes were increased in astragaloside IV group （P<0.05）， FoxO was higher in astragaloside group （P<0.05）， but PTEN was not significant. There was no the same as astragaloside group and Astragaloside IV group. Therefore， astragaloside could increase the contents of Akt， PI3K， BCL-xl， bad， mTOR （P<0.01）， decrease the concentrations of FoxO， PTEN （P<0.05）. The changes in cyclophosphamide-induced anemia were highly significant by astragaloside. It could be related to the mRNA expression of PI3K/Akt/mTOR Signal Transduction.

[Key words]astragaloside； PI3K/Akt/mTOR； mRNA； chemotherapy-induced anemia

doi：10.4268/cjcmm20162019

黃芪是中醫(yī)臨床上常用的一味中藥，具有健脾補(bǔ)中、升陽(yáng)舉陷、益衛(wèi)固表、利尿、托毒生肌等多種功效^[1-2]。其實(shí)早在《日華子本草》明確指出黃芪具有“補(bǔ)血”作用，《本草綱目》謂黃芪“可治一切氣衰血虛之癥”?，F(xiàn)代藥理研究表明，黃芪的主要活性成分黃芪皂苷具有促進(jìn)小鼠骨髓造血干細(xì)胞增殖的作用^[3-6]。磷脂酰肌醇3激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K/Akt/mTOR）信號(hào)通路在維持造血系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)和造血細(xì)胞定向分化中起著重要的作用，PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路的異常激活或者失活都會(huì)破壞造血系統(tǒng)平衡，嚴(yán)重的影響造血機(jī)能^[7-8]。本文旨在探討PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路在黃芪皂苷對(duì)化療貧血模型小鼠發(fā)揮“補(bǔ)血”作用的機(jī)制。

1 材料

1.1 動(dòng)物 SPF級(jí)BALB/c小鼠48只，雄性，6～7周齡，購(gòu)自北京維通利華有限公司，許可證號(hào)SCXK（京） 2010-0002。

1.2 藥物與試劑 黃芪皂苷（astragaloside，成都曼斯特生物科技有限公司， 純度≥98%，批號(hào)MUST-13100901）；黃芪甲苷（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)110781-201314）；PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser（Takara公司）；Brilliant Ⅲ Ultra-Fast SYBR Green QPCR Master Mix（Agilent Technologies公司）。

1.3 儀器 HEMAVET950FS型全自動(dòng)五分類多物種血液分析儀（美國(guó)Drew公司）；熒光定量PCR儀（Stratagene Mx3000P，德國(guó)安捷倫公司）；蛋白核酸分析儀（DU640，美國(guó)貝克曼公司）；低溫高速離心機(jī)（MR1822，法國(guó)Jouan SA公司）。

2 方法

2.1 造模與分組 48只雄性BALB/c小鼠，按外周血紅細(xì)胞計(jì)數(shù)隨機(jī)分為空白組、模型組、皂苷組、甲苷組，每組12只?？瞻捉M：正常飼養(yǎng)，不予特殊處理。模型組、皂苷組和甲苷組分別于第1，3，5天按0.2 g·kg^-1體重劑量腹腔注射環(huán)磷酰胺。于造模第7天灌胃給藥，空白組、模型組均按10 g·kg^-1體重胃飼1 mL蒸餾水；皂苷組按10 g·kg^-1體重胃飼1 mL黃芪皂苷懸液；甲苷組按10 g·kg^-1體重胃飼1 mL黃芪甲苷混懸液，連續(xù)灌胃14 d。于末次給藥后24 h，摘眼球取血，脫頸處死小鼠，立即解剖，摘取脾臟，去除其他脂肪組織，置于0.9%氯化鈉溶液中漂去血液，用濾紙吸干，并用錫紙包裹，放置-70 ℃ 冰箱冷凍保存。

2.2 外周血紅細(xì)胞計(jì)數(shù)、血紅蛋白含量的檢測(cè) 于末次給藥后24 h，摘眼球取血，置于抗凝管中，然后放置在渦旋混合機(jī)上，充分震蕩使血液與抗凝劑混勻，防止血液凝固，再用全自動(dòng)五分類多物種血液分析儀檢測(cè)。

2.3 總RNA的提取和反轉(zhuǎn)錄 取50～100 mg脾組織，放入研缽中，加入少量液氮，迅速研磨，待組織變軟，再加少量液氮，再研磨，反復(fù)3次后，加入1 mL Trizol，轉(zhuǎn)移入離心管中。將樣品室溫放置5 min，離心10 min，取上清，加入200 μL氯仿；加蓋，劇烈震蕩15 s，室溫放置5 min，離心15 min，使溶液分為3相；取無(wú)色上層水相400 μL，加入500 μL異丙醇；加蓋，上下顛倒10次混勻，室溫放置10 min后，離心10 min，棄上清，加入75%乙醇1 mL，吹打洗滌沉淀，離心5 min；棄上清，空氣干燥至乙醇全部揮發(fā)；加入無(wú)RNA酶水30 μL溶解RNA，取4 μL RNA樣品稀釋25倍，使用核酸蛋白分析儀檢測(cè)吸光度，記錄A₂₆₀和A₂₆₀/A₂₈₀；計(jì)算RNA濃度。

使用PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒。①基因組DNA的去除反應(yīng)：0.5 μg總RNA加入5×g DNA Eraser Buffer 2 μL，g DNA Eraser 1 μL，加無(wú)核酸酶水至10 μL；反應(yīng)條件為42 ℃ 2 min。②反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：5×PrimeScript Buffer 2（for Real Time） 4 μL，PrimeScript RT Enzyme Mix I 1 μL，RT Primer Mix 1 μL，RNase Free H₂O 4 μL加入步驟①的反應(yīng)液10 μL；反應(yīng)條件為37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s。產(chǎn)物cDNA 4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.4 引物 應(yīng)用Invitrogen公司在線引物設(shè)計(jì)軟件OligoPerpectTM Desiner設(shè)計(jì)，采用BLAST進(jìn)行比對(duì)，由Invitrogen公司合成。設(shè)計(jì)的引物相關(guān)情況見(jiàn)表1。

2.5 QPCR檢測(cè) mRNA表達(dá)的方法 總RNA提取采用Trizol方法，按試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，核酸蛋白分析儀檢測(cè)總RNA的A₂₆₀和A₂₆₀/A₂₈₀，計(jì)算濃度。cRNA合成使用PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒10 μL。在PCR反應(yīng)體系中加入熒光染料，利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，最后對(duì)未知模板進(jìn)行相對(duì)定量分析。各基因?qū)崟r(shí)定量PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的鑒定利用熔解曲線分析法：各基因完成PCR擴(kuò)增循環(huán)后進(jìn)行產(chǎn)物熔解曲線分析，以確定產(chǎn)物純度。熔解曲線收集條件：95 ℃ 3 min，95 ℃ 5 s，60 ℃ 1 min后采集熒光信號(hào)，重復(fù)40個(gè)循環(huán)；在循環(huán)反應(yīng)后，按以下條件測(cè)溶解曲線：95 ℃ 15 s，55 ℃ 1 min，95 ℃ 30 s。在55 ℃升溫至95 ℃過(guò)程中，每升高0.5 ℃采集一次熒光信號(hào)。先以梯度稀釋的cDNA模板，測(cè)得各引物的擴(kuò)增效率。再以各組樣品進(jìn)行定量PCR檢測(cè)，反應(yīng)結(jié)束后，由溶解曲線判斷PCR反應(yīng)的特異性。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 根據(jù)Ratio=（1+E_target）^{ΔCttarget（control-sample）}/（1+E_ref）^{ΔCtref（control-sample）}公式，計(jì)算出各樣品mRNA的相對(duì)表達(dá)量，其中E_target為目的基因的擴(kuò)增效率，E_ref為內(nèi)參基因的擴(kuò)增效率，ΔCt為對(duì)照組Ct值與樣品Ct值的差。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用±s，用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。組間比較用方差齊性檢驗(yàn)，方差分析用One-Way ANOVA程序分析。P<0.05表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 對(duì)化療貧血小鼠血紅細(xì)胞計(jì)數(shù)與血紅蛋白含量的影響 與空白組比較，模型組血紅細(xì)胞計(jì)數(shù)和血紅蛋白含量明顯降低（P<0.05），與模型組比較，皂苷組和甲苷組血紅細(xì)胞計(jì)數(shù)和血紅蛋白含量明顯升高（P<0.05），皂苷組的血紅細(xì)胞計(jì)數(shù)和血紅蛋白含量無(wú)明顯差異，見(jiàn)表2。

3.2 對(duì)化療貧血小鼠Akt，PI3K，BCL-xl，bad，mTOR mRNA水平的影響 與空白組、皂苷組、甲苷組相比，模型組Akt，PI3K，BCL-xl，bad，mTOR水平明顯降低（P<0.05或P<0.01）；皂苷組這5種基因水平均較空白組無(wú)明顯差別；除PI3K外的4種基因，甲苷組較空白組有明顯差別（P<0.05或P<0.01）；而皂苷組與甲苷組水平也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05或P<0.01），見(jiàn)表3。

3.3 對(duì)化療貧血小鼠FoxO，PTEN mRNA水平的影響 模型組與空白組、皂苷組相比，F(xiàn)oxO，PTEN水平明顯升高（P<0.05或P<0.01），較甲苷組無(wú)明顯差異；甲苷組這2種基因水平均較空白組升高顯著（P<0.05）；而皂苷組的FoxO高于空白組（P<0.05），皂苷組的PTEN與空白組無(wú)明顯差異；皂苷組FoxO，PTEN水平與甲苷組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)表4。

4 討論

PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路參與許多重要生物學(xué)過(guò)程的調(diào)控，它在調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)和生存中起著關(guān)鍵性的作用。此通路中的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)包括PI3K，Akt，mTOR，PTEN，Bad，Bcl-xl，F(xiàn)oxO等。PI3K是PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路的重要上游始動(dòng)分子，關(guān)系著細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖和存活等許多方面，在造血干細(xì)胞的自我更新和分化中扮演著重要的角色。Akt是PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路中承上啟下的樞紐，激活的Akt能使底物的絲氨酸或蘇氨酸殘基磷酸化而起到抗凋亡和保護(hù)細(xì)胞的作用，調(diào)控B細(xì)胞的成熟和存活，抑制細(xì)胞凋亡。mTOR在細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖中起著關(guān)鍵作用，mTORC1的異常激活會(huì)導(dǎo)致造血干細(xì)胞快速增殖并最終耗竭失去造血重建的能力。負(fù)調(diào)控蛋白 PTEN 缺失引起的PI3K異常激活會(huì)引起造血干細(xì)胞的耗竭和B細(xì)胞發(fā)育的阻滯。Bcl-xl是主要的抗凋亡分子，而B(niǎo)ad起著促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用。兩者表達(dá)的平衡對(duì)細(xì)胞是否發(fā)生凋亡起著重要的調(diào)節(jié)作用。FoxO的缺失會(huì)導(dǎo)致造血干細(xì)胞造血重建失敗。PI3K/Akt/mTOR通路與干細(xì)胞的造血和免疫功能有關(guān)，廣泛參與了干細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、凋亡等過(guò)程。因此，有效抑制PI3K信號(hào)通路能夠有效擴(kuò)增造血干細(xì)胞，提高機(jī)體免疫，在開(kāi)發(fā)造血系統(tǒng)疾病藥物方面有廣泛前景^[9-14]。

研究表明，模型組與空白組在Akt，PI3K，BCL-xl，bad，mTOR的mRNA水平存在明顯差異（P<0.01），說(shuō)明模型組小鼠受到化療藥物環(huán)磷酰胺的影響，導(dǎo)致機(jī)體造血功能下降。空白組與皂苷組比較，在這5種基因水平上，無(wú)明顯差異，說(shuō)明化療貧血小鼠經(jīng)黃芪皂苷后，其造血功能基本恢復(fù)。而空白組與甲苷組比較后發(fā)現(xiàn)，除PI3K外，其余基因甲苷組均較空白組有顯著性差異（P<0.05或P<0.01），表明單純給予黃芪甲苷不能完全恢復(fù)這5種基因的水平。同時(shí)，本研究還發(fā)現(xiàn)，皂苷組與甲苷組在這5種基因水平上也存在明顯差異。有研究表明，黃芪皂苷中的化學(xué)成分除黃芪甲苷外，還存在黃芪皂苷Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ，Ⅴ，Ⅵ，Ⅶ，異黃芪皂苷Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ及大豆皂苷Ⅰ等40多種皂苷類成分^[15]，分析可能是由于多種成分的相互作用，使得黃芪皂苷在改善機(jī)體造血功能，提高免疫方面強(qiáng)于單一成分黃芪甲苷。

本研究中，對(duì)于FoxO和PTEN 2個(gè)基因，空白組和模型組有顯著性差異（P<0.01），表明造模成功。皂苷組與模型組比較，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），而甲苷組與模型組比較，無(wú)顯著性差異，表明皂苷組作用于化療貧血模型FoxO，PTEN的mRNA水平更強(qiáng)。空白組與甲苷組、皂苷組的對(duì)比，也說(shuō)明這一特點(diǎn)?？瞻捉M與甲苷組有明顯差異（P<0.05），與皂苷組的FoxO有差異（P<0.05），但與皂苷組的PTEN無(wú)明顯差異。試分析黃芪皂苷在改善由于化療引起的造血功能異常方面作用優(yōu)于黃芪甲苷，除了黃芪皂苷多種成分的相互作用，還可能是黃芪皂苷的多種成分，更利于體內(nèi)的吸收。因此，黃芪皂苷能夠作用于FoxO和PTEN 2個(gè)基因，改善化療貧血癥狀。

黃芪皂苷介導(dǎo)PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路，能夠改善化療藥引起的貧血癥狀，提高機(jī)體造血功能，從而增強(qiáng)免疫機(jī)能。同時(shí)本實(shí)驗(yàn)還研究了PI3K/Akt/mTOR通路中與細(xì)胞凋亡有關(guān)的BCL-xl，bad基因，與造血干細(xì)胞造血重建有關(guān)的FoxO基因和與造血干細(xì)胞、B細(xì)胞發(fā)育有關(guān)的PTEN基因，表明黃芪皂苷影響造血干細(xì)胞的發(fā)育，重建和凋亡等過(guò)程，進(jìn)而改善機(jī)體造血和免疫功能。因此，黃芪皂苷可以應(yīng)用于腫瘤化療，在降低化療藥物的毒副作用具有重要意義，同時(shí)本研究也為中藥在治療腫瘤減毒增效方面，提供新思路。

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[責(zé)任編輯 馬超一]