蔣向輝 劉良科 佘朝文

摘要：試驗(yàn)以來自不同地區(qū)的葛屬（Pueraria DC）植物11個種質(zhì)作為材料，基于其葉色、莖粗、莖節(jié)長、莖色、莖粗、莖被毛等9個形態(tài)性狀進(jìn)行形態(tài)學(xué)分類，并對11個種質(zhì)的rDNA ITS序列進(jìn)行克隆測序和序列比較分析，采用MEGA 6.0軟件構(gòu)建ITS序列系統(tǒng)進(jìn)化樹。結(jié)果表明，基于ITS序列和基于形態(tài)特征的分類結(jié)果雖有一定的相似性，但仍存在較大的差異。不同分類方法導(dǎo)致的結(jié)果差異可能與形態(tài)特征受其生長條件、性狀的選取等多方面因素的影響有關(guān)，而基于rDNA ITS序列的分類結(jié)果更為可靠。

關(guān)鍵詞：葛屬（Pueraria DC）；形態(tài)學(xué)；rDNA；ITS序列；分類一致性

中圖分類號：Q949 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2016）04-0939-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.04.032

Study on Classification Consistency Based on Morphology and rDNA ITS

Sequences of Pueraria Species

JIANG Xiang-hui1，LIU Liang-ke2，SHE Chao-wen2

（1. College of Chemistry and Materials Engineering， Kaili University， Kaili 556011， Guizhou， China；

2. Department of Life Science， Huaihua University， Huaihua 418008， Hunan， China）

Abstract： 11 germplasms of Pueraria DC from different regions were classifed by morphological classification method based on 9 morphological characters including leaf color， stem thickness， internodes length， stem color， stem diameter， stem hair； meanwhile， cluster analysis was conducted by MEGA 6.0 software based on rDNA ITS sequences of the 11 Pueraria species. It was found that the result of cluster analysis and morphological classification method had some similarities while the differences were obvious. The research suggested that the differences between different classification methods might be related to the morphological traits which could be affected by growth conditions， as well as the character selected； thus the classification result based on rDNA ITS was more reliable.

Key words：Pueraria DC； morphology； rDNA； ITS sequences； classification consistency

葛[Pueraria lobata（Willd.）Ohwi]又叫葛藤，為豆科（Leguminosae）葛屬（Pueraria DC.）植物[1]。葛屬植物全世界約有20種[2]，我國主要種類有野葛、甘葛藤、娥眉葛、食用葛、粉藤、云南葛、麗花葛等，其中野葛、粉藤分布最廣、產(chǎn)量也較高，是我國資源最多的2個種[3]。不同來源的葛無論是形態(tài)結(jié)構(gòu)還是活性成分都有差異，即使是同一種葛在不同的生長條件下各方面也會產(chǎn)生差異。陶娟等[4]對葛屬植物活性成分研究后發(fā)現(xiàn)，不同來源的葛其活性成分含量高低呈現(xiàn)由北向南逐漸遞減的趨勢，同種葛的活性成分含量也是表現(xiàn)為北方的相對較高、南方的相對較低。葛莖是我國湖南、湖北、貴州、江西等省的常見蔬菜，葛根富含葛根素、葛根素木糖甙、大豆黃酮、大豆黃酮甙及β-谷甾醇、花生酸等多種活性成分，還含有大量的淀粉，葛根有解表退熱、生津止渴、止瀉的功能，并能改善高血壓與糖尿病患者頭暈、頭痛的癥狀[5]。葛根毒性低、藥源廣、價格低，對葛根開發(fā)新藥和保健品具有良好的發(fā)展前景。

物種遺傳多樣性是物種進(jìn)化的基礎(chǔ)，物種遺傳多樣性研究最初主要集中在形態(tài)特征方面的描述、鑒別與分類，迄今為止，形態(tài)性狀的共性與差異仍是植物分類的主要依據(jù)。形態(tài)性狀標(biāo)記主要分為2類：單基因決定的質(zhì)量性狀與多基因決定的數(shù)量性狀。基于形態(tài)標(biāo)記的遺傳多樣性具有簡便、快速、花費(fèi)少等優(yōu)點(diǎn)，但其不足是這些性狀的遺傳機(jī)制較為復(fù)雜，遺傳率低，且環(huán)境條件對其影響較大，導(dǎo)致觀測標(biāo)準(zhǔn)不一致，標(biāo)記同源性難以把握，不能完全滿足遺傳多樣性分析的需要。20世紀(jì)80年代以來，隨著分子生物學(xué)和分子克隆技術(shù)的發(fā)展，一系列基于DNA序列變異的遺傳多樣性檢測方法應(yīng)運(yùn)而生[6]，研究表明，ITS序列與其保守性序列相比，其變異相對較快，信息位點(diǎn)和變異位點(diǎn)較為豐富，將其用于被子植物進(jìn)化與類群分析，可以有效區(qū)分科、亞科、族、屬之間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系[7]。鑒于此，試驗(yàn)對葛屬的11個種質(zhì)以形態(tài)學(xué)為基礎(chǔ)進(jìn)行初步分類的同時，根據(jù)它們的rDNA ITS序列特征進(jìn)行比較分析，構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育樹，試圖將形態(tài)標(biāo)記與DNA分子標(biāo)記結(jié)合起來對葛屬物種進(jìn)行遺傳多樣性分析，以期為葛屬物種的分類鑒定與親緣關(guān)系分析提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)所用材料為葛屬11個不同來源的種質(zhì)，相關(guān)信息見表1。

1.2 方法

1.2.1 形態(tài)學(xué)分析 對不同來源的葛屬種質(zhì)進(jìn)行形態(tài)學(xué)描述，篩選出物種間既有共性、又有差異的9個形態(tài)學(xué)性狀葉色、葉大小、莖粗細(xì)、莖節(jié)長短、節(jié)間膨大、莖顏色、芽粗細(xì)、莖被毛密度、莖被毛顏色；參照郭先鋒等[8]的方法對性狀進(jìn)行賦值處理，采用MEGA 6.0軟件對11份種質(zhì)進(jìn)行聚類分析，并繪制樹狀圖。

1.2.2 ITS序列克隆與序列分析 采用CTAB法提取供試物種基因組DNA。用于擴(kuò)增的ITS序列引物參照White等[9]設(shè)計的ITS通用引物，其序列的上游引物為ITS5：GGAAGGTAAAAGTCAAGG，下游引物為ITS4：TCCTCCGCTTATTGATATGC。擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性45 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s，36個循環(huán)；最后72 ℃延伸5 min。采用長沙安比奧生物試劑有限公司的DNA回收試劑盒進(jìn)行PCR產(chǎn)物回收，繼而將回收產(chǎn)物與pMD18-T質(zhì)粒在16 ℃下連接12 h，獲得重組質(zhì)粒后轉(zhuǎn)化至大腸桿菌（Escherichia coil）菌株DH5α中，菌株來自湖南大學(xué)生物學(xué)院。在獲得重組菌斑后，采用長沙安比奧生物試劑有限公司的質(zhì)粒提取試劑盒提取重組質(zhì)粒，進(jìn)一步經(jīng)雙酶切鑒定后，將質(zhì)粒送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序，測得序列經(jīng)NCBI網(wǎng)站比對確認(rèn)后，將序列在Gen Bank上登錄，獲得登錄號。以NCB網(wǎng)站提供的甘薯[Ipomoea batatas（L.）Lam.]ITS序列為外類群，采用MEGA 6.0軟件對11份種質(zhì)進(jìn)行聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 植物學(xué)性狀比較

供試葛屬種質(zhì)的9個形態(tài)學(xué)性狀比較情況見表2，葉片形態(tài)學(xué)比較情況見圖1。從表2可見，11個不同來源的種質(zhì)其莖桿都比較粗壯，顏色主要有綠色、黃綠色和淡綠色。從圖1可見，11個種質(zhì)葉上被毛疏密各不相同，顏色以白色、黃褐色和淡綠色為主；葉片互生，葉型主要為卵圓型，葉片顏色以綠色、淡黃色和黃綠色為主；小葉主要有三裂、兩裂2種類型，下裂深淺差異較明顯。其中，廣東合水粉葛葉色黃綠，被茸毛少且短，三出復(fù)葉，小葉全緣；湖南常德粉葛葉黃褐色，葉片較細(xì)且窄，三出復(fù)葉，小葉多三裂且較深，葉柄較長，葉尖端較長且均勻；廣西藤縣粉葛葉片綠色，被白色茸毛，但較少，三出復(fù)葉，小葉多三裂且裂淺；重慶合川粉葛葉淡綠色，三出復(fù)葉，葉緣三裂，葉片寬大肥厚，葉背面有少量綠茸毛；云南蒙自粉葛葉綠色微泛黃，葉大而肥厚，小葉兩裂，葉尖，葉柄細(xì)長，基部膨大明顯；江西德興超級粉葛葉大呈盾形，綠色，不帶齒，葉面少毛，葉柄長；湖南大衛(wèi)粉葛葉黃綠色，葉片較寬大，三出復(fù)葉，小葉全緣，被黃褐色茸毛，葉柄較長，葉脈明顯；湖南通道山葛葉極具特色，卵圓形，濃綠色，三出復(fù)葉，很少下裂，被毛少；重慶武隆苦葛羽狀復(fù)葉，具3小葉，小葉斜卵形，三裂，且裂深；湖南會同山葛葉卵圓形，淡綠色，葉柄粗短，被毛少，葉脈明顯；湖南常寧野葛葉淡綠色，寬大，被毛少，三出復(fù)葉，小葉有時兩裂，有時三裂，葉脈明顯，主脈粗。由此可見，葛屬不同種質(zhì)的葉片形態(tài)差異明顯。

2.2 植物學(xué)性狀聚類分析

供試葛屬11個種質(zhì)基于植物形態(tài)學(xué)的MP聚類圖見圖2。從圖2可以看出，11個葛屬材料之間遺傳距離相距較遠(yuǎn)，以相對遺傳距離15為界，可將11個種質(zhì)分為4個組，分別與以上不同的形態(tài)類型相對應(yīng)，如湖南常德粉葛、廣西藤縣粉葛、重慶合川粉葛、重慶武隆苦葛、湖南常寧野葛可聚為一組，其中有3種屬于粉葛，其性狀表現(xiàn)變化不是很大；廣東合水粉葛、湖南通道山葛、湖南會同山葛可聚為一組，湖南通道山葛、湖南會同山葛都屬于山葛，且都來源于湖南省，由于在同一小范圍地區(qū)內(nèi)受氣候環(huán)境影響變化不大，導(dǎo)致遺傳性狀變化很小，所以性狀極其相似；云南蒙自粉葛、江西德興超級粉葛、湖南大衛(wèi)粉葛都各為一組，可能是由于來源不同的地域，地理間隔較遠(yuǎn)，氣候溫差、土壤成分、日照長短差異較大影響了粉葛的植物學(xué)性狀所致。

2.3 葛屬11個種質(zhì)基于rDNA ITS序列的親緣關(guān)系分析

基于rDNA ITS序列構(gòu)建的葛屬植物MP系統(tǒng)發(fā)育樹見圖3。從圖3可以看出，湖南常德粉葛、廣西藤縣粉葛、重慶合川粉葛、云南蒙自粉葛、重慶武隆苦葛聚在了一起，親緣關(guān)系較近，可歸為一類。湖南常寧野葛、江西德興超級粉葛聚在了一起，親緣關(guān)系最近，可歸為第二類。廣東合水粉葛、湖南大衛(wèi)粉葛、湖南通道山葛、湖南會同山葛與其他葛相距較遠(yuǎn)，可各自成為一類。

2.4 形態(tài)學(xué)和rDNA ITS分類的一致性比較研究

從形態(tài)學(xué)和rDNA ITS分類的比較分析可以看出，湖南常德粉葛、廣西藤縣粉葛、重慶合川粉葛、重慶武隆苦葛在2種方法中都能聚為一組，并且前3種都屬于粉葛，其性狀變化不是很大，重慶武隆苦葛與粉葛不僅形態(tài)相近，且在遺傳上差異較小，2個種之間親緣關(guān)系相近。湖南常寧野葛與江西德興超級粉葛在遺傳上有一定的相似性，但形態(tài)上差異較大，可能與生長環(huán)境的生態(tài)因素有一定的關(guān)系。總的來說，基于分子水平上的分類結(jié)果與基于形態(tài)學(xué)性狀的分類結(jié)果之間有較大的相似性，但也存在一定的差異，這種差異可能與性狀受環(huán)境與基因2個因素共同的影響有關(guān)。不過基于形態(tài)學(xué)性狀的聚類結(jié)果受環(huán)境的影響較大，而采用分子水平的分類是以能夠穩(wěn)定遺傳的DNA序列為基礎(chǔ)，因此分子水平聚類結(jié)果比形態(tài)學(xué)結(jié)果更可信。

3 小結(jié)與討論

依據(jù)形態(tài)學(xué)特征對葛的分類鑒定不僅與葛的生長時期、生長環(huán)境等客觀因素有關(guān)，而且形態(tài)學(xué)性狀的判斷和選取受主觀因素的影響很大，因此基于形態(tài)學(xué)性狀特征對葛進(jìn)行分類分析和鑒定存在很大的局限性，尤其是對于某些形態(tài)學(xué)特征極為不明顯或相近的葛，就很難準(zhǔn)確的進(jìn)行分類。有學(xué)者在研究基于形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)分類比較時發(fā)現(xiàn)，在形態(tài)上相似的情況下，內(nèi)部結(jié)構(gòu)也有較大的區(qū)別，如楊祝良[10]對我國部分鵝膏菌標(biāo)本與歐美相似種的標(biāo)本進(jìn)行比較研究后，發(fā)現(xiàn)二者雖在外部形態(tài)上有相似之處，但在內(nèi)部結(jié)構(gòu)上存在較大差異，并且在分子生物學(xué)方面也同樣存在較大的差異。

本試驗(yàn)結(jié)果也表明，基于傳統(tǒng)形態(tài)特征的分類與基于rDNA的ITS序列分類結(jié)果有很大的差異。如基于ITS序列構(gòu)建的葛屬11個種質(zhì)的MP系統(tǒng)發(fā)育樹表明，湖南常德粉葛、廣西藤縣粉葛、重慶合川粉葛、云南蒙自粉葛、重慶武隆苦葛親緣關(guān)系較近；而根據(jù)葛屬的11個種質(zhì)形態(tài)學(xué)聚類圖，它們中的云南蒙自粉葛關(guān)系比較遠(yuǎn)。另外，從基于ITS序列構(gòu)建的葛屬植物MP系統(tǒng)發(fā)育樹可知，廣東合水粉葛、湖南大衛(wèi)粉葛、湖南通道山葛、湖南會同山葛與其他葛相距較遠(yuǎn)，且相互之間也存在很大差異；而根據(jù)形態(tài)學(xué)的MP聚類圖，廣東合水粉葛、湖南通道山葛、湖南會同山葛可聚為為一組；這說明形態(tài)學(xué)性狀的選取有待于改進(jìn)，應(yīng)更全面、更準(zhǔn)確地選取性狀。在不具備分子生物學(xué)相關(guān)條件的情況下，對植物的分類鑒別主要是借助植物學(xué)形態(tài)特征之間的共性與差異來區(qū)分，而形態(tài)學(xué)特征具有易變、模糊和易混淆等多方面的缺陷，在分類過程中常帶有一定的主觀性和局限性?，F(xiàn)在以rDNA的ITS序列為基礎(chǔ)的分類與鑒別研究越來越多，如基于形態(tài)特征和ITS序列對7個鵝膏菌屬菌株的分類鑒定[11]、rDNA的ITS序列在被子植物系統(tǒng)與進(jìn)化研究中的應(yīng)用[7]、ITS序列鑒定西紅花與其易混的中藥材[12]、基于ITS序列的東亞當(dāng)歸屬植物的分類學(xué)研究[13]等等；上述研究表明，基于分子生物學(xué)層面的分類更科學(xué)、更可靠，雖然還有許多需要完善的地方，但這是物種分類發(fā)展的主要方向。

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