UV法和UPLC法測定苦豆子總堿和苦參堿制劑光和熱穩(wěn)定性的比較研究

王 喬常建華吳樹清曹曉東楊良月

(1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 獸醫(yī)學(xué)院,內(nèi)蒙古呼和浩特 010018;

2.內(nèi)蒙古農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院,內(nèi)蒙古呼和浩特 010031)

UV法和UPLC法測定苦豆子總堿和苦參堿制劑光和熱穩(wěn)定性的比較研究

王 喬1常建華2吳樹清1曹曉東1楊良月1

(1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 獸醫(yī)學(xué)院,內(nèi)蒙古呼和浩特 010018;

2.內(nèi)蒙古農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院,內(nèi)蒙古呼和浩特 010031)

將苦豆子總堿和苦參堿制劑在不同的光和熱條件下放置90d，用UV法和HPLC法對藥物的光和熱穩(wěn)定性進(jìn)行比較研究.方法：樣品采用有機(jī)溶劑卒取，UV法測定藥物含量，檢測波長413nm，HPLC法采用SIGMADiscoveryC18柱（25cm×4.6mm，5μm），以甲醇-0.05mol/L磷酸二氫鉀（用磷酸氫二鉀調(diào)PH至6.45）為流動相，波長220nm。比較藥物濃度的RSD。結(jié)果：色譜圖中峰分離良好。UV法的RSD值高于HPLC法，UV法產(chǎn)生的誤差較大。結(jié)論：HPLC法比UV法測定方法重現(xiàn)性好，靈敏度好，精密度高。確定兩種藥物密封，4℃ 避光保存。

UV法UPLC法熱穩(wěn)定性

苦豆子（Sophora a1opecuroides）味苦性寒，多年生草本植物，旱生耐鹽，抗風(fēng)固沙作用強(qiáng)[3，7]。具有清熱解毒、祛風(fēng)燥濕、止痛殺蟲等作用。臨床主要治療家畜寄生蟲病。同時在抗炎、抗病毒、抗腫瘤等方面具有廣闊的應(yīng)用前景[6、7]。劑型廣泛，用途以一敵百。本試驗(yàn)根據(jù)《中國藥典》（2010年版第二部）關(guān)于藥物穩(wěn)定性試驗(yàn)指導(dǎo)原則和制劑穩(wěn)定性考察重點(diǎn)內(nèi)容，本文通過UV法和HPLC法對苦豆子總堿和苦參堿制對光和熱穩(wěn)定性進(jìn)行比較研究[8]。

1 儀器與材料

1.1 主要儀器

島津LC-2010C高效液相色譜儀，SHB-ⅢA循環(huán)水式多用真空泵，KQ-700DV型數(shù)控超聲波清洗器、SIGMADiscovery C18柱（25cm×4.6mm，5μm），旋渦振蕩器。TU-1901雙光束紫外分光光度計。

1.2 材料

原材料全部采樣于鄂爾多斯市鄂托克前旗，采摘的苦豆子經(jīng)內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所化學(xué)提純后得到苦豆子總堿和苦參堿制劑。甲醇、乙腈均采用色譜純，其他試劑均為分析純。

2 方法

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備及繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線

在UV法中，選取苦參堿作為苦豆子總堿和苦參堿制劑的標(biāo)準(zhǔn)品。精密稱取苦參堿標(biāo)準(zhǔn)品0.005g，50m1容量瓶加入氯仿稀釋至刻度，制成100mg/L母液，再用氯仿配制成不同濃度為2mg/ L、4 mg/L、8 mg/L、12mg/L1、14mg/L、16mg/L。在最大波413nm處，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線Y=0.0558X-0.0326，R2＝0.9993，線性范圍：1.8～15.9mg/L，作為UV法中兩種藥物標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備及繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2.1 苦豆子總堿標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

在HPLC法中，選取槐定堿為苦豆子總堿制劑的標(biāo)準(zhǔn)品。精密稱取槐定堿0.003g，用氯仿按1：10稀釋。然后將其稀釋至不同濃度為2.5μg/m1、3μg/m1、4μg/m1、5μg/m1、8μg/m1，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線Y=466602X+94125R2=0.9998。線性范圍2.473～8.005μg/ m1，作為HPLC法中苦豆子總堿標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.2.2 苦參堿標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

在HPLC法中，選取苦參堿作為苦參堿制劑的標(biāo)準(zhǔn)品。將稱取苦參堿標(biāo)準(zhǔn)品0.005g，用氯仿按1：10稀釋，此時藥物濃度為500μg/m L。將苦參堿標(biāo)準(zhǔn)品稀釋成3μg/m L、5μg/m L、 10μg/mL、15μg/m L、20μg/mL，標(biāo)準(zhǔn)曲線Y＝12221X-20832，R2=0.9993，線性范圍：3.116～19.997μg/mL，作為HPLC法中苦參堿標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.3 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

將兩種藥物放置3個月（90d），裝于密閉的容器內(nèi)，通過UV法和HPLC法測定藥物濃度的變化，進(jìn)行比較研究。通過標(biāo)準(zhǔn)曲線方程得出測得的濃度。在每個月（30d）的第1d進(jìn)行取樣，測定藥物濃度。

2.3.1 光穩(wěn)定性試驗(yàn)

將兩種藥物分別放置在冷熒光燈和紫外燈下，冷熒光燈照度分別為3000LX、5000LX，紫外燈波長為254nm。

2.3.2 熱穩(wěn)定性試驗(yàn)

將兩種藥物放置在高溫45℃、常溫20℃、低溫4℃三種不同溫度下，不同溫度組藥物都用錫箔紙包裹用。

2.4 不同光照和溫度條件組試驗(yàn)樣品的處理

取2.3.1和2.3.2處理方法中的樣品溶液1m1，加入9m1氯仿，離心4000r/15min，分離上清液和下清液，將上清液中加入9m1氯仿，離心4000r/15min，棄掉上清液，取下清液與之前的下清液混合，揮發(fā)干氯仿，得到試驗(yàn)樣品。

3 UV法和HPLC法

3.1 UV法的處理過程

在2.4中的氯仿層中加入無水乙醇10m1，混勻，分別吸取20μ1于燒杯中，揮干乙醇，再加入10m1氯仿和10m1溴麝香草酚藍(lán)顯色劑，靜置。兩種藥物都選定苦參堿為標(biāo)準(zhǔn)品，波長為413nm，顯色劑為溴麝香草酚藍(lán)。

3.2 HPLC法處理過程

將2.4中氯仿層中加入10mL 甲醇，用旋渦振蕩器搖勻后，用甲醇溶液按（1：1000）稀釋，充分搖勻.用0.45μm濾膜過濾稀釋樣品溶液并進(jìn)樣，此時為兩種藥物樣品溶液.

（1）苦豆子總堿色譜條件：

SIGMADiscovery C18柱（25cm×4.6mm，5μm）。不同濃度洗脫，以甲醇：0.05mo1/L磷酸二氫鉀（調(diào)PH至6.45）為流動相，0min～4min（15：85～18：82），4min～10min（12：82～25：75），10min～13min（25：75～20：80），13min～20min（20：80～15：85），波長225nm，柱溫40℃，流速0.8m1/min，進(jìn)樣量20μ1，進(jìn)樣時間25min。

圖1　槐定堿標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖

圖2　苦豆子總堿制劑樣品色譜圖

槐定堿:SIGMA DiscoveryC18柱(25cm×4.6mm,5μm),選定槐定堿為標(biāo)準(zhǔn)品以甲醇-0.05mol?L磷酸二氫鉀(用磷酸氫二鉀調(diào)PH至6.45)=35∶65,波長220nm,柱溫35℃,進(jìn)樣量20μL,進(jìn)樣時間15min為條件.苦參堿標(biāo)準(zhǔn)品和樣品色譜條件同槐定堿。

圖3　苦參堿標(biāo)準(zhǔn)曲線色譜圖

圖4　苦參堿制劑樣品色譜圖

3 結(jié)果與分析

表1　不同溫度下總堿和苦參堿的測定濃度

在4℃避光放置期間，苦豆子總堿和苦參堿制劑濃度降低最慢。濃度變化比較穩(wěn)定，在45℃避光放置期間，藥物濃度降低最快?？喽棺涌倝A和苦參堿制劑在不同溫度下，濃度變化差異顯著（P＜0.05）. 根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果，在不同溫度下，苦豆子總堿和苦參堿制劑濃度差異顯著，在4℃濃度，濃度最高，在45℃，濃度最低。4℃和20℃時、4℃和45℃，25℃和45℃苦豆子總堿和苦參堿濃度顯著降低（P＜0.05）。

表2　不同光照下總堿和苦參堿的測定濃度

在不同光照下，苦豆子總堿在冷熒光燈下，不同照度時，濃度差異顯著（P＜0.05）。冷熒光燈組和紫外燈組濃度差異顯著（P＜0.05），在紫外燈照射下，苦豆子總堿在30001x和50001x、50001x和紫外光時，濃度顯著降低，降低不顯著?？鄥A在30001x和紫外光、50001x和紫外光時濃度顯著降低，在30001x和50001x時濃度降低不顯著。

表3　避光條件下不同儀器測定總堿和苦參堿濃度的比較

在避光條件下，不同儀器測定苦豆子總堿和苦參堿制劑濃度差異顯著（P＜0.05）。

4 討論

藥物對光和熱比較明顯，在不同條件下，濃度均有降低，溫度越高，藥物濃度降低越快。藥物在紫外光中濃度降低最快。初步確定最適宜4℃、避光保存。

在HPLC法測定苦豆子總堿制劑樣品中，樣品中各成分在圖2色譜圖中分離良好，在不同時間中出現(xiàn)4個峰，依次為溶劑峰、槐定堿、氧化苦參堿和苦參堿。其中以槐定堿的濃度最高，所以選定槐定堿的濃度作為苦豆子總堿的濃度，應(yīng)用此法成功地建立了苦豆子總堿和苦參堿制劑的檢測方法。

樣品的前期處理過程一樣，只是儀器的工作原理不同，使檢測結(jié)果的差異較大。根據(jù)表3，HPLC法比UV法的RSD值要小，說明HPLC法的精密度較高，HPLC法側(cè)重于藥物的分離，并且能夠較精準(zhǔn)的測定物質(zhì)含量。將藥物中提取出的成分通過儀器的高效、高靈敏度的測定，并快速分析。

UV法利用藥物在不同波長下的對光吸收的差異，定量分析。在定量分析中，會產(chǎn)生光譜干擾，對于檢測結(jié)果偏差較大，只選用這一種方法，并不能夠達(dá)到檢測目的。用兩種方法對比，HPLC法精密度較高，便于分離和測定，更適合中藥含量的測定。

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內(nèi)蒙古農(nóng)牧業(yè)科技創(chuàng)新項(xiàng)目（2011CCJJM05）

王喬（1989－），女，碩士研究生，研究方向：反芻動物抗病性研究。

吳樹清（1957－），男，教授，碩士，碩士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)榉雌c動物抗病性能研究。常建華（1959-），內(nèi)蒙古農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院研究員。