劉冰，馮久慧，童貝，張富源，生威，張燕，陸旸，王碩

（食品營養(yǎng)與安全教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院，天津300457）

果蔬中苯醚甲環(huán)唑免疫分析方法的研究

劉冰，馮久慧，童貝，張富源，生威，張燕，陸旸，王碩*

（食品營養(yǎng)與安全教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院，天津300457）

針對(duì)目前由于三唑類殺菌劑苯醚甲環(huán)唑的廣泛應(yīng)用所帶來的農(nóng)藥殘留問題，建立了苯醚甲環(huán)唑的直接酶聯(lián)免疫檢測方法，其靈敏度IC50為（67.96±2.73）μg/L，檢測限IC15為（8.86±0.34）μg/L，與11種三唑類殺菌劑的交叉反應(yīng)率均小于0.01%。苯醚甲環(huán)唑在10種果蔬類樣品中的平均回收率為89.01%～103.43%，變異系數(shù)小于14.33%，檢出限為0.443mg/kg。

苯醚甲環(huán)唑；抗體；檢測；酶聯(lián)免疫吸附測定法

苯醚甲環(huán)唑，又名噁醚唑，商品名為世高、思科，英文名為Difenoconazole，化學(xué)名稱為順，反-3-氯-4-［4-甲基-2-（1H-1，2，4-三唑-1-甲基）-1，3-二氧戊烷-2-甲基］苯基-4-氯苯基醚。苯醚甲環(huán)唑是一種廣譜高效的三唑類內(nèi)吸性殺菌劑，屬于14α-甾醇脫甲基化抑制劑，可以干擾菌絲生長，抑制病原體孢子萌發(fā)，最終抑制真菌生長［1］。苯醚甲環(huán)唑具有保護(hù)和治療作用，被廣泛應(yīng)用于谷物、油料、水果、蔬菜、花生、甜菜、茶葉、人參等作物以控制病蟲害，主要用于防治灰腐病、霜霉病和白粉病，同時(shí)還可以抑制草莓和辣椒炭疽病［2］。按照我國農(nóng)藥的毒性分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，苯醚甲環(huán)唑的毒性經(jīng)口大于500 mg/kg，屬于低毒類農(nóng)藥，對(duì)人的每日容許攝入量為0.01 mg/kg體重［3］。但由于是直接噴灑于蔬菜、水果等作物上，使人們易受其危害。許多國家對(duì)該農(nóng)藥在食品中的殘留限量已經(jīng)作出了嚴(yán)格的限制，因此對(duì)于農(nóng)產(chǎn)品中苯醚甲環(huán)唑殘留量的檢測日益受到重視。

潘曉威［4］提出利用氣相色譜法能夠快速檢測芒果中苯醚甲環(huán)唑的殘留量，結(jié)果表明：樣品經(jīng)乙腈渦旋提取，通過PSA和無水硫酸鎂高速離心凈化，氣相色譜檢測，其添加回收率為79.8%～100.7%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.81%～4.39%，檢出限為0.002 5 mg/kg。Sandip H等［5］利用液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法（LC-MS）對(duì)秋葵中苯醚甲環(huán)唑的殘留量進(jìn)行了檢測，回收率為80%～107%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為4%～17%，檢測限為0.005 mg/kg。Ting D等［6］利用苯醚甲環(huán)唑作為模板分子，甲基丙烯酸為功能單體，乙二醇二甲基丙烯酸酯為交聯(lián)劑，建立了一種固相微萃?。肿佑≯E方法，用來檢測自來水和葡萄汁中的苯醚甲環(huán)唑殘留。檢測結(jié)果顯示，苯醚甲環(huán)唑的回收率為87.6%～95.4%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于4.9%，檢出限為0.5 μg/L。運(yùn)用上述常規(guī)的儀器分析方法，不僅時(shí)間長、費(fèi)用高，而且操作人員易接觸一些有毒的有機(jī)溶劑和化學(xué)試劑［7］?，F(xiàn)今，食品安全檢測正朝著快速便捷的方向發(fā)展，本研究旨在建立一種簡單、快速、靈敏的酶聯(lián)免疫分析檢測方法，這對(duì)于日益嚴(yán)重的食品安全問題得到更好更便捷地解決來說意義重大。

1　材料與方法

1.1儀器與試劑

苯醚甲環(huán)唑、腈菌唑、三唑醇、戊唑醇、雙苯三唑醇、三唑酮、烯唑醇、丙環(huán)唑、氟硅唑、粉唑醇、匙孔血藍(lán)蛋白（KLH）、牛血清白蛋白（BSA）、雞卵白蛋白（OVA）、辣根過氧化氫酶（HRP）、溴代乙酰氯、4-氨基丁酸：均購自美國Sigma公司；氟環(huán)唑、戊環(huán)唑：購自Dr. Ehrenstorfer Gmbh公司；3，4′-二氯二苯醚：購自北京力徳士化學(xué)科技有限公司；其它試劑均為分析純。包被緩沖液（0.05 mol/L，pH 9.6，碳酸鈉-碳酸氫鈉緩沖液）；磷酸鹽緩沖液（0.01 mol/L PBS，pH 7.4）；封閉液（0.5%脫脂乳粉/PBS溶液）；洗滌液（PBST，pH 7.4）；底物液（TMB-過氧化脲溶液）；終止液（1.25 mol/L硫酸溶液）。苯醚甲環(huán)唑抗體：由食品營養(yǎng)與安全教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室制備。

蛋白純化儀：美國BIO-RAD公司；酶標(biāo)儀：Thermo公司；冷凍離心機(jī)：德國Eppendorf公司；超純水系統(tǒng)：美國Millipore公司；96孔酶標(biāo)板：丹麥Nunc公司。

1.2方法

1.2.1直接競爭酶聯(lián)免疫檢測方法的建立

1.2.1.1直接競爭ELISA的檢測步驟

抗體以100 μL/well包被于酶標(biāo)板上，4℃孵育過夜；洗板后以200 μL/well加入封閉液，37℃孵育1 h；洗板后每孔先加入50 μL梯度稀釋的苯醚甲環(huán)唑標(biāo)準(zhǔn)品溶液，然后加入50 μL酶標(biāo)抗原稀釋液，37℃競爭反應(yīng)1 h；洗板后以100 μL/well加入底物液，室溫顯色20 min；以50 μL/well加入終止液；在雙波長方式（450 nm～650 nm）下用酶標(biāo)儀讀取OD值。根據(jù)OD值按公式（1）計(jì)算抑制率：

式中：OD陰性對(duì)照為不加標(biāo)準(zhǔn)品的吸光度值；OD陽性對(duì)照為加標(biāo)準(zhǔn)品的吸光值；OD空白為不加標(biāo)準(zhǔn)品和抗血清的吸光度值。

繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線：X軸為苯醚甲環(huán)唑標(biāo)品濃度的對(duì)

式中：IC50（苯醚甲環(huán)唑）為標(biāo)準(zhǔn)曲線上抑制率為50%處對(duì)應(yīng)的苯醚甲環(huán)唑濃度；IC50（結(jié)構(gòu)類似物）為標(biāo)準(zhǔn)曲線上抑制率為50%處對(duì)應(yīng)的結(jié)構(gòu)類似物濃度。

1.2.3實(shí)際樣品檢測

1.2.3.1樣品預(yù)處理

選取青花菜、大白菜、番茄、黃瓜、根芹菜、柑橘、蘋果、梨、香蕉、木瓜，共10種果蔬類樣品進(jìn)行研究，所有樣品不可洗滌，選取食用部分經(jīng)充分?jǐn)囁楹笾糜?℃?zhèn)溆谩Ｔ囼?yàn)時(shí)，稱取5 g樣品于50 mL離心管中，加入10 mL正己烷，渦旋震蕩5 min，吸取上層清液2 mL，經(jīng)氮吹濃縮近干，加入1 mL甲醇復(fù)溶［8］，用0.01 mol/L PBS稀釋后用于ELISA檢測。

1.2.3.2樣品的基質(zhì)影響及消除

將樣品按照1.2.3.1的方法處理后，用PBS分別稀釋5、10、50倍，然后分別繪制基質(zhì)曲線，選取與標(biāo)準(zhǔn)曲線吻合度最高的條件作為最適試驗(yàn)條件。

1.2.3.3加標(biāo)回收

向選取的果蔬類樣品中分別添加3個(gè)濃度水平（0.5、2.5、25 mg/kg）的苯醚甲環(huán)唑標(biāo)準(zhǔn)品，將加標(biāo)樣品充分混勻，靜置一段時(shí)間后，按照1.2.3.1的方法處理后，利用直接競爭ELISA法檢測，計(jì)算苯醚甲環(huán)唑的回收率。

1.2.3.4果汁樣品檢測分析

選取不同品牌的蘋果汁和橙汁樣品，按照1.2.3.1的方法處理后，進(jìn)行實(shí)際檢測分析。數(shù)值，Y軸為相應(yīng)的抑制率，是典型的S型曲線。

1.2.1.2抗體包被量和酶標(biāo)抗原稀釋倍數(shù)的優(yōu)化

試驗(yàn)采用棋盤法對(duì)抗體包被量和酶標(biāo)抗原的稀釋倍數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，選取3個(gè)抗體包被量（0.05、0.10、0.50 μg/well）和3個(gè)酶標(biāo)抗原稀釋倍數(shù)（2 000、3 000、4 000），同時(shí)進(jìn)行優(yōu)化，并繪制抑制率隨標(biāo)品濃度變化的標(biāo)準(zhǔn)曲線，選取ODmax在0.8～1.2之間，IC50值較小的參數(shù)為最優(yōu)條件。

1.2.1.3封閉液的種類及濃度的確定

供選擇的封閉液包括：0.5%脫脂乳粉，1.0%脫脂乳粉，0.5%OVA，1.0%OVA，分別用磷酸鹽緩沖液配置后，在其他條件不變的情況下進(jìn)行測定，選取ODmax在0.8～1.2之間，IC50值較小的參數(shù)為最優(yōu)條件。

1.2.2抗體特異性的測定

試驗(yàn)選取腈菌唑、三唑醇、戊唑醇、雙苯三唑醇、三唑酮、烯唑醇、氟環(huán)唑、戊環(huán)唑、氟硅唑、粉唑醇、丙環(huán)唑共11種三唑類殺菌劑，按公式（2）分別計(jì)算其交叉反應(yīng)率，以確定苯醚甲環(huán)唑抗體的特異性。

2　結(jié)果與討論

2.1直接競爭ELISA檢測方法的建立

經(jīng)優(yōu)化，抗體以0.50 μg/well包板，酶標(biāo)抗原稀釋3 000倍，封閉液為0.5%脫脂乳粉，苯醚甲環(huán)唑標(biāo)準(zhǔn)品從2 000 μg/L開始4倍梯度稀釋6個(gè)濃度進(jìn)行測試，繪制抑制率隨苯醚甲環(huán)唑標(biāo)準(zhǔn)品濃度變化的標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖1所示，通過計(jì)算得出：靈敏度IC50為（67.96±2.73）μg/L，檢測限IC15為（8.86±0.34）μg/L。

圖1　苯醚甲環(huán)唑直接競爭ELISA方法的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1　Standard curve of difenoconazole by dc-ELISA

2.2抗體特異性的測定

抗體的特異性通常用交叉反應(yīng)率來表示，交叉反應(yīng)率是指抗體與結(jié)構(gòu)不同的抗原決定簇發(fā)生結(jié)合的能力。交叉反應(yīng)率越小，說明抗體的特異性高，反之，交叉反應(yīng)率越大，說明抗體具有廣譜性，可識(shí)別多種同類藥物。本試驗(yàn)選取了腈菌唑、三唑醇、戊唑醇、雙苯三唑醇、三唑酮、烯唑醇、氟環(huán)唑、戊環(huán)唑、氟硅唑、粉唑醇、丙環(huán)唑，共11種三唑類殺菌劑，與苯醚甲環(huán)唑的交叉反應(yīng)率均小于0.01%，證明該抗體特異性較高，可以對(duì)食品中的苯醚甲環(huán)唑進(jìn)行有效檢測。

2.3實(shí)際樣品檢測

2.3.1樣品的基質(zhì)影響及消除

樣品中的腐殖質(zhì)、金屬離子、有機(jī)成分等基質(zhì)的存在可能會(huì)影響檢測方法的靈敏度，為了消除基質(zhì)效應(yīng)，可以對(duì)樣品進(jìn)行適當(dāng)稀釋［9］。在本試驗(yàn)中，以蘋果樣品為例，將樣品按照1.2.3.1的方法處理后，用PBS分別稀釋5、10、50倍，然后分別繪制基質(zhì)曲線，選取與標(biāo)準(zhǔn)曲線吻合度最高的條件作為最適試驗(yàn)條件，試驗(yàn)結(jié)果見圖2。

當(dāng)樣品提取液用PBS稀釋50倍時(shí)，最適合進(jìn)行ELISA的測定。根據(jù)樣品稀釋倍數(shù)及直接競爭ELISA方法的檢測限，計(jì)算得出10種果蔬類樣品中苯醚甲環(huán)唑的檢出限，均為0.443 mg/kg。

2.3.2加標(biāo)回收

共選擇10種果蔬類樣品，分別向其中添加3個(gè)濃度水平（0.5、2.5、25 mg/kg）的苯醚甲環(huán)唑標(biāo)準(zhǔn)品，按照直接競爭ELISA方法進(jìn)行檢測，計(jì)算其加標(biāo)回收率，測定結(jié)果如表1、表2所示。

圖2　不同稀釋倍數(shù)提取液的優(yōu)化結(jié)果Fig.2　The optimization of concentrations of extract

表1　蔬菜樣品中苯醚甲環(huán)唑的加標(biāo)回收率（n=3）Table 1　Recoveries studies of difenoconazole in vegetables（n=3）

表2　水果樣品中苯醚甲環(huán)唑的加標(biāo)回收率（n=3）Table 2　Recoveries studies of difenoconazole in fruits（n=3）

回收率在89.01%～103.43%之間，變異系數(shù)小于14.33%，說明此方法適用于食品樣品的檢測。

2.3.3果汁樣品檢測分析

選取不同品牌的蘋果汁和橙汁樣品進(jìn)行實(shí)際檢測分析，利用本研究所建立的dc-ELISA方法進(jìn)行檢測后，試驗(yàn)結(jié)果見表3。

表3　實(shí)際果汁樣品檢測及回收率表Table 3　Detection of real samples and their recoveries

由表3可知，6種樣品中均無苯醚甲環(huán)唑檢出（實(shí)測濃度低于樣品檢出限0.443 μg/L）。同時(shí)向所有樣品中添加2.5 mg/L的苯醚甲環(huán)唑標(biāo)準(zhǔn)品計(jì)算回收率，樣品處理方法同1.2.3.1，回收率為91.04%～113.84%。

3　結(jié)論

本研究通過苯醚甲環(huán)唑半抗原的設(shè)計(jì)及合成，人工抗原的制備，多克隆抗體的制備及純化，最終建立了苯醚甲環(huán)唑的直接競爭ELISA檢測方法，其靈敏度IC50為（67.96±2.73）μg/L，檢測限IC15為（8.86±0.34）μg/L，與11種三唑類殺菌劑的交叉反應(yīng)率均小于0.01%。選取10種果蔬類樣品，經(jīng)正己烷提取，PBS稀釋后，進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)，平均回收率為89.01%～103.43%，變異系數(shù)小于14.33%，檢出限為0.443 mg/kg。本研究所建立的直接競爭ELISA方法，靈敏度和特異性較高，樣品處理簡單，為農(nóng)產(chǎn)品中苯醚甲環(huán)唑殘留的有效監(jiān)管提供了一種高效的檢測工具。

［1］K Wang，J X Wu，H Y Zhang．Dissipation of difenoconazole in rice，paddy soil，and paddy water under field conditions［J］.Ecotoxicology and Environmental Safety，2012，86：111-115

［2］ Gopinath K，Radhakrishnan N V，Jayaraj J.Effect of propiconazole and difenoconazole on the control of anthracnose of chilli fruits caused by Colletotrichum capsici［J］.Crop Protection，2006，25：1024-1031

［3］李海華，廖福廣，王鵬，等．殺菌劑苯醚甲環(huán)唑的制備［J］．北京理工大學(xué)學(xué)報(bào)，2006，26（4）：365-368

［4］潘曉威．苯醚甲環(huán)唑在采后芒果中殘留動(dòng)態(tài)及風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估［D］．海口：海南大學(xué)，2014

［5］Sandip H，Dasharath P O，Sagar C U，et al．Residue analysis of fipronil and difenoconazole in okra by liquid chromatography tandem mass spectrometry and their food safety evaluation［J］.Food Chemistry，2015，176：145-151

［6］Ting D，Jing C，Min W，et al．An in situ immobilized pipette tip solid phase microextraction method based on molecularly imprinted polymer monolith for the selective determination of difenoconazole in tap water and grape juice［J］.Journal of Chromatography B，2014，951：104-109

［7］江小雪，張昭，武霓，等．酶聯(lián)免疫分析技術(shù)在殺菌劑殘留檢測中的應(yīng)用［J］．浙江農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，1（3）：562-565

［8］王雯，梁穎，錢建亞．液相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用檢測番茄中苯醚甲環(huán)唑殘留［J］．江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2011，27（3）：668-671

［9］Maria-Pilar M，Shirley G，Bruce D．Immunochemical techniques for environmental analysis II，Antibody production and immunoassay development［J］.Trends in analytical chemistry，1995，14（8）：415-425

Development of An Enzyme-linked Immunosorbent Assay for the Detection of Difenoconazole in Fruits and Vegetables

LIU Bing，F(xiàn)ENG Jiu-hui，TONG Bei，ZHANG Fu-yuan，SHENG Wei，ZHANG Yan，LU Yang，WANG Shuo*
（Key Laboratory of Food Nurtrition and Safety Ministry of Education of China，The School of Food Engineering and Biotechnology of Tianjin University of Science and Technology，Tianjin 300457，China）

A direct competitive enzyme-linked immunosorbent assays（dc-ELISA）was developed for detection of difenoconazole.The sensitivity（IC50）and the limit of detection（IC15）were（67.96±2.73）μg/L and（8.86± 0.34）μg/L，respectively.The assay conditions were optimized and the cross-reactivity against other triazole fungicides was low.The recoveries were in range of 89.01%-103.43%and RSD were below 14.33%.The detection limit for the method was 0.443 mg/kg.

difenoconazole；antibody；detection；ELISA

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.21.025

國家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金（31301462）

劉冰（1979—），女（漢），副教授，博士，研究方向：食品安全檢測。

王碩（1969—），男，教授，研究方向：食品安全檢測。

2015-12-21