林琳 買買江·阿不力孜 張永輝 李大志 依馬木 昝向陽(yáng) 欒新平

(1新疆醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院神經(jīng)外科; 2新疆醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院神經(jīng)外科，新疆 烏魯木齊 830000)

·經(jīng)驗(yàn)交流·

視神經(jīng)減壓術(shù)干預(yù)兔視神經(jīng)損傷模型視網(wǎng)膜Caspase-3變化

林琳1買買江·阿不力孜1張永輝1李大志1依馬木1昝向陽(yáng)1欒新平2*

(1新疆醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院神經(jīng)外科;2新疆醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院神經(jīng)外科，新疆 烏魯木齊 830000)

視神經(jīng)損傷; 兔視神經(jīng)損傷模型; 視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞Caspase-3

外傷性視神經(jīng)損傷發(fā)病率約為0.3%～5.2%，臨床上主要治療方法糖皮質(zhì)激素和視神經(jīng)管減壓術(shù)等均不能有效阻止視神經(jīng)萎縮的發(fā)生[1]。多數(shù)患者預(yù)后不良，大約50%患者最終失明[2]，因此臨床迫切需要明確視神經(jīng)傷后細(xì)胞修復(fù)過(guò)程、影響因素，運(yùn)用安全有效的治療手段。

本研究以白兔的動(dòng)物模型為研究對(duì)象，觀察計(jì)數(shù)視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞Caspase-3受體陽(yáng)性表達(dá)，來(lái)評(píng)價(jià)臨床治療有效性，為進(jìn)一步研究視神經(jīng)損傷的治療機(jī)制奠定基礎(chǔ)，并為確定治療方案及預(yù)后提供理論依據(jù)。

一、材料與方法

1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及其分組：96只成年健康新西蘭白兔，體重2～2.5 kg。6只為對(duì)照組，對(duì)90只白兔左眼進(jìn)行視神經(jīng)損傷模型制作，隨機(jī)分為假傷組、模型組、地塞米松影響組、視神經(jīng)減壓術(shù)影響組、減壓術(shù)聯(lián)合地塞米松影響組，每個(gè)組分三個(gè)亞組，分別為術(shù)后1 d組、7 d組、21 d組，每個(gè)亞組6只。

2.視神經(jīng)損傷動(dòng)物模型建立：3%戊巴比妥1 ml/kg靜脈注射麻醉，在顯微鏡下暴露視神經(jīng)，用蛇牌臨時(shí)動(dòng)脈瘤夾夾閉20 s，蘇醒后放回籠內(nèi)。觀察傷眼瞳孔散大，直接對(duì)光反應(yīng)消失。

3.視神經(jīng)減壓術(shù)：動(dòng)脈瘤夾夾閉20 s后，向球后8 mm銳性分離視神經(jīng)外包膜組織，達(dá)到視神經(jīng)減壓目的。

4.地塞米松給藥方法：術(shù)后當(dāng)日開始，按每日每只1 mg/kg劑量，進(jìn)行肌肉注射，直至達(dá)到各處死點(diǎn)。

5.動(dòng)物處死與病理切片的制備：動(dòng)物存活到期后處死解剖摘取雙側(cè)眼球及視神經(jīng)。于4%多聚甲醛溶液中固定，梯度脫水、二甲苯透明、常規(guī)石蠟包埋視神經(jīng)及視網(wǎng)膜，制備石蠟切片，行免疫組化病理檢測(cè)。

6.計(jì)算機(jī)圖像處理及實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì): 結(jié)果判定：細(xì)胞核中有棕黃色顆粒者為陽(yáng)性細(xì)胞，即凋亡的細(xì)胞。視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(retinal ganglion cells, RGC)陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)方法：高倍顯微鏡下分別計(jì)數(shù)視野中可觀察到的陽(yáng)性細(xì)胞，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

7.統(tǒng)計(jì)方法：統(tǒng)計(jì)資料為多組定量資料，若分組或時(shí)間符合正態(tài)、方差齊性，進(jìn)行方差分析。同時(shí)進(jìn)行不同分組及不同時(shí)間的兩兩比較各組數(shù)據(jù)用Sasjmp pro計(jì)算機(jī)統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。各組的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，如Plt;0.05則認(rèn)為存在差異。

二、結(jié)果

1.RGCs Caspase-3的檢測(cè)：視神經(jīng)損傷后，各組視網(wǎng)膜Nogo陽(yáng)性細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)在后續(xù)的各個(gè)時(shí)間點(diǎn) 1 d、7 d、21 d上述改變具有不同的發(fā)展趨勢(shì)見(jiàn)表1。減壓聯(lián)合地塞米松治療后1 d、1 w、3 w的視網(wǎng)膜Caspase-3免疫組化病理檢測(cè)提示陽(yáng)性率隨時(shí)間增高(圖1～3)。

組別視網(wǎng)膜Caspase計(jì)數(shù)(個(gè))1d7d21d統(tǒng)計(jì)量 單純夾閉組7．83±1．6016．83±1．7219．17±3．06F=43．27c 單純減壓組11．33±2．8817．50±2．5919．50±3．73F=11．30b 地塞米松組11．50±2．1716．83±3．9722．50±4．32F=13．91a 對(duì)照組3．33±1．033．83±1．473．67±1．63F=0．20 假傷組4．17±0．753．50±1．383．67±1．21F=0．55 減壓地塞米松組12．17±2．2316．00±3．4621．33±3．33F=13．61d

aPlt;0.05,vs地塞米松組1 d;bPlt;0.05,vs單純減壓組1 d;cPlt;0.05,vs單純夾閉組1 d;dPlt;0.05,vs減壓地塞米松組1 d

圖1 兔減壓聯(lián)合地塞米松治療后1 d的視網(wǎng)膜Caspase-3免疫組化圖

圖2 兔減壓聯(lián)合地塞米松治療后1 w的視網(wǎng)膜Caspase-3免疫組化圖

圖3 兔減壓聯(lián)合地塞米松治療后3 w的視網(wǎng)膜Caspase-3免疫組化圖

2.視網(wǎng)膜Caspase-3陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)時(shí)間的兩兩比較：對(duì)各組自身在視神經(jīng)夾閉損傷模型建立后各個(gè)時(shí)間組 1 d、7 d、21 d進(jìn)行自身對(duì)比：①對(duì)照組在與視神經(jīng)夾閉損傷模型各治療組，在1 d、7 d、21 d Caspase-3陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量除假傷組外均有差異(Plt;0.05)；②單純夾閉組與視神經(jīng)夾閉損傷模型各治療組，1 d均有差異(Plt;0.05)，7 d、21 d除對(duì)照組假傷組均沒(méi)有顯著差異(Pgt;0.05)；③地塞米松組：1 d除對(duì)照組假傷組外均有差異 (Plt;0.05) ，且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；7 d、21 d(Pgt;0.05)；④單純減壓組：1 d除減壓地塞米松組、地塞米松組外均有顯著性差異；7 d、21 d除對(duì)照組假傷組均沒(méi)有顯著差異(Pgt;0.05)；⑤減壓地塞米松組：1 d除減壓地塞米松組、地塞米松組外均有差異(Plt;0.05)；7 d、21 d除對(duì)照組假傷組均沒(méi)有顯著差異(Pgt;0.05)。

3.Caspase-3陽(yáng)性細(xì)胞的檢測(cè)分組間的兩兩比較：①對(duì)照組在三個(gè)時(shí)間點(diǎn)之間視神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量沒(méi)有顯著差異(Pgt;0.05)；②假傷組三個(gè)時(shí)間點(diǎn)之間Caspase-3陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量沒(méi)有顯著差異(Pgt;0.05)；③地塞米松治療組Caspase-3陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量在1 d、7 d之間，1 d、21 d之間，7 d、21 d之間均有差異(Plt;0.05)；④減壓地塞米松治療組Caspase-3陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量在1 d、21 d之間7 d、21 d之間有差異(Plt;0.05)，1 d、7 d之間、對(duì)照沒(méi)有顯著差異(Pgt;0.05)；⑤單純減壓治療組視神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量在1 d、7 d之間1 d、21 d之間有差異(Plt;0.05)(表1)，21 d、7 d之間沒(méi)有顯著差異(Pgt;0.05)，且不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；⑥單純夾閉組Caspase-3陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量在1 d、21 d之間，1 d、7 d之間有差異(Plt;0.05)，7 d、21 d組之間沒(méi)有顯著差異(Pgt;0.05)。

三、討論

以往傳統(tǒng)觀點(diǎn)稱，一旦損傷成年動(dòng)物視神經(jīng)胞體或軸突，視神經(jīng)及視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞就將不可逆轉(zhuǎn)的損傷及死亡。視神經(jīng)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的白質(zhì)束的延伸部分，損傷后修復(fù)過(guò)程與周圍性神經(jīng)修復(fù)完全不同。防止傷后視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的繼發(fā)性凋亡是挽救外傷性視神經(jīng)病變患者視力的唯一途徑。

實(shí)驗(yàn)證實(shí)[3]盡管存在多種多樣的凋亡信號(hào)及反應(yīng)途徑，幾乎所有凋亡的啟動(dòng)及執(zhí)行過(guò)程中都需要蛋白質(zhì)的特異性酶切。Caspase是半胱氨酸蛋白酶家族的總稱，其在細(xì)胞凋亡的過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用。Caspases是多種細(xì)胞死亡啟動(dòng)和執(zhí)行的關(guān)鍵分子。在變性的RGC中直接檢測(cè)到了Caspase-3 被激活并證實(shí)使用Caspase-3 抑制劑、Caspases-9 抑制劑可阻止去軸索誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞死亡。本研究證實(shí)急性視神經(jīng)損傷可以促使Caspase-3陽(yáng)性表達(dá)上調(diào)，表明Caspase-3陽(yáng)性表達(dá)在視神經(jīng)損傷的神經(jīng)再生過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。

目前使用糖皮質(zhì)激素為主的藥物治療法和手術(shù)治療法是最常用的治療手段，視神經(jīng)管減壓術(shù)已成為目前主要的手術(shù)治療方法。McKerracher認(rèn)為視神經(jīng)損傷后會(huì)因視神經(jīng)管空間的限制，出現(xiàn)進(jìn)行性血液循環(huán)障礙和/或組織水腫，視神經(jīng)減壓術(shù)是解除直接壓迫，緩解神經(jīng)腫脹及血管痙攣，對(duì)于視神經(jīng)損傷有一定的療效；地塞米松對(duì)于視神經(jīng)損傷有著皮質(zhì)激素可通過(guò)其抗氧化作用減輕自由基對(duì)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的損傷而使水腫減輕，同時(shí)阻斷外傷性炎癥介質(zhì)及血管活性物質(zhì)的產(chǎn)[4,5]。

本研究結(jié)果顯示：地塞米松、手術(shù)減壓、地塞米松聯(lián)合手術(shù)減壓三種治療手段7 d、21 d結(jié)果無(wú)差異(Pgt;0.05)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示臨床上7 d內(nèi)運(yùn)用Caspase-3抑制劑或其他治療手段對(duì)阻止細(xì)胞凋亡死亡具有重要意義。但這一實(shí)驗(yàn)結(jié)果尚需進(jìn)一步的分析。

目前臨床上視神經(jīng)損傷程度是神經(jīng)恢復(fù)的決定因素。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)視神經(jīng)夾傷模型，觀察到Caspase-3在損傷視神經(jīng)及視網(wǎng)膜的表達(dá)，及各治療組對(duì)其表達(dá)在3個(gè)時(shí)間點(diǎn)的作用差異評(píng)價(jià)，對(duì)進(jìn)一步研究視神經(jīng)損傷機(jī)制具有一定的參考價(jià)值。

1Levkovitch-Verbin H, Dardik R, Vander S, et al. Mechanism of retinal ganglion cells death in secondary degeneration of the optic nerve [J]. Exp Eye Res, 2010, 91(2): 127-134.

2劉曉坤, 羅鋼, 趙平, 等. 重組人促紅細(xì)胞生成素對(duì)大鼠挫傷視神經(jīng)超微結(jié)構(gòu)的保護(hù)作用 [J]. 眼科新進(jìn)展, 2013, 33(3): 229-232.

3姜曉璇, 馬林昆, 曹霞. 視神經(jīng)損傷后基因治療技術(shù)的研究進(jìn)展 [J]. 中華實(shí)驗(yàn)眼科雜志, 2014, 32(8): 748-751.

4林鵬, 夏鷹, 金虎, 等. 經(jīng)顱視神經(jīng)管減壓術(shù)治療外傷性視神經(jīng)損傷 [J]. 中國(guó)微侵襲神經(jīng)外科雜志, 2014, 19(2): 77-78.

5黃旅黔, 王忠安, 朱康生, 等. 經(jīng)顱視神經(jīng)管減壓術(shù)治療外傷性視神經(jīng)損傷 [J]. 中華神經(jīng)外科疾病研究雜志, 2004, 3(5): 460-461.

1671-2897(2016)15-082-03

R 651

B

新疆維吾爾自治區(qū)自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(200821137)

林琳，主任醫(yī)師，E-mail：115128726@qq.com

*通訊作者：欒新平，主任醫(yī)師，E-mail：Luanxinping4324177@163.com

2014-09-12；

2015-08-20)