李文婷 耿文靜 姚開虎 史 偉 齊宇潔 沈敘莊

?

·論著·

新生兒重癥監(jiān)護病房新生兒鼻部金黃色葡萄球菌定植和菌株的分子特征

李文婷1,3耿文靜2,3姚開虎1史 偉1齊宇潔2沈敘莊1

目的 探討NICU患兒鼻部金黃色葡萄球菌(簡稱金葡菌)的定植情況及分離株的基因型和毒力特征。方法 采集NICU患兒的鼻拭子，分離培養(yǎng)金葡菌，采用頭孢西丁紙片法和mecA檢測鑒定甲氧西林耐藥金葡菌(MRSA)或敏感金葡菌(MSSA)；分析所有菌株MLST和spa分型，并對MRSA菌株進行SCCmec分型，采用PCR方法檢測pvl和sasX和21種超抗原毒力基因。結果 從429例鼻拭子標本分離出79株金葡菌，定植率18.4%，其中MRSA 22株(27.8%)。79株金葡菌共檢測出17種MLST型和29種spa型，最常見型分別為ST59(31.6%)和t437(22.8%)。22株MRSA最常見的SCCmec型為Ⅳa(81.8%)。ST59-Ⅳa-t437(63.6%)和ST188-t189(15.8%)分別是MRSA、MSSA最常見的流行克隆。最主要的毒力基因型為seb-sek-seq(10.1%)。MRSA株seb、sek、seq和pvl的攜帶率明顯高于MSSA株，而sei攜帶率明顯低于MSSA株。結論 NICU患兒鼻部金葡菌定植率較高，ST59-Ⅳa-t437和ST188-t189分別是MRSA、MSSA最常見的流行克隆；分離株毒力基因攜帶率較高，MRSA與MSSA菌株的毒力基因型存在差異。

金黃色葡萄球菌； 定植； 新生兒； 毒力； 基因型

金黃色葡萄球菌(簡稱金葡菌)具有共生菌和致病菌雙重特性，鼻前庭是金葡菌最主要的定植部位，而鼻腔定植也是金葡菌感染的高風險指標之一[1]，有報道顯示約80%的金葡菌感染起源于內源性定植菌株[2]。NICU集中收治的危重新生兒，常伴多種高危因素，加大了定植金葡菌感染的風險。本課題組前期收集金葡菌感染的臨床分離株，基因型和毒力分布研究顯示，MRSA感染株最主要基因型為ST59 -SCCmecⅣa-t437，毒力基因攜帶率高, 最常見的毒力基因組合為seb-sek-seq，但缺少兒童定植金葡菌的相關研究[3]。為了解NICU金葡菌的定植狀況及定植菌株的基因型和毒力特征，本研究從NICU患新生兒鼻部分離金葡菌，對菌株進行多位點序列分型、spa分型、葡萄球菌染色體盒分型以及19種腸毒素、2種剝脫毒素及pvl和sasX基因檢測，現(xiàn)報告如下。

1 方法

1.1 納入標準 ①2015年5月至12月首都醫(yī)科大學附屬北京兒童醫(yī)院(我院)NICU新生兒，②入我院24 h以內采集了鼻拭子標本行金葡菌分離培養(yǎng)。

1.2 排除標準 現(xiàn)存的或潛在的可能會影響鼻拭子的結果的疾病，重度呼吸窘迫和其他臨床醫(yī)師認定的因素。

1.3 采集鼻拭子標本方法和保存 新生兒平臥位狀態(tài)下，將棉簽拭子用無菌生理鹽水濕潤后伸入雙側鼻腔約1 cm接觸鼻黏膜，旋轉3 周后放入無菌轉運管。采集的鼻拭子標本于-20℃低溫貯藏，每5 d在冷凍狀態(tài)下轉運至我院微生物實驗室進行細菌分離培養(yǎng)。

1.4 金葡菌分離培養(yǎng)與甲氧西林敏感性檢測 通過菌落形態(tài)學、凝固酶試驗及nuc基因檢測對可疑菌落進行金葡菌鑒定，采用頭孢西丁紙片(30 Pg，Oxoid)法和mecA基因檢測篩查耐甲氧西林金葡菌(MRSA)。頭孢西丁紙片法按照CLSI(Clinical and Laboratory Standards Institute)2016年標準判定，抑菌環(huán)直徑≤21 mm為MRSA，>21 mm為甲氧西林敏感金葡菌(MSSA)。

1.5 DNA提取 采用硅膠模型TM 基因組DNA試劑盒(北京賽百盛基因技術有限公司)提取細菌基因組DNA，步驟按試劑盒說明書操作。

1.6 多位點序列分型 PCR擴增金葡菌7個管家基因(arcC、aroE、glpF、gmk、pta、tpi、yqil)。擴增引物參照Enright等[4]的設計。所得目的片段由北京天一輝遠生物技術有限公司進行測序。測序結果在多位點序列分型數(shù)據(jù)網(wǎng)站( http://saureus.mlst.net) 上比對等位基因的序列型別。

1.7 SCCmec及其亞型分型 多重PCR引物和反應體系參照Milheirico 和 Oliveira的設計[5]，每一SCCmec型產生特異的擴增模式。SCCmec Ⅳ菌株根據(jù)J1區(qū)的多樣性采用另一PCR引物進行亞型分型，分為Ⅳa、 Ⅳb、Ⅳc、 Ⅳd、 Ⅳg和 Ⅳh[6]。如菌株出現(xiàn)多余或缺少擴增片段時則定義為無法分型。SCCmec分型質控菌株由日本順天堂大學Teruyo Ito教授贈送。

1.8 spa分型 通過PCR擴增spa目的片段，上游引物SpaF: 5'-GACGATCCTTCAGTGAGCAAAG-3'; 下游引物SpaR: 5'-GCAGCAATTTTGTCAGCAGTAG-3'。擴增片段送北京天一輝遠生物技術有限公司測序，通過與spa分型數(shù)據(jù)庫(http://www.ridom.de/spaserver/)比對確定分型。

1.9 毒力基因檢測 參照Holtfreter[7]的實驗方法依次進行5組多重PCR反應，檢測分離菌株是否攜帶有19種腸毒素基因(sea～see、seg～ser、seu、tsst-1)和2種剝脫毒素基因(eta、etd),擴增引物序列和多重PCR分組見文獻[7]。質控菌株由德國Greifswald大學Br?ker教授饋贈。分別參照Lina[8]和Li等[9]設計PCR檢測pvl基因和sasX基因。PCR 產物在含溴乙啶的1.5% 的瓊脂糖凝膠中電泳，用凝膠成像儀觀察和保存擴增結果。

1.10 統(tǒng)計學分析 用SPSS19.0 軟件進行統(tǒng)計分析。率的比較用χ2檢驗或Fisher's 確切概率法。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 一般情況 符合本文納入和排除標準的新生兒429例，男262例，女167例，年齡生后1 h至28 d。每例新生兒取得1 份鼻拭子標本，429份鼻拭子標本分離到金葡菌79株，分離率為18.4%;男女新生兒分離率分別為14.5%(38/262)和24.6%(41/167)，差異有統(tǒng)計學意義(χ2=6.85 ，P<0.009);早期新生兒(1 h至7 d)分離率為7.3%(16/219),晚期新生兒(～28 d)分離率為30.0%(63/210)，差異有統(tǒng)計學意義(χ2= 36.75，P<0.001)。5～12月份分別分離金葡菌28.6%(6/21)、12.9(9/7O)、20.2%(18/89)、12.8%(5/39)、20.0%(12/60)、23.5%(12/51)、20.7%(12/58)和12.2(5/41)。

2.2 臨床資料 79例分離出金葡菌的新生兒入院時診斷，感染性疾病41例(51.9%)，其中敗血癥15例，肺炎12例，淋巴結炎、化膿性腦炎、淚囊炎各1例，其他感染11例；皮膚軟組織感染9例(11.4%)，其中蜂窩織炎和膿皰病各4例，葡萄球菌性燙傷樣皮膚綜合征1例；驚厥6例；黃疸5例；先天性疾病5例(先天性腎上腺皮質增多癥2例，先天性喉軟骨軟化病1例，新生兒腦血管畸形2例)；皮膚軟組織損傷、低血糖和新生兒腹瀉病各3例；咽下綜合征、新生兒缺血缺氧性腦病、休克和十二指腸側側吻合術后各1例。

2.3 基因型特征 79株金葡菌中MRSA 22株(27.8%)，MSSA 57株(72.2%)。MRSA均為mecA陽性，且頭孢西丁抑菌圈≤21mm，mecA檢測與頭孢西丁紙片法篩查結果一致。

79株金葡菌中多位點序列分型共17種，①MRSA菌株中序列型別59(19株)、22(1株)、398(1株)、630(1株)；②MSSA菌株中序列型別188(9株)、5(9株)、398(7株)、59(6株)、15(6株)、7(5株)、6(3株)、1(3株)、8(2株)、25(2株)、1281(2株)、20(1株)、121(1株)和2793(1株)。

79株金葡菌中spa型共有29種，①MRSA菌株中spa型別t437(15株)、t1751(2株)、t3523(2株)、t309(1株)、t034(1株)、t4549(1株); ②MSSA菌株中序列型別t189(9株) 、t571(7株)、t437(3株)、t701(3株)、t164(3株)、t002(3株)、t010(2株)、t084(2株)、t127(2株)、t163(2株)、t796(2株)、t803(2株)、t9101(2株)、t034(1株)、t078(1株)、t091(1株)、t227(1株)、t328(1株)、t393(1株)、t548(1株)、t867(1株)、t954(1株)、t948(1株)、t1425(1株)和t4911(1株),另有3株spa無法分型。

79株金葡菌中MRSA 22株均可明確SCCmec分型，分別為SCCmec Ⅳ(18株)、Ⅴ(3株)和Ⅲ(1株)型，其中SCCmec Ⅳ型全部為Ⅳa亞型。

綜合上述基因分型，MRSA最常見的流行克隆為ST59-Ⅳa-t437(63.6%，15/22)，MSSA最常見的流行克隆為ST188-t189(15.8%，9/57)。

2.4 毒力基因 表1顯示，檢測的19種腸毒素基因和2種剝脫毒素基因中，79例分離出金葡菌的新生兒中有68例(86.1%)至少攜帶一種毒力基因，未檢出see和tsst-1基因；在攜帶有毒力基因的68株菌株中發(fā)現(xiàn)了45種毒力基因組合，其中seb-sek-seq10.1% (8/79)，seq-sej和seb各5.1%(4/79)，pvl的陽性率為16.5%(13/79)，未檢測到sasX。

2.5 MRSA與MSSA菌株攜帶毒力基因的差異 表1顯示，MRSA和MSSA菌株毒力基因整體攜帶率分別為81.8%(18/22)和87.7%(50/57)，兩者主要的毒力基因分別是seq(63.6%，14/22)和sei(35.1%，20/57)。MRSA株seb、sek、seq和pvl的攜帶率明顯高于MSSA株(P<0.05)，而sei攜帶率明顯低于MSSA株(P<0.05)。sec、seh、sel、sen、seu、eta僅見于MSSA株。屬于seb-sek-seq超抗原基因型的菌株主要是MRSA，占75%。

3 討論

鼻前庭是金葡菌最主要的定植部位，約20%的成人鼻部有金葡菌的持續(xù)定植,30%有間歇定植[2]。鼻拭子培養(yǎng)對監(jiān)測NICU新生兒金葡菌定植的敏感性達70%～97%[10～12]。Seybold等[13]的研究中，3.5%的NICU新生兒存在鼻前庭MRSA定植，美國國家兒童醫(yī)療中心NICU連續(xù)4年的研究中MRSA定植率為5.6%[10]，鄭州大學第一附屬醫(yī)院2013年報道NICU金葡菌和MRSA定植率分別為21.1%和3.69%[14]。本研究中，429例NICU新生兒金葡菌的定植率為18.4%，MRSA定植率為5.1%，與國內、外NICU定植情況基本一致。Song等[10]報道顯示，30%的新生兒MRSA攜帶者住院期間發(fā)展為MRSA感染，金葡菌的定植不但可以引發(fā)自身感染，還可作為重要的傳染源在院內傳播，因而加強NICU細菌定植檢測是控制醫(yī)院感染的重要環(huán)節(jié)。

表1 毒力基因攜帶情況及MRSA與MSSA菌株間差異[n(%)]

注 1)Fisher檢驗

金葡菌的定植與年齡密切相關，新生兒易產生金葡菌定植[15,16]。Patel等[16]對≤6個月的嬰兒進行了金葡菌定植情況的持續(xù)研究顯示，1月齡定植率最高(25%)，6月齡僅12%。但目前還沒有對早期和晚期新生兒定植率的差異的報道，本研究顯示，晚期新生兒金葡菌定植率明顯高于早期新生兒(30.3%vs7.3%)，可能與晚期新生兒與外界接觸時間更長有關。值得注意的是，本研究中女新生兒定植率明顯高于男新生兒(24.6%vs14.5%)，而成人金葡菌定植的報道，男性定植率更高[17]。更多報道和研究顯示新生兒金葡菌定植率與性別不相關[10,12,14,18]。

前期有關中國大陸兒童金葡菌感染分離株分子特征的研究顯示，MRSA 主要ST型為ST59，而MSSA則主要為 ST88、ST25、ST7和ST188[19]。本研究中金葡菌最常見的ST型為ST59，MRSA與MSSA最常見的流行克隆分別為ST59-Ⅳa-t437和ST188-t189，與前期研究中感染分離株的主要ST型基本一致。值得注意的是，本研究未檢測到ST239，此ST型是醫(yī)院環(huán)境金葡菌的常見ST型。

人類以往的研究數(shù)據(jù)已經(jīng)表明超抗原基因參與金葡菌的定植[20]，本研究檢測了19種腸毒素、2種剝脫毒素基因及pvl、sasX在住院兒童定植菌中的分布情況。本課題組前期研究報道[21]88.9%的金葡菌攜帶毒力基因，最常見的依次為sek、seq和seb。本研究中，分離株攜帶率最高的超抗原為86.1%攜帶毒力基因，最常攜帶的毒力基因為seq、seb和seg，最主要的毒力基因型為seb-sek-seq，這與臨床感染分離株的特征基本一致。sasX主要存在于醫(yī)院環(huán)境內致病性的金葡菌中，而在健康人鼻腔內分離的金葡菌中sasX的陽性率僅為0.6%[22],本課題組前期研究中，中國兒童MRSA感染株的sasX攜帶率為10.7%[23]，約70%的sasX陽性菌株為ST239，本研究中MRSA分離株未檢測到sasX，推測與本地區(qū)流行的ST型有關。

攜帶者的早期篩查是金葡菌感染預防計劃的關鍵，并已在多地區(qū)展開實施[24～27]。中國臺灣Huang等[27]主動篩查NICU新生兒金葡菌定植情況并進行了莫匹羅星去定植治療，有效地降低金葡菌感染的發(fā)生率、病死率和相關醫(yī)療成本。中國大陸還沒有針對住院患兒金葡菌定植的主動監(jiān)測及定植兒童的干預規(guī)范，臨床有必要對此予以重視。

[1]Wertheim HF, Melles DC, Vos MC, et al. The role of nasal carriage in Staphylococcus aureus infections. Lancet Infect Dis, 2005, 5(12): 751-762

[2]Werttheim HF, Vos MC, Ott A, et al. Risk and outcome of nosocomial Staphylococcus aureus bacteraemia in nasal carriers versus non-carriers . Lancet, 2004, 364(9435): 703-705

[3]Li S, Ning X, Song W, et al. Clinical and molecular characteristics of community-acquired methicillin-resistant Staphylococcus aureus infections in Chinese neonates. APMIS Acta Pathol Microbiol Immunol Scand,2015,123: 28-36

[4]Enright MC, Day NP, Davies CE, et al. Multilocus sequence typing for characterization of methicillin-resistant and methicillin-susceptible clones of Staphylococcus aureus. J Clin Microbiol, 2000, 38(3): 1008-1015

[5]Milheirico C, Oliveira DC, de Lencastre H. Update to the multiplex PCR strategy for assignment of mec element types in Staphylococcus aureus. Antimicrob Agents Chemother, 2007, 51(9): 3374-3377

[6]Milheirico C, Oliveira DC, de Lencastre H. Multiplex PCR strategy for subtyping the staphylococcal cassette chromosome mec type IV in methicillin-resistant Staphylococcus aureus: 'SCCmec IV multiplex'. J Antimicrob Chemother, 2007,60(1): 42-48

[7]Holtfreter S, Grumann D, Schmudde M, et al. Clonal distribution of superantigen genes in clinical Staphylococcus aureus isolates. J Clin Microbiol, 2007,45, 2669-2680 [8]Lina G, Piemont Y, Godail-Gamot F, et al. Involvement of Panton-Valentine leukocidin-producing Staphylococcus aureus in primary skin infections and pneumonia. Clin Infect Dis, 1999, 29(5): 1128-1132

[9]Li M, Du X, Villaruz AE, et al. MRSA epidemic linked to a quickly spreading colonization and virulence determinant. Nat Med, 2012,18:816-819

[10]Song X，Perencevich E，Campos J，et al．Clinical and economic impact of methicillin-resistant Staphylococcus aureus colonization or infection on neonates in intensive care units．Infeet Control Hosp Epidemiol，2010,31(2):177-182

[11]Rosenthal A, White D, Churilla S, et al. Optimal surveillance culture sites for detection of methicillin-resistant Staphylococcusaureus in newborns. J Clin Microbiol, 2006,44(11):4234-4236

[12]Huang YC, Chou YH, Su LH, et al. Methicillin-resistant Staphylococcus aureus colonization and its association with infection among infants hospitalized in neonatal intensive care units. Pediatrics, 2006,118(2):469-474 [13]Seybold U，Halvosa JS，White N，et al．Emergence of and risk factors for methicillin-resistant Staphylococcus aureus of community origin in intensive care nurseries．Pediatrics,2008,122(5):1039-1046

[14]郭宏湘, 魏文金, 張茜,等. 新生兒重癥監(jiān)護病房耐甲氧西林金黃色葡萄球菌定植率和危險因素分析. 中華實用兒科臨床雜志, 2013, 28(10):752-755

[15]Sollid JU, Furberg AS, Hanssen AM, et al. Staphylococcus aureus: determinants of human carriage. Infect Genet Evol, 2014,21:531-541

[16]Patel JA, Alvarez-Fernandez P, Jennings K, et al. Factors affecting Staphylococcus aureus colonization of the nasopharynx in the first 6 months of life. Pediatr Infect Dis J, 2015, 34:826-830

[17]van Belkum A.Verkaik NJ, de Vogel CP, et al. Reclassification of Staphylococcus aureus nasal carriage types. J Infect Dis, 2009,199(12):1820-1826

[18]Peacock SJ, Justice A, Griffiths D, et al. Determinants of acquisition and carriage of Staphylococcus aureus in infancy . J Clin Microbiol, 2003, 41: 5718- 5725

[19]Qiao Y, Ning X, Chen Q, et al. Clinical and molecular characteristics of invasive community-acquired Staphylococcus aureus infections in Chinese children. BMC Infect Dis, 2014,14(1):582

[20]Xu SX, Kasper KJ, Zeppa JJ, et al. Superantigens modulate bacterial density during staphylococcus aureus nasal colonization. Toxins,2015,7:1821-1836

[21]Wu D, Li X, Yang Y, et al. Superantigen gene profiles and presence of exfoliative toxin genes in community-acquired meticillin-resistant Staphylococcus aureus isolated from Chinese children. J Med Microbiol,2011,60(Pt 1):35-45

[22]杜昕,宋燕,田月如. 新的細胞壁錨定蛋白編碼基因sasX在金黃色葡萄球菌中的分布.中華檢驗醫(yī)學雜志, 2011,34(12):1093-1097

[23]Li S, Sun J, Zhang J, et al. Comparative analysis of the virulence characteristics of epidemic methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) strains isolated from Chinese children: ST59 MRSA highly expresses core gene-encoded toxin. APMIS, 2014,122:101-114

[24]Victor O. Popoola, Elizabeth Colantuoni, et al. Active Surveillance Cultures and Decolonization to Reduce Staphylococcus aureus Infections in the Neonatal Intensive Care Unit. Infection Control & Hospital Epidemiology,201,37: 381-387

[25]Lamy Filho F, de Sousa SH, Freitas IJ, et al. Effect of maternal skin-to-skin contact on decolonization of Methicillin-Oxacillin-Resistant Staphylococcus in neonatal intensive care units: a randomized controlled trial. BMC Pregnancy Childbirth,2015,15:63

[26]You JH, Chan CY, Wong MY, et al. Active surveillance and decolonization of methicillin-resistant Staphylococcus aureus on admission to neonatal intensive care units in Hong Kong: a cost-effectiveness analysis. Infect Control Hosp Epidemiol, 2012,33:1024-1030

[27]Huang YC, Lien RI, Lin TY. Effect of mupirocin decolonization on subsequent methicillin-resistant Staphylococcus aureus infection in infants in neonatal intensive care units.Pediatr Infect Dis J, 2015,34(3):241-245

(本文編輯：張崇凡)

Nasal carriage and molecular characteristics of Staphylococcus aureus isolates from neonates in neonatal intensive care unit

LI Wen-ting1,3, GENG Wen-jing2,3, YAO Kai-hu1, SHI Wei1, QI Yu-jie2, SHEN Xu-zhuang1

(1 Beijing Children′s Hospital, Capital Medical University，Beijing Pediatric Research Institute，National Key Subjects of Pediatrics，Key Laboratory of Major Disease of the Ministry of Education, Beijing 100045; 2 Department of Neonatology, Beijing Children′s Hospital, Capital Medical University, Beijing 100045, China；3 Co-first author)

SHEN Xu-zhuang，E-mail:xuzhuangshen@163.com

Objective To investigate the nasal carriage rate and molecular characteristics ofStaphylococcusaureus(S. aureus) isolates among neonates in neonatal intensive care unit(NICU) of Beijing Children's Hospital.MethodsSurveillance of nasal swabs from neonates were conducted in NICU of Beijing Children's Hospital from May to December of 2015.Bacterial culture was performed.Methicillin-resistantStaphylococcusaureus(MRSA) and Methillin-susceptibleStaphylococcusaureus(MSSA) were identified by cefoxitin disc diffusion and detection of mecA.Isolates were analyzed by MLST,SCCmec,spa typing ,followed by detection ofpvl，sasXand 21 toxin genes by PCR.ResultsSeventy-nine (18.4%) of 429 neonates had nasal carriage of S. Aureus. MRSA accounted for 27.8% .17 sequence types and 29 spa types were detected and the most frequent types were ST59(31.6%)and t189 (22.8%) respectively. The most common SCCmec type was Ⅳa (81.8%)among 22 MRSA strains. ST59-Ⅳa-t437(63.6%) and ST188-t189 (15.8%) were the most common clones of MSSA and MRSA, respectively. Of 79 isolates,seb-sek-seq(10.1%) was the most common virulence genotypes.seb、sek、seqandpvlgene were more associated with MRSA than with MSSA ,whileseigene was more associated with MSSA.ConclusionThe nasal carriage rate of S. aureus was high among neonates in NICU of Beijing Children's Hospital. ST59-Ⅳa-t437 and ST188-t189 were the most common clones of MSSA and MRSA. The rate of toxin genes in carriage strains of S. aureus was high, and visible differences existed between MRSA and MSSA strains.

Staphylococcusaureus; Carriage; Neonates; Toxin; Genotype

國家自然科學基金資助項目: 81171648，81061160509；北京市優(yōu)秀人才青年骨干個人資助項目:2014000021469g243；首都醫(yī)科大學附屬北京兒童醫(yī)院第二批臨床-科研復合型人才苗圃計劃項目:BCHYIPB-2016-05

1 首都醫(yī)科大學附屬北京兒童醫(yī)院、北京市兒科研究所，兒科學國家重點學科，教育部兒科重大疾病研究重點實驗室，國家呼吸系統(tǒng)疾病臨床醫(yī)學研究中心，兒童呼吸道感染性疾病研究北京市重點實驗室；2 首都醫(yī)科大學附屬北京兒童醫(yī)院新生兒中心；北京 100045；3 共同第一作者

沈敘莊，E-mail: xuzhuangshen@163.com

10.3969/j.issn.1673-5501.2016.05.010

2016-07-30

2016-09-30)