梵凈山藤茶水提取物藥效學(xué)初步研究

康超+王芳+劉盈盈+秦華軍+席培宇+賈強(qiáng)

摘要：為研究梵凈山藤茶水提取物（AGWE）對乙醇性肝損傷、血脂、血糖、血壓的影響，通過構(gòu)建急性毒性乙醇性肝損傷模型，考察不同劑量濃度的AGWE對小鼠的預(yù)防作用和SD大鼠肝損傷的保護(hù)作用，檢測試驗動物的死亡率、血清中天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（AST）和丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（ALT）水平；通過構(gòu)建高血脂大鼠模型和四氧嘧啶構(gòu)建糖尿病模型，經(jīng)口灌胃AGWE，檢測動物模型血清總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）和血糖水平；制備大鼠胸動脈離體血管環(huán)，檢測AGWE 對血管環(huán)的舒張作用。結(jié)果表明，AGWE降低了小鼠對乙醇致死的死亡率，增強(qiáng)了小鼠對乙醇急性毒性的耐受性；灌胃不同劑量的AGWE，可明顯降低大鼠血清中ALT、AST水平，且呈劑量依賴；能顯著降低血清TC、TG、葡萄糖水平（P<0.05），可以減少血管的收縮作用，使血管舒張。AGWE對乙醇性肝損傷、高血脂、高血糖、高血壓均具有良好的保護(hù)作用。

關(guān)鍵詞：藤茶水提物；乙醇性肝損傷；血脂；血糖；血壓

中圖分類號： R284.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號：1002-1302（2016）09-0260-04

藤茶別稱端午茶、藤婆茶、山甜茶、龍須茶、白茶、甘露茶、白毛猴等，系葡萄科蛇葡萄屬顯齒蛇葡萄[Ampelopsis grossedentata（Hand-Mazz） W.T.Wang]的嫩莖葉，主要分布于湖南、湖北、云南、貴州、廣東、廣西、福建等地[1]。藤茶中含有多種化學(xué)物質(zhì)，如黃酮類、酚類、苷類、蛋白質(zhì)、氨基酸等[1-3]，此外，還包括烷烴類、醛類、有機(jī)酸、醇類及甾醇類等多種揮發(fā)性物質(zhì)[4]。研究表明，藤茶及其提取物具有抗菌消炎[5-7]、抗腫瘤[8-10]、抗氧化[11-12]、降血糖[13-15]、降血脂[16-18]、保肝護(hù)肝[19-20]等作用。梵凈山位于貴州東北部，擁有同緯度地區(qū)保存最完好的亞熱帶原始森林，屬亞熱帶山地濕潤季風(fēng)氣候區(qū)，動植物資源豐富，擁有豐富而優(yōu)質(zhì)的野生藤茶資源。然而，關(guān)于梵凈山藤茶的藥理功效卻未見報道。本研究首次報道梵凈山野生藤茶提取物對血脂、血糖、血壓的影響，探討了梵凈山藤茶的藥理學(xué)作用，為梵凈山藤茶的合理利用和產(chǎn)品開發(fā)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 受試物

梵凈山野生藤茶，采集自貴州省梵凈山自然保護(hù)區(qū)的野生藤茶。

1.2 試驗動物

NIH小鼠（批號：44007200006820），雌雄各半，清潔級標(biāo)準(zhǔn)，體質(zhì)量18～22 g，由廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心提供。SD大鼠[批號：SCXK-（粵）2008-0002]，雄性，清潔級標(biāo)準(zhǔn)，體質(zhì)量180～220 g，由廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心提供。Wistar大鼠[批號：SCXK-（粵）2008-0002]，雄性，體質(zhì)量223.7～276.3 g，清潔級標(biāo)準(zhǔn)，共40只，由廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心提供。

1.3 試劑和儀器

試劑：99.7%乙醇（分析純，杭州長征化工廠，批號：20100302）、聯(lián)苯雙酯滴丸（北京協(xié)和藥廠）、地奧心血康（成都地奧制藥集團(tuán)有限公司）、四氧嘧啶（美國Sigma公司）、鹽酸二甲雙胍（貴州天安藥業(yè)有限責(zé)任公司）、普萘洛爾（山西云鵬制藥有限公司）、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（AST）和丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（ALT）試劑盒均購自南京建成生物工程研究所，自動生化分析儀（日立7100）、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（壹葉3100）、BL-420E生物機(jī)能實驗系統(tǒng)（成都泰盟科技有限公司），其他均為常規(guī)試劑和儀器。

1.4 方法

1.4.1 AGWE制備 將采集的梵凈山藤茶的嫩枝葉粉碎，熱水提取3次，合并濾液，濃縮成浸膏。給藥時蒸餾水溶解為目的給藥劑量，分別相當(dāng)于生藥200 mg/kg體質(zhì)量和2 000 mg/kg 體質(zhì)量。

1.4.2 動物分組及胸動脈離體血管環(huán)制備 （1）乙醇急性毒性學(xué)試驗：將NIH小鼠隨機(jī)分成5組，每組10只。

（2）乙醇急性毒性的預(yù)防試驗：將NIH小鼠隨機(jī)分成5組，即空白對照、乙醇對照組和AGWE低、中、高劑量組，每組10只。

（3）乙醇致肝損傷保護(hù)作用：將SD大鼠隨機(jī)分成6組，即空白對照、陰性對照、陽性對照和AGWE低、中、高3個劑量組，每組10只。

（4）降血脂試驗：將SD大鼠（雌雄各半）隨機(jī)分成4組，即空白對照、模型組、陽性對照組和AGWE組，每組10只。除空白組外，其余組別SD大鼠連續(xù)給予高脂飼料（基礎(chǔ)飼料87.3%、膽固醇2%、膽鹽0.5%、豬油10%、甲基硫氧嘧啶0.2%[21]）14 d，空白組給予基礎(chǔ)飼料。隨機(jī)抽取每組30%的動物眼球后血管叢取血，檢測血清總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）水平，確定動物模型。

（5）降血糖試驗：將NIH小鼠隨機(jī)分成4組，即空白對照、模型組、陽性對照和AGWE組，每組10只。將四氧嘧啶溶于生理鹽水溶液中，配制為72 mg/kg。通過NIH小鼠尾靜脈注射四氧嘧啶（72 mg/kg）生理鹽水溶液，72 h后檢測血清葡萄糖水平，以血糖值大于16 mmol/L作為造模成功標(biāo)準(zhǔn)。

（6）胸動脈離體血管環(huán)制備：Wistar大鼠斷頭處死，開胸迅速取出胸主動脈，置于預(yù)先用混合氣體（95% O2和5% CO2）飽和的4 ℃的K-H溶液中，沖洗至無血跡，去除外周的脂肪組織和結(jié)締組織，剪成2～3 mm長的血管環(huán)，將血管環(huán)置于盛有10 mL的K-H溶液（37 ℃恒溫，并持續(xù)通入95% O2和5% CO2的混合氣體，pH值=7.4）的恒溫套瓶中。每一根血管環(huán)用2個三角型掛鉤貫穿血管環(huán)管腔，一端固定，另一端連接于張力傳感器，張力變化由BL-420E生物機(jī)能實驗系統(tǒng)采集并記錄。血管環(huán)加靜息張力2 g左右，穩(wěn)定90 min，期間每15 min用預(yù)溫至37 ℃的K-H溶液更換液體，使血管環(huán)完全穩(wěn)定。

1.4.3 試驗方法 （1）乙醇急性毒性學(xué)試驗：每組試驗動物，分別灌胃不同劑量的乙醇1次，記錄死亡數(shù)，并計算死亡率和半數(shù)致死劑量。

（2）乙醇急性毒性的預(yù)防試驗：NIH大鼠隨機(jī)分組后，每組給予半數(shù)致死量乙醇的同時給藥。樣品組給予不同劑量的AGWE（50、100、200 mg/mL），空白組和模型組給予等體積生理鹽水，記錄死亡數(shù)，并計算死亡率。

（3）乙醇致肝損傷保護(hù)作用：SD大鼠隨機(jī)分組后，陽性對照組腹腔注射聯(lián)苯雙酯滴丸（0.2 g/kg），樣品組腹腔分別注射AGWE低、中、高劑量（400、1 000、2 000 mg/kg），空白對照和模型組腹腔分別注射等體積生理鹽水。1次/d，連續(xù)給藥10 d，分別于第5、9天給藥1 h后腹腔注射乙醇溶液（3 mL/kg），空白組注射等體積生理鹽水，并于第10天給藥4 h 后眼眶取血1 mL，3 000 r/min離心10 min，檢測血清中ALT、AST含量。

（4）降血脂試驗：高脂飼料飼養(yǎng)第15天開始給藥，各試驗動物組分別經(jīng)口灌胃給藥。樣品供試組給藥AGWE（2 000 mg/kg），陽性對照組給藥地奧心血康（30 mg/kg），模型組和空白對照給予等體積生理鹽水，1次/d，連續(xù)給藥28 d（末次給藥后，禁食不禁飲8 h）。所有動物經(jīng)眼球后血管叢采血，取血清檢測血脂水平。

（5）降血糖試驗：陽性對照組給藥鹽酸二甲雙胍（150 mg/kg），樣品供試組給藥AGWE （200 mg/kg），對照組和模型組給予等體積生理鹽水，1次/d，連續(xù)7 d。于末次給藥后1 h，小鼠眼眶靜脈叢取血測定血糖水平。

（6）降血壓試驗：先制備胸動脈離體血管環(huán)，待立體血管環(huán)穩(wěn)定后，用60 mmol/L的KCl重復(fù)刺激3次，誘發(fā)血管的最大收縮幅度，連續(xù)3次同樣的刺激，使血管收縮幅度<10%時，以此作為100%收縮張力。陽性藥物組給藥普萘洛爾（0.10 mg/kg），樣品供試組給藥AGWE（2 000 mg/kg），對照組給予體積60 mmol/L的KCl溶液。記錄不同藥物下血管環(huán)的張力變化，并計算舒張率，公式如下：

舒張率=加受試藥后張力-加受試藥前張力藥物刺激后張力-藥物刺激前張力×100%。

1.5 數(shù)據(jù)分析和處理

數(shù)據(jù)采用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理，結(jié)果取平均值，以x[TX-*5]±s表示，采用t檢驗進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 AGWE解酒護(hù)肝作用

2.1.1 乙醇急性毒性學(xué)試驗 為研究乙醇對小鼠的急性毒性作用，分別給予不同劑量的乙醇1次，其死亡數(shù)和死亡率見表1。從表1可以看出，隨著劑量的增加，死亡率逐漸上升。當(dāng)乙醇劑量增加到12.46 g/kg時，死亡率達(dá)到100%。根據(jù)數(shù)據(jù)及半數(shù)致死量（LD50）的計算方法得出乙醇對小鼠的LD50為10.11 g/kg。

2.1.2 AGWE對乙醇急性毒性的預(yù)防試驗 為考察不同AGWE濃度對乙醇急性毒性的預(yù)防作用，每組試驗動物給予半數(shù)致死量乙醇的同時給予AGWE低、中、高劑量（分別相當(dāng)于生藥量50、100、200 mg/mL），結(jié)果見表2。從表2可以看出，隨著AGWE濃度的增加，小鼠死亡率逐漸降低，從乙醇組的60%下降到AGWE高劑量組的20%，死亡率降低了66.7%，揭示AGWE增強(qiáng)了小鼠對乙醇急性毒性的耐受性。

2.1.3 AGWE對乙醇致肝損傷的保護(hù)作用 分別考察不同劑量的AGWE對乙醇致肝損傷的保護(hù)作用，結(jié)果見表3。從表3可以看出，與空白組比較，模型組血清中ALT、AST含量顯著升高（P<0.01），揭示化學(xué)性肝損傷造模成功。與模型組比較，AGWE各劑量組和聯(lián)苯雙酯滴丸可顯著降低大鼠血清中ALT含量（P<0.05）。AGWE中，高劑量和聯(lián)苯雙酯滴丸可顯著降低大鼠血清中AST含量（P<0.05）。其中，AGWE 高劑量組對血清中ALT、AST作用與聯(lián)苯雙酯滴丸組相當(dāng)，說明該提取物對乙醇性肝損傷具有明顯的保護(hù)作用。此外，隨著提取物劑量的逐漸增加，血清中ALT、AST含量逐漸減少，表明AGWE對乙醇性肝損傷的保護(hù)作用呈劑量依賴。

2.2 藤茶提取物對血脂的影響

連續(xù)給藥28 d后，眼球后血管叢采血檢測血脂水平，結(jié)果見表4。從表4可以看出，地奧心血康和AGWE（2 000 mg/kg）2個組的總膽固醇和甘油三酯水平顯著低于模型組（P<0.05）。此外，藤茶水提取物組的膽固醇水平顯著低于地奧心血康組（P<0.05），對甘油三酯的影響，兩者之間無顯著性差異。結(jié)果表明，AGWE能明顯地降低膽固醇和甘油三酯水平，且優(yōu)于地奧心血康。

2.3 藤茶水提取物對血糖的影響

連續(xù)給藥7 d后，小眼眶靜脈叢取血測定小鼠血糖水平，結(jié)果見表5。從表5可以看出，AGWE（200 mg/kg）和鹽酸二甲雙胍2個組的血糖水平明顯低于模型組血糖水平（P<0.05），兩者之間無顯著性差異。結(jié)果表明，AGWE能明顯降低小鼠血糖水平，與鹽酸二甲雙胍效果相當(dāng)。

2.4 藤茶水提取物對血壓的影響

當(dāng)大鼠胸動脈離體血管環(huán)處于最大收縮張力時（收縮幅度<10%），用普萘洛爾和AGWE（2 000 mg/kg）分別對血管環(huán)進(jìn)行刺激，記錄血管舒張幅度并計算舒張率，結(jié)果見表6。從表6可以看出，在普萘洛爾和AGWE的刺激下，處于緊張的血管環(huán)明顯舒張，其舒張率分別為（114.31±13.87）%和（103.23±12.31）%，與對照組比較，兩者能明顯減輕收縮幅度（P<0.01）。普萘洛爾和AGWE對血管有舒張作用，兩者之間無顯著性差異。結(jié)果表明，AGWE具有明顯降血壓作用，與普萘洛爾效果相當(dāng)。

3 討論

本試驗研究了藤茶水提取物對乙醇性肝病、“三高”、抗炎癥等作用。乙醇性肝病是我國常見的肝臟疾病之一，是由長期大量飲酒導(dǎo)致的，嚴(yán)重危害人的健康。初期通常表現(xiàn)為脂肪肝，進(jìn)而可發(fā)展成乙醇性肝炎、肝纖維化和肝硬化。嚴(yán)重酗酒時可誘發(fā)廣泛肝細(xì)胞壞死，甚至肝功能衰竭。本研究通過灌胃乙醇建立大鼠急性毒性肝損傷模型，觀察藤茶水提物對乙醇性肝損傷的保護(hù)作用。表明藤茶水提取物增強(qiáng)了小鼠對乙醇急性毒性的耐受性，明顯降低了大鼠血清中ALT、AST含量，與之前研究結(jié)果一致[19-20，22]。乙醇在肝臟代謝過程中可產(chǎn)生大量的活性氧自由基（如OH-、O-2、H2O2）導(dǎo)致生物膜發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，引起膜的流動性和通透性發(fā)生改變，最終導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的損壞[23]；另一方面，產(chǎn)生的脂質(zhì)過氧化物——丙二醛（MDA）可以與蛋白質(zhì)、核酸（DNA、RNA）等大分子化合物交聯(lián)，導(dǎo)致細(xì)胞和胞內(nèi)細(xì)胞器代謝及功能障礙，甚至死亡[24]。AST主要分布于胞漿和線粒體，是一種線粒體酶，極易受到乙醇的影響[24]。梵凈山藤茶水提取物能明顯降低血清中AST水平，揭示了藤茶水提取物具有清除肝臟代謝過程中氧自由基，防止生物膜發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的功能，從而達(dá)到保肝護(hù)肝的作用。

“三高”即高血脂、高血糖和高血壓的簡稱，是導(dǎo)致心血管疾病的直接因素。如何有效控制高血脂、高血糖、高血壓的發(fā)生，對心腦血管疾病的防治有著深遠(yuǎn)的意義。體質(zhì)量指數(shù)（BMI）升高所致心血管風(fēng)險部分由高血壓、高血脂和高血糖介導(dǎo)，降低血壓、血脂和血糖可使BMI升高引起的冠心病和卒中額外風(fēng)險分別減少一半和3/4[25]。研究表明，藤茶總黃酮能降低血清TC、TG、LDL-C含量，減少肝系數(shù)和apoB/apoA比值，提高血清HDL-C含量[17-18]，且能降低陰虛小鼠血糖和饑餓小鼠肝糖原水平，增加胰島素抗性[26]，能降低大鼠血糖值，改善血脂，升高胰島素水平，并減輕胰島細(xì)胞的損傷[15]。結(jié)果表明，梵凈山藤茶水提取物能明顯降低試驗型血脂、血糖水平，達(dá)到降血脂、血糖的效果，與之前研究結(jié)果一致，同時揭示其具有潛在的減肥功效。此外，本試驗研究了藤茶水提物對大鼠胸腔離體血管環(huán)的影響，表明藤茶水提取物能緩解由KCl刺激的血管緊張作用，表現(xiàn)了良好的降壓效果。

本研究僅涉及水提取物的藥效作用，對乙醇性肝損傷和“三高癥”均有良好的效果，但對其具體的活性成分和作用機(jī)制尚未研究。藤茶含有多種化學(xué)成分，其中總黃酮的含量可達(dá)40%[27]，其保肝護(hù)肝、抗“三高”可能體現(xiàn)在黃酮類化合物上，其活性成分的篩選和藥理作用機(jī)制有待后續(xù)研究?？傊?，梵凈山具有獨特的氣候環(huán)境，擁有豐富、優(yōu)質(zhì)的野生藤茶資源，其藥理活性的研究可為梵凈山藤茶保健飲品和藥用開發(fā)提供依據(jù)。

參考文獻(xiàn)：

[1]羅祖友，付曉芳，吳謀成. 藤茶的研究進(jìn)展[J]. 食品科學(xué)，2005，26（8）：513-517.

[2]Du Q Z，Chen P，Jerz G，et al. Preparative separation of flavonoidglycosides in leaves extract of Ampelopsis grossedentata usinghigh-speed counter-current chromatography[J]. Journal of Chromatography A，2004，1040（1）：147-149.

[3]Wang D Y，Zheng Z Z，Xu S Y，et al. Four new isoflavones fromAmpelopsis grossedentata[J]. Journal of Asian Natural ProductsResearch，2002，4（4）：303-308.

[4]郁浩翔，郁建平. 貴州梵凈山藤茶及其近緣種廣東蛇葡萄揮發(fā)性成分比較[J]. 山地農(nóng)業(yè)生物學(xué)報，2012，31（6）：557-560.

[5]曾春暉，楊 柯，徐明光，等. 廣西藤茶總黃酮對金黃色葡萄球菌抗菌機(jī)制研究[J]. 中國實驗方劑學(xué)雜志，2013，19（10）：249-252.

[6]祁 佳，李莉霞，卜書紅，等. 藤茶提取物清咽抗炎作用及其機(jī)制的研究[J]. 貴陽中醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2013，35（1）：19-21.

[7]陳 帥，郁建平. 藤茶總黃酮抗炎及抑菌作用的實驗研究[J]. 貴陽中醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2013，35（1）：1-3.

[8]周春權(quán)，姚 欣，陳曉明，等. 藤茶提取物的抗腫瘤作用研究[J]. 中藥新藥與臨床藥理，2011，22（6）：640-642.

[9]鄭作文，郭成賢，毛 健，等. 藤茶總黃酮對人胃癌SGC-7901細(xì)胞增殖抑制作用的實驗研究[J]. 時珍國醫(yī)國藥，2009，20（5）：1158-1159.

[10]李 剛，鄭作文，唐云麗. 藤茶總黃酮體外抗人肝癌細(xì)胞作用研究[J]. 中國藥房，2008，19（9）：652-654.

[11]肖 浩，鄭小江，朱玉婷. 藤茶多酚體外抗氧化作用[J]. 食品與生物技術(shù)學(xué)報，2011，30（5）：679-682.

[12]Wang Y F，Bian X Y，Park J，et al. Physicochemical properties，in vitro antioxidant activities and inhibitory potential againstα-glucosidase of polysaccharides from Ampelopsis grossedentata leaves and stems[J]. Molecules，2011，16（9）：7762-7772.

[13]鐘正賢，覃潔萍，周桂芬，等. 廣西藤茶總黃酮降血糖的實驗研究[J]. 中國中藥雜志，2002，27（9）：687-689.

[14]李玉山，李 田，戴清堂，等. 藤茶茶多糖對實驗性糖尿病大鼠血糖的影響[J]. 營養(yǎng)學(xué)報，2006，28（4）：356-357，360.

[15]鐘正賢，周桂芬，陳學(xué)芬，等. 藤茶總黃酮對鏈脲霉素所致糖尿病大鼠的降糖作用[J]. 中藥藥理與臨床，2003，19（5）：19-20.

[16]劉翠娥，王海玉，王亞東，等. 藤茶輔助降血脂作用的研究[J]. 食品科學(xué)，2005，26（11）：237-241.

[17]李玉山，譚志鑫，李 田，等. 藤茶對大鼠高血脂和心肌酶的影響[J]. 營養(yǎng)學(xué)報，2006，28（6）：506-509.

[18]陳玉瓊，倪德江，程 倩，等. 藤茶總黃酮及二氫楊梅素降血脂作用研究[J]. 茶葉科學(xué)，2007，27（3）：221-225，242.

[19]鄭潔靜，續(xù)潔琨，江 濤，等. 藤茶總黃酮對拘束負(fù)荷引起小鼠肝損傷的保護(hù)作用[J]. 中國藥理學(xué)通報，2006，22（10）：1249-1253.

[20]鐘正賢，周桂芬，陳學(xué)芬，等. 廣西藤茶中雙氫楊梅樹皮素保肝作用的實驗研究[J]. 中國中醫(yī)藥科技，2002，9（3）：155-156.

[21]劉建文. 藥理實驗方法學(xué)——新技術(shù)與新方法[M]. 2版.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2008：259.

[22]鐘正賢，覃潔萍，周桂芬，等. 廣西藤茶總黃酮保肝作用的實驗研究[J]. 廣西科學(xué)，2002，9（1）：57-59，63.

[23]周曉娟，王 超. 槲皮素對大鼠慢性酒精性肝損傷的保護(hù)作用[J]. 長江大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)版，2013，10（33）：8-10.

[24]徐迪波. 生姜乙醇提取物干預(yù)小鼠酒精性肝損傷及相關(guān)抗氧化活性研究[D]. 揚州：揚州大學(xué)，2010.

[25]Lu Y，Hajifathalian K，Ezzati M，et al. Metabolic mediators of the effects of body-mass index，overweight，and obesity on coronary heart disease and stroke：a pooled analysis of 97 prospective cohorts with 1.8 million participants[J]. The Lancet，2014，383：970-983.

[26]鐘正賢，周桂芬，陳學(xué)芬，等. 藤茶總黃酮藥理作用的實驗研究[J]. 中國中醫(yī)藥科技，2004，11（4）：224-225.

[27]何桂霞，裴 剛，周天達(dá). 顯齒蛇葡萄中總黃酮和二氫楊梅素的含量測定[J]. 中國中藥雜志，2000，25（7）：423-425.