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      荷葉總黃酮對H2O2誘導PC12細胞損傷的保護作用

      2016-11-28 15:25:29吳磊司傳領陳銘薛琪羅海青朱翠玲
      江蘇農業(yè)科學 2016年9期
      關鍵詞:羰基荷葉存活率

      吳磊+司傳領+陳銘+薛琪+羅海青+朱翠玲+胡衛(wèi)成+王毓寧

      摘要:為了探討荷葉總黃酮對H2O2誘導的PC12細胞損傷的保護作用及機制,建立以H2O2誘導大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤細胞(PC12)為氧化應激損傷模型,通過四甲基偶氮唑鹽(MTT)比色法檢測正常細胞的存活率與損傷程度,用試劑盒測定不同濃度荷葉總黃酮對H2O2刺激PC12細胞中超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)活力、丙二醛(MDA)、蛋白質羰基含量的影響并檢測Caspase-3活力的變化;Real Time PCR檢測胞漿內Bcl-2與Bax的基因mRNA 的表達。結果表明荷葉總黃酮能顯著提高H2O2損傷的PC12細胞存活率,顯著減少H2O2刺激的PC12細胞中MDA與蛋白質羰基的生成,顯著提高CAT活性,但對提高SOD活性不顯著。PC12細胞損傷可增加凋亡相關蛋白Bax mRNA的表達,加入荷葉總黃酮后有降低作用;同時H2O2使Bcl-2 mRNA的表達降低,加入荷葉總黃酮后有提高作用。荷葉總黃酮在給藥濃度較低的情況下,對H2O2損傷的PC12細胞發(fā)揮著明顯的保護作用,其作用機制可能與抑制線粒體途徑的細胞凋亡有關。

      關鍵詞:荷葉總黃酮;氧化應激;過氧化氫(H2O2);PC12細胞;Caspase-3活力

      中圖分類號: R284.1 文獻標志碼: A

      文章編號:1002-1302(2016)09-0272-04

      神經系統(tǒng)疾病(阿爾茨海默病、帕金森病和中風)的病理機制大多是由于氧化應激損傷神經元細胞造成的[1]。眾所周知,生物體在維持生命活動時,會產生必要的氧自由基,但是過量的氧自由基在體內堆積往往會造成脂質過氧化、蛋白質和DNA的氧化,以及防御系統(tǒng)如SOD、CAT和GPX等變化,這就會加速細胞的損傷或死亡。由于腦神經細胞膜通透性較高且富含多種不飽和脂肪酸,其氧代謝率極高,最終就會引起其抗氧化能力差,因此腦組織更易遭受自由基的損傷。尋找具有抗氧化應激作用的天然藥物對于治療神經系統(tǒng)疾病具有重要的臨床意義[2-4]。目前神經元細胞模型的建立大多采用大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤細胞(PC12)損傷模型,這是因為PC12細胞無論在形態(tài)、結構和功能上,都具有與神經元細胞相似的諸多特征,且能與原代培養(yǎng)的神經細胞說明一致的問題[5]。

      荷葉為睡蓮科多年生水生草本植物蓮(Nelumbo nucifera Gaertn.)的葉子。先前的研究表明,荷葉在食用和藥用兩方面都具有較廣泛的應用,尤其作為一種減肥茶深受人們的喜愛,荷葉含有的黃酮類化合物為其主要的有效成分。荷葉總黃酮在生命現(xiàn)象中參與多種細胞活動,對其研究多集中在荷葉黃酮具有降脂減肥、抗自由基、抗氧化、抑菌、抗病毒、防衰老等多種生理活性上[6-10],對其神經系統(tǒng)的保護作用未見報道。本研究以H2O2誘導的PC12細胞為模型,研究荷葉總黃酮對PC12細胞抗凋亡效果,探討荷葉總黃酮在氧化損傷相關疾病,如AD治療中應用的可能性,為更好地開發(fā)利用荷葉資源提供試驗依據(jù)。

      1 材料與方法

      1.1 材料

      荷葉于2013年采摘于江蘇省金湖縣,經中國醫(yī)學科學院藥用植物研究所吳海峰博士鑒定為睡蓮科植物蓮(Nelumbo nucifera Gaertn.)上的葉。

      原大鼠腎上腺髓質嗜鉻細胞瘤細胞株PC12細胞,購買于美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC);RPMI-1640培養(yǎng)基、馬血清、胎牛血清購于Gibco公司;二甲基亞砜、臺盼藍、甲氮甲唑藍(MTT)購自Sigma公司;超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒(Ann Arbor,MI)、過氧化氫酶(CAT)試劑盒(碧云天)、蛋白質羰基含量測定試劑盒(Sigma-Aldrich)均購于碧云天生物研究所;過氧化氫(質量分數(shù)30%)為國藥集團化學試劑有限公司提供。

      1.2 主要儀器設備

      CO2培養(yǎng)箱,日本SANYO公司;Infinite M200 Pro型酶標儀,瑞士Tecan公司;超速冷凍離心機,Eppendorf公司;凈化工作臺;倒置顯微鏡及照相系統(tǒng)等。

      1.3 荷葉總黃酮提取及含量的測定[11]

      1.3.1 荷葉總黃酮提取 采摘新鮮荷葉室溫陰干、粉碎后,稱取200 g荷葉粉末,按料液比1 ∶30,加入體積分數(shù)75%的乙醇水溶液熱回流提取,提取溫度為60 ℃,每次浸提2 h,共3次,提取液過濾后減壓濃縮定容至50 ml,此為荷葉總黃酮供試液。

      1.3.2 蕓香苷標準曲線的制作[11] 用乙醇配制不同濃度的蕓香苷標準溶液(0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/mL),各吸取1 mL 后加入5%亞硝酸鈉0.3 mL,搖勻,避光反應5 min,依次加入10%硝酸鋁0.3 mL,4%氫氧化鈉2 mL,混勻放置15 min 后,在波長510 nm處測定其吸光值。以蕓香苷濃度為橫坐標,吸光值為縱坐標,繪制蕓香苷標準曲線。

      1.3.3 荷葉總黃酮含量的測定 取供試液1 mL,按照標準曲線的測定方法,在510 nm處測定吸光度。根據(jù)回歸方程計算荷葉中總黃酮提取率:

      總黃酮提取率=C×N×Vm×100%。

      式中:C為總黃酮質量濃度,mg/mL;V為提取液體積,mL;N為稀釋倍數(shù);m為荷葉質量,g。

      1.4 PC12細胞培養(yǎng)

      用含5% 胎牛血清、10% 馬血清、100 U/mL青霉素和100 μg/mL 鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)液,37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)細胞,觀察細胞生長狀態(tài),每3 d傳代1次。待細胞生長至融合率達80%時,用0.25%胰酶消化細胞,調整適當?shù)募毎芏冉臃N于細胞培養(yǎng)板進行各項指標測定。

      1.5 荷葉總黃酮單獨給藥對正常PC12細胞的影響

      取對數(shù)生長期細胞,計數(shù)后調整細胞數(shù)至5×104個接種于96孔板,培養(yǎng)16 h。加入不同濃度的荷葉總黃酮樣品0、20、40、80 g/mL組,每組設3個復孔。處理6 h后,吸去上清,每個孔加入20 μL的MTT工作液,于二氧化碳培養(yǎng)箱內培養(yǎng)4 h,加入100 μL MTT終止液,完全溶解后,使用酶標儀于550 nm 處測定吸光度,計算細胞生長率。

      1.6 荷葉總黃酮對PC12細胞凋亡率的影響

      取對數(shù)生長期細胞,計數(shù)后調整細胞數(shù)至5×104個接種于96孔板,培養(yǎng)16 h。分別設正常組(不加藥物正常培養(yǎng)的細胞),石榴籽油0.5、1、2、4 mg/mL組,同時設無細胞的空白對照組,每組設3個復孔。細胞接種0.5 h后,加入H2O20.5 mmol/L。處理6 h后,吸去上清,每個孔加入20 μL的MTT工作液,于二氧化碳培養(yǎng)箱內培養(yǎng)4 h,加入100 μL MTT終止液,完全溶解后,使用酶標儀于550 nm處測定吸光度,計算細胞生長率。

      1.7 荷葉總黃酮對氧化應激的PC12細胞中SOD、CAT活力以及MDA、蛋白質羰基含量的影響

      取對數(shù)生長期PC12細胞,計數(shù)后每孔接種6×105個細胞于6孔板,培養(yǎng)16 h后,加入不同濃度的樣品溶液,0.5 h后,加入H2O2處理6 h,吸去上清,完成給藥及H2O2處理后,采用細胞刮徹底收集細胞,用預冷的PBS洗滌,超聲破碎細胞,4 ℃下8 000 r/min離心15 min,收集上清液按照試劑盒方法測定細胞勻漿中SOD、CAT活力及MDA、蛋白質羰基含量。

      1.8 Caspase-3活力檢測

      取對數(shù)生長期PC12細胞,每孔接種1×106個細胞于6孔板,培養(yǎng)16 h后,倒掉舊培養(yǎng)基,加入不同濃度的樣品溶液,0.5 h后,加入濃度為0.5 mmol/L H2O2處理6 h,吸去上清,采用預冷的PBS沖洗細胞并將細胞刮入離心管中,4 ℃下10 000 r/min離心10 min,將上清棄掉,收集的細胞按照試劑盒方法測Caspase-3 活力。

      1.9 PC12細胞Bax和Bcl-2 mRNA 表達變化檢測(real time RT-PCR)

      取對數(shù)生長期PC12細胞,接種3×106個細胞于4 mL培養(yǎng)基中,培養(yǎng)16 h后,倒掉舊培養(yǎng)基,設置空白組、對照組,向樣品組加入不同濃度的樣品溶液,放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)30 min后,加入濃度為0.5 mmol/L H2O2培養(yǎng)6 h,按照 TRIzol 法提取細胞總RNA進行濃度測定,D260 nm/D280 nm鑒定純度,跑RNA膠看是否降解。取2 μg RNA反轉錄成cDNA后PCR擴增。Bax的引物序列為上游:5′-CTGCAGAGGATGATTGCTGA-3′,下游:5′-GAGGAAGTCCAGTGTCCAGC-3′;Bcl-2引物序列為上游:5′-ATCTTCTCCTTCCAGCCTGA-3′,下游:5′-TGCAGCTGACTGGACATCTC-3′;GAPDH的引物序列為上游:5′-CACTCACGGCAAATTCAACGGCA-3′,下游:5′-GACTCCACGACATACTCAGCAC-3′。反應體系及條件:25 μL預混合Ex Taq,cDNA 4 μL,1 μL熒光染料,上、下游引物各1 μL 以及9 μL蒸餾水混合后置入96孔板中。94 ℃預變性10 min;94 ℃變性15 s,55 ℃復性15 s,72 ℃延伸30 s,擴增30個循環(huán);72 ℃延伸1 min后,進行光密度積分值分析,與內參照GAPDH產物的光密度積分值之比作為相對含量值。

      1.10 統(tǒng)計學分析

      所有試驗均重復3次,各試驗數(shù)據(jù)均以平均值±標準差表示,數(shù)據(jù)采用SPSS 10.0軟件進行處理。

      2 結果與分析

      2.1 荷葉總黃酮含量測定

      荷葉中除了含有碳水化合物、脂質、蛋白質等常規(guī)成分外,還富含大量的黃酮類化合物,根據(jù)蕓香苷標準曲線y=0.003x-0.013 9,r=0.999 9,求得荷葉中總黃酮提取率為5.64%(干荷葉)。這比葉思平報道的超聲提取荷葉所得總黃酮的得率為10.55%要低[12],可能是和提取時間與提取方式有關。

      2.2 荷葉總黃酮單獨給藥對正常PC12細胞的影響

      荷葉總黃酮各劑量組(20、40、80 μg/mL)預孵育6 h后細胞存活率分別為(103.21±11.65)%、(98.12±9.23)%和(95.43±13.65)%,正常對照組細胞存活率為(100±17.36)%,各給藥組與對照組相比沒有顯著性差異(P>0.05),如圖1所示,表明荷葉總黃酮本身對正常PC12細胞沒有損傷。

      2.3 不同濃度荷葉總黃酮對PC12細胞凋亡率的影響

      如圖2所示,與正常對照組相比,H2O2模型組細胞存活率為(38.45±13.21)%,加入20、40、80 μg/mL的荷葉總黃酮后,其細胞存活率分別為(43.45±9.12)%、(67.43±9.12)%和(78.45±21.34)%。結果表明,與模型組相比受試藥組細胞凋亡比率明顯降低,且存在劑量依賴關系,荷葉總黃酮具有抑制H2O2誘導PC12細胞損傷的作用。

      2.4 荷葉總黃酮對過氧化氫損傷的PC12細胞中SOD、CAT活力以及MDA、蛋白質羰基含量的影響

      由圖3可見,加入H2O2后,與空白對照組相比,細胞培養(yǎng)液中MDA與蛋白質羰基含量明顯升高,CAT與SOD活性降低,細胞存活率降低,荷葉總黃酮處理后,CAT活性隨著給藥濃度的增大而升高。MDA與蛋白質羰基含量隨著給藥濃度的升高而降低,但是SOD活性隨著給藥濃度的升高變化不大。說明荷葉總黃酮達到保護過氧化氫損傷細胞的作用可能與CAT有關。

      2.5 [JP4]荷葉總黃酮對H2O2損傷PC12細胞Caspase-3活性的影響

      試驗結果表明,與對照組相比,模型組中活化的Caspase-3水平升高;與模型組相比,荷葉總黃酮(20、40、80 μg/mL)試驗組的Caspase-3水平均有不同程度的降低,且荷葉總黃酮對Caspase-3活性降低的作用具有劑量依賴性(圖4)。試驗結果表明,荷葉總黃酮抗凋亡作用可能與其調節(jié)Caspase級聯(lián)反應的激活有關。

      2.6 荷葉總黃酮對H2O2損傷PC12細胞Bax和Bcl-2mRNA 表達的影響

      以GAPDH為內參照, 正常對照組Bax和Bcl-2 mRNA的表達為100%,其他各組與其比較得百分比。結果表明,H2O2損傷組PC12細胞Bcl-2 mRNA的表達水平比正常對照組降低。預先不同濃度荷葉總黃酮保護后Bcl-2 mRNA的表達較H2O2損傷組增加,而Bax mRNA的表達為H2O2損傷組比正常對照組升高,給藥保護后Bax mRNA的表達顯著減小。

      3 結論

      本研究中,PC12細胞經過H2O2處理后,細胞存活率下降,MDA與蛋白質羰基含量明顯升高,CAT與SOD活性降低;經過荷葉總黃酮預處理后各項指標均有逆轉,細胞存活率提高,MDA與蛋白質羰基含量降低,CAT活性提高,表明荷葉總黃酮對H2O2誘導的PC12細胞損傷具有明顯的保護作用。經過給藥處理后,其SOD活性并無顯著變化,這就不能有效地清除自由基,可以推測荷葉總黃酮活性組分進入細胞后阻止H2O2介導的氧化損傷所起的作用不顯著。

      研究表明,氧化應激能夠觸發(fā)線粒體通路的細胞凋亡,Bcl-2家族中的蛋白在此通路中發(fā)揮著重要的作用。其中包括促凋亡蛋白Bax、抗凋亡蛋白Bcl-2。Bcl-2/Bax的比例被認為是確定細胞是存活還是死亡的關鍵因素,包括PC12細胞。已經被證實Bcl-2與Bax可能通過控制線粒體膜滲透性變化,從而促進細胞色素c的釋放,最終導致Caspase-3的級聯(lián)反應引起細胞的凋亡[13-14]。本試驗研究表明,用H2O2處理后能夠降低抗凋亡蛋白Bcl-2表達量而提高促凋亡蛋白Bax表達量,而加入荷葉總黃酮后,其變化正好相反,即Bcl-2/Bax二者比例較之模型組提高,說明荷葉總黃酮通過調節(jié)Bcl-2和Bax的表達來實現(xiàn)對H2O2損傷PC12細胞凋亡的保護作用,同時進一步證明荷葉總黃酮對PC12細胞保護作用與細胞凋亡線粒體通路相關。

      細胞凋亡過程與一系列的生物化學變化有關,這其中包括Caspase家族蛋白的激活,Caspase-3作為細胞凋亡程序中最下游的調控蛋白,對細胞凋亡起著關鍵的作用[15]。本研究中發(fā)現(xiàn)模型組中H2O2能夠提高Caspase-3活性程度,但是當加入不同濃度的荷葉總黃酮后,Caspase-3活性明顯降低。這充分說明了荷葉總黃酮通過抑制Caspase-3的活化而最終達到對H2O2損傷的PC12細胞的保護作用。

      綜上所述,荷葉總黃酮可能通過提高抗凋亡蛋白Bcl-2表達,降低促凋亡蛋白Bax表達,最終導致Caspase-3的級聯(lián)反應有效地抑制H2O2誘發(fā)的PC12細胞凋亡,產生良好的神經元保護作用。本研究為揭示荷葉總黃酮的作用靶點提供了思路,為進一步的研究闡明了其作用機制。

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