酶法提取10—脫乙?；涂ǘ、蟮墓に噧?yōu)化

楊文婷+江明+朱文婷+韋琴

摘要：采用纖維素酶法提取曼地亞紅豆杉中的10-脫乙?；涂ǘ、螅?0-DAB），并對酶處理的條件進行優(yōu)化。以10-DAB提取率為指標，考察酶用量、酶處理時間、酶處理溫度及pH值等因素對提取率的影響，通過單因素試驗及響應面試驗得出纖維素酶法提取10-DAB的最佳條件，并結(jié)合實際進行優(yōu)化。結(jié)果得到酶處理最佳條件為：纖維素酶用量2%、酶處理時間3 h、酶處理溫度42 ℃、pH值5.0，此時10-DAB提取率為0.5297%±0.001 067%，與模型預測值0.533 6%接近，說明工藝條件穩(wěn)定，模型可靠。

關(guān)鍵詞：曼地亞紅豆杉；10-脫乙?；涂ǘ、螅焕w維素酶；響應面法

中圖分類號： R284.2 文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2016）09-0303-04

10-脫乙?；涂ǘ、螅?0-deacetylbaccatin Ⅲ，簡稱10-DAB）是合成抗癌藥物紫杉醇和多西紫杉醇的重要原料[1-3]。紫杉醇為治療多種晚期癌癥的藥物之一，因受到原材料來源的限制，其原料藥市場總體呈現(xiàn)供不應求的趨勢[4]，其制備方法有多種，而以10-DAB作為原料半合成是最具實用價值的方法之一，目前已占紫杉醇原料藥總產(chǎn)量的2/3以上[5-6]，對于緩解紅豆杉資源的短缺具有非常重要的現(xiàn)實意義。10-DAB主要從紅豆杉植株的枝葉中提取，但提取率通常比較低[7-10]，本研究利用纖維素酶對植物細胞壁進行水解，以促進10-DAB的溶出[11-12]，并通過響應面試驗設計優(yōu)化酶處理條件，從而確定酶法預處理的最佳條件[13-15]。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

曼地亞紅豆杉（產(chǎn)地江蘇）；石油醚（30～60 ℃），95%乙醇，二氯甲烷，甲醇，檸檬酸，檸檬酸鈉，以上化學試劑均為分析純；400～800 U/g纖維素酶（Sanland Chemical Co.LTD），400～800 U/g果膠酶（Biosharp）。

752型紫外可見分光光度計（上海光譜儀器有限公司），KQ-50E型超聲波清洗器（江蘇省昆山市超聲儀器有限公司），YXQ-LS-50S11酸度計（上海精密科學儀器有限公司）

1.2 試驗方法

1.2.1 標準曲線的制作 精確稱取10-DAB標準品5 mg，定容至50 mL容量瓶中，得到0.1 mg/mL 10-DAB母液；再分別精確量取該母液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，稀釋至5 mL，于227 nm處測定吸光度。

1.2.2 原材料的預處理 將曼地亞紅豆杉植株洗凈風干，40 ℃ 干燥72 h，粉碎過30目篩，再以1 ∶5的比例用石油醚浸漬6 h，以初步脫脂及色素，陰涼處密封保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 單因素試驗 準確稱取曼地亞紅豆杉粉末1 g，加入1%果膠酶及一定比例纖維素酶，再加入一定pH值的緩沖溶液至20 mL，振蕩混勻之后分別于一定溫度水浴一定時間，所得樣品5 000 r/min離心10 min，棄上清；以料液比1 g ∶30 mL 加入無水乙醇超聲處理30 min，取無水乙醇層去除溶劑，殘留物加15 mL蒸餾水混懸后用石油醚萃取至醚層接近無色，分液棄醚層，用10 mL二氯甲烷萃取，分離二氯甲烷層，通風櫥中自然揮干除去溶劑，得干燥提取物[12]；精確量取10 mL甲醇溶解，并適當稀釋，于227 nm處測吸光度。

初步擬定酶處理條件為：纖維素酶用量2%、提取溫度為40 ℃、pH值5.0、酶處理時間2 h，其他條件不變，改變其中1個條件進行單因素試驗，酶處理溫度分別為20、30、40、50、60 ℃，酶處理時間分別為1、2、3、4、5 h，纖維素酶用量分別為1%、2%、3%、4%、5%，緩沖液pH值分別為4.0、4.5、5.0、5.5、6.0。不同pH值溶液用不同比例的0.1 mol/L檸檬酸溶液和0.1 mol/L檸檬酸鈉溶液配制，并用酸度計將pH值調(diào)至所需范圍。

1.2.4 響應面試驗 根據(jù)中心組合設計原理[13-14]，由單因素試驗考察的結(jié)果選取酶預處理溫度（x1）、酶處理時間（x2）、pH值（x3）為自變量，利用Design-Expert 8.0.5軟件，根據(jù)Box-Behnken模型，以10-DAB提取率為響應值，設計3因素3水平共17組試驗，響應面設計的因素與水平見表1。

2 結(jié)果與分析

2.1 標準曲線的制作

以10-DAB濃度為橫坐標、吸光度為縱坐標，繪制標準曲線，標準曲線的方程為D=32.243C-0.0151，r2=0.998。由圖1可知，10-DAB 的濃度在0～0.02 μg/mL范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好。

2.2 單因素試驗

2.2.1 酶處理溫度 由圖2可知，在20～40 ℃溫度范圍內(nèi)，隨著溫度的升高，10-DAB的提取率提高；超過40 ℃后，10-DAB 的提取率呈下降趨勢。說明纖維素酶的活力在40 ℃ 左右較高，10-DAB的溶出率較高。溫度較高時，10-DAB的提取率降低可能是由于10-DAB的熱不穩(wěn)定性，在溫度較高的條件下易降解或發(fā)生異構(gòu)化。

2.2.2 酶處理時間 由圖3可知，10-DAB的提取率隨酶預處理時間的延長而升高。酶預處理3 h之后，10-DAB的提取率增幅變小，酶預處理5 h時甚至降低了。表明酶預處理3 h時幾乎能將10-DAB最大化提取，時間太長反而對提取不利，所以將酶預處理時間控制在3 h之內(nèi)。

2.2.3 纖維素酶用量 由圖4可知，10-DAB的提取率隨纖維素酶用量的增加而升高。在纖維素酶用量達到2%之后，10-DAB的提取率趨近平緩，說明纖維素酶用量達到2%以后，提取率變化不明顯。從節(jié)約資源的角度考慮，將纖維素酶用量確定為2%。

2.2.4 pH值 由圖5可見，在pH值為 4.0～5.0范圍內(nèi)，10-DAB的提取率隨pH值的升高而增大；當pH值超過5.0時，提取率逐漸下降。表明所用酶的最適pH值在5.0左右。

2.3 響應面試驗

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，選取酶預處理溫度（x1）、酶處理時間（x2）、pH值（x3）為3個因素進行響應面試驗設計，因素和水平選取情況見表1。以10-DAB提取率為響應值，設計響應面試驗，結(jié)果見表2。利用Design Expert軟件，得到10-DAB提取率與3個因素關(guān)系的回歸方程：10-DAB提取率y=0.52+0.035x1-0.016x2 +0.017x3+0.008 5x1x2-0.017x1x3+0.006x2x3-0.036x12-0.06x22-0.088x32。分析結(jié)果（表3）顯示，回歸模型的R2為0.982 8，說明此模型能解釋98%的響應值變化，模型擬合程度良好。由回歸模型方差分析結(jié)果可知，方程的一次項x1、x3，二次項x12、x22、x32對10-DAB提取率的影響達極顯著水平，一次項x2、交互項x1x3對10-DAB提取率的影響達顯著水平。此外還可得出各因素對10-DAB提取率影響從大到小依次為酶預處理溫度（x1）>pH值（x2）>酶處理時間（x3）。等高線的形狀反映交互因素對提取率的影響是否顯著，圓形表明因素交互作用不顯著，馬鞍形和橢圓形則表示因素交互作用顯著。圖6、圖7、圖8直觀地呈現(xiàn)了各因素相互作用的響應面的等高線圖和3D分析圖。從響應面模型的等值線和最高點可以得到，在所選擇的范圍內(nèi)存在極值，既是響應面模型的最高點，同樣也是等值線最小橢圓的中心點。由此可見，溫度、pH值的交互作用對10-DAB提取率的影響最為顯著，其顯著關(guān)系可通過等高線的形狀判斷，橢圓長軸和短軸長度相差越大，影響越顯著；接近圓形，影響不顯著。

2.4 驗證試驗

回歸模型擬合出最佳條件為：溫度42.32 ℃、酶處理時間2.95 h、pH值5.03，根據(jù)實際情況適當調(diào)整為：溫度42 ℃、酶處理時間3 h、pH值 5.0，在此條件下，平行試驗3次，所得10-DAB 提取率為0.529 7%±0.001 067%，RSD=1.51%，重復性較好，條件穩(wěn)定。而理論預測值為0.533 6%，與實際提取率接近，進一步說明模型可靠、有效。

3 結(jié)論

10-DAB為合成抗癌藥物紫杉醇的重要中間體，主要從紅豆杉枝葉中提取，一般采用有機溶劑提取法、加熱回流提取法、超聲波法等方法提取，但提取率較低[8-10，16]，而酶法提取具有條件溫和、提取率較高等優(yōu)點，有利于紅豆杉資源的充分利用[11-12]；并利用響應面中的Box-Behnken模型優(yōu)化提取工藝，克服傳統(tǒng)的正交設計或均勻設計無法在連續(xù)水平上優(yōu)化工藝參數(shù)的缺點[13-15]。所得最佳工藝條件為：酶處理時間2.95 h、酶處理溫度42.32 ℃、pH值5.03、酶用量2%，在此條件下10-DAB的提取率為0.529 7%±0.001 067%，與預測值0.533 6%接近。在后續(xù)研究中，還可以結(jié)合酶的固定化技術(shù)，以實現(xiàn)酶的重復利用，以進一步提高該方法在工業(yè)上廣泛應用的可行性。

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