劉輝+盧揚(yáng)+李俊+呂都+陳朝軍+雷尊國(guó)+劉永翔

摘要：多酚氧化酶是植物體內(nèi)酶促褐變的關(guān)鍵酶。為篩選安全無毒、處理簡(jiǎn)單的多酚氧化酶抑制劑，以苦蕎莖葉乙醇提取物、水提取物、磷酸鹽緩沖液提取物為褐變抑制劑，研究其對(duì)黑美人馬鈴薯多酚氧化酶的抑制效果。結(jié)果表明，3種提取物均對(duì)馬鈴薯多酚氧化酶具有顯著的抑制效果，當(dāng)抑制劑體積為120 μL時(shí)，酶活抑制率分別為70.14%、73.38%、84.53%，表明磷酸鹽緩沖液提取物的抑制效果最佳。對(duì)3種提取物中總黃酮、蛋白質(zhì)含量進(jìn)行定量，結(jié)果表明磷酸鹽緩沖液提取物中不僅具有較高含量的黃酮類物質(zhì)，同時(shí)蛋白質(zhì)含量也較高，推測(cè)磷酸鹽緩沖液提取物抑制效果最好的原因就在于此。研究結(jié)果可為探尋馬鈴薯多酚氧化酶的天然抑制劑和馬鈴薯深加工過程中褐變控制提供新的思路和參考依據(jù)。

關(guān)鍵詞：苦蕎；莖葉；多酚氧化酶；馬鈴薯；抑制劑

中圖分類號(hào)： TS205 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2016）09-0307-03

“黑美人”馬鈴薯是一種表皮與果肉均呈黑紫色的馬鈴薯品種，它的蛋白質(zhì)、還原糖、有機(jī)酸含量高于普通馬鈴薯，而脂肪含量較低，從而具有高營(yíng)養(yǎng)、低能量的特點(diǎn)，是一種健康、營(yíng)養(yǎng)的食品原料。同時(shí)，“黑美人”馬鈴薯富含普通馬鈴薯所缺乏的花青素、維生素C、胡蘿卜素等抗氧化物質(zhì)，使其兼具抗癌、抗衰老、美容和防止高血壓等多種保健作用[1]。馬鈴薯中富含的多酚類物質(zhì)是多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）引起酶促褐變的底物，而酶促褐變中產(chǎn)生的黑色素對(duì)馬鈴薯的色澤、品質(zhì)造成很大的影響，從而降低其深加工產(chǎn)品的質(zhì)量和市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力。因此，開發(fā)出合適的褐變抑制劑，對(duì)馬鈴薯加工過程中的褐變過程加以控制，對(duì)提高黑美人馬鈴薯的應(yīng)用價(jià)值和其加工產(chǎn)品的質(zhì)量、競(jìng)爭(zhēng)力具有重要的意義[2]。

植物提取物作為天然的抑制劑，具有天然無毒特性，更易被消費(fèi)者所接受，故近年來成為研究的熱點(diǎn)[3-4]?？嗍w源于我國(guó)西南地區(qū)，在全國(guó)廣泛種植，但是分布較集中，貴州地區(qū)苦蕎常年種植面積達(dá)4.6萬hm2。蕎麥種子已經(jīng)被開發(fā)成各種產(chǎn)品，如苦蕎米飯、苦蕎茶、苦蕎酥餅等，而蕎秸（葉、稈）多作為柴火燒掉，如能加以開發(fā)利用，其經(jīng)濟(jì)效益將會(huì)非常可觀[5]。苦蕎莖葉中的主要有效活性成分是黃酮類物質(zhì)（蕓香苷、槲皮素、山奈酚等），其醇提物表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗氧化性，具有抗癌變、降脂、降壓、美容等功效[6-7]。近年來，對(duì)于苦蕎的研究主要集中在成分及藥用分析，很少涉及酶學(xué)領(lǐng)域，苦蕎莖葉提取物對(duì)植物PPO抑制作用的報(bào)道甚少，特別是酶的抑制作用動(dòng)力學(xué)的研究幾乎還是空白。在篩選植物體的多酚氧化酶抑制劑的試驗(yàn)中，研究發(fā)現(xiàn)苦蕎莖葉提取物可以對(duì)多酚氧化酶產(chǎn)生抑制作用。本研究采用50%乙醇提取法、水提取法及磷酸鹽緩沖液提取法分別提取苦蕎莖葉中的PPO抑制劑，比較這3種提取物對(duì)馬鈴薯PPO的抑制效應(yīng)，為苦蕎莖葉提取物在食品保鮮、褐變控制方面的應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

黑美人馬鈴薯和苦蕎莖葉均由貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所提供；蕓香苷購(gòu)自上海永葉生物科技有限公司，其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。所需儀器包括Allegra 25R高速冷凍離心機(jī)（美國(guó)貝克曼公司）、SJIA-10N低溫真空冷凍干燥器（寧波市雙嘉儀器有限公司）、XL-30C超微粉碎機(jī)（杭州旭眾機(jī)械設(shè)備有限公司）、UV-2100雙光束紫外可見分光光度計(jì)[北京北分瑞利分析儀器（集團(tuán)）有限責(zé)任公司]、RE-52AA 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）等。

1.2 方法

1.2.1 黑美人馬鈴薯PPO的提取與純化 黑美人馬鈴薯多酚氧化酶的提取與純化參考彭益強(qiáng)等的方法[8]。

1.2.2 苦蕎莖葉的提取方式 參考曹艷萍等的方法[9]：苦蕎莖葉在低溫真空冷凍干燥器中干燥3～4 h后，用超微粉碎機(jī)加工成粉末。取粉末20 g，加200 mL蒸餾水和200 mL乙醇[水提取物和磷酸鹽提取物僅加400 mL蒸餾水或磷酸鹽緩沖液（0.2 mol/L，pH=6.8）]于大錐形瓶中，攪拌均勻，置于超聲波清洗器中，50 ℃下超聲波萃取1.5 h，用布氏漏斗抽濾得濾液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器蒸發(fā)除去乙醇及大部分水分得濃縮液，用冷凍干燥器干燥成粉末。取凍干粉配成15 mg/mL溶液，15 000 r/m離心10 min，除去沉淀備用。

1.2.3 苦蕎莖葉提取物中總黃酮、蛋白質(zhì)定量分析 黃酮類物質(zhì)含量測(cè)定：參考曹艷萍的方法[10]進(jìn)行。

蛋白質(zhì)定量：參照張午燕的方法[11]進(jìn)行。

1.2.4 PPO動(dòng)力學(xué)研究方法 參照林敏等的方法[12]進(jìn)行，將其中的底物L(fēng)-DOPA換成鄰苯二酚，具體操作如下：將pH值6.8的磷酸緩沖液、0.2 mol/L的鄰苯二酚及PPO液在30 ℃的水浴中預(yù)保溫，在比色皿中依次加入2.0 mL的磷酸緩沖液、0.3 mL的酶液、0.5 ml濃度為0.2 mol/L的鄰苯二酚溶液（空白對(duì)照為2.5 mL的磷酸緩沖液、0.3 mL的酶液），在反應(yīng)組和空白對(duì)照組中分別加入0、15、30、60、120、240 μL的3種苦蕎莖葉提取物，用UV-2100雙光束紫外可見分光光度計(jì)在413 nm處比色，每4 s計(jì)數(shù)1次，記錄各時(shí)刻的吸光度D413 nm，將在相同時(shí)刻測(cè)得的2個(gè)D413 nm，相減并作圖，得苦蕎莖葉提取物對(duì)黑美人馬鈴薯PPO活性影響的動(dòng)力學(xué)特征曲線。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，測(cè)定結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，以P<0.05 表示有顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 苦蕎莖葉提取物對(duì)馬鈴薯多酚氧化酶酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)曲線的影響

從圖1-A中可以看出，水提取物在15 μL時(shí)，對(duì)PPO活性抑制效果不明顯；在添加量為30 μL時(shí)，抑制效果才顯現(xiàn)，并在40 s時(shí)，PPO活性受到完全抑制；在添加量為60 μL時(shí)，在32 s時(shí)PPO活性受到完全抑制；當(dāng)苦蕎莖葉水提取物含量達(dá)到120 μL時(shí)，16 s時(shí)即使馬鈴薯PPO活性受到抑制；在添加量為240 μL時(shí)，基本使馬鈴薯PPO完全失活。

從圖1-B中可以看出，苦蕎莖葉醇提取物在15 μL時(shí)對(duì)馬鈴薯的抑制效果已經(jīng)開始顯現(xiàn)，但是在1 min的測(cè)定時(shí)間內(nèi)，沒有使PPO活性完全受到抑制；在添加量為30、60、120 μL 時(shí)使PPO完全失活的時(shí)間分別為40、28、16 s；在240 μL 時(shí)，馬鈴薯PPO活性完全受到抑制。

從圖1-C中可以看出，苦蕎莖葉磷酸鹽提取物在15 μL時(shí)對(duì)馬鈴薯的抑制效果顯著，在48 s時(shí)可使馬鈴薯PPO完全失活；在添加量為30、60、120 μL時(shí)使PPO完全失活的時(shí)間分別為32、24、12 s；在240 μL時(shí)，馬鈴薯PPO活性完全受到抑制。

3種苦蕎莖葉提取物對(duì)PPO活性影響的動(dòng)力學(xué)曲線（圖1）表明：馬鈴薯PPO氧化鄰苯二酚的反應(yīng)和產(chǎn)物的生成速度初始較快，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，PPO的活性逐漸降低，曲線斜率逐漸降低，這是由于生成的醌類物質(zhì)使多酚氧化酶活性受到抑制的結(jié)果，即存在反饋抑制作用。說明3種提取物對(duì)馬鈴薯PPO的抑制作用都是可逆的。

2.2 3種提取物對(duì)馬鈴薯PPO活性影響的比較

表1結(jié)果表明，3種提取物對(duì)黑美人馬鈴薯PPO存在顯著的抑制效果，且提取物間差異顯著，其中以磷酸鹽提取物的抑制效果最佳。

2.3 3種提取物成分分析

由表2可以看出，磷酸鹽提取物中的蛋白質(zhì)濃度與總黃酮濃度均較高，水提取物中的總黃酮含量最低。

3 討論

苦蕎莖葉中的主要有效活性成分是黃酮類，已從苦蕎莖葉中分離鑒定出蕓香苷、槲皮素、山奈酚等多種黃酮類成分[9，11]。劉文山等發(fā)現(xiàn)黃酮物質(zhì)可抑制蘋果多酚氧化酶活性[13]。林敏等用柿葉提取物對(duì)馬鈴薯PPO的抑制效果進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)它可以非競(jìng)爭(zhēng)性地抑制PPO活性[12]。柿葉提取物中的主要有效活性成分是黃酮，它是一種抗氧化劑，可清除氧自由基，從而阻斷氧對(duì)PPO的激活。同時(shí)，黃酮結(jié)構(gòu)中的還原性羥基具有孤對(duì)電子，可與PPO分子中的Cu2+絡(luò)合，從而影響PPO的活性。

本試驗(yàn)研究結(jié)果表明：苦蕎莖葉水提物、50%乙醇提取物、0.2 mol/L pH值6.8的磷酸鹽緩沖液提取物對(duì)黑美人馬鈴薯PPO活性均存在抑制作用，表明苦蕎莖葉含有多種PPO抑制成分；磷酸鹽提取物的抑制效果強(qiáng)于醇提取物與水提取物；3種提取物對(duì)PPO的抑制作用均為可逆的。Kubglomsong等發(fā)現(xiàn)從米糠中提取的蛋白質(zhì)，在pH值為4～5的環(huán)境中，對(duì)馬鈴薯塊莖PPO具有較強(qiáng)的抑制效應(yīng)[14]。同時(shí)，對(duì)米糠提取物中的有效成分進(jìn)行高效液相色譜分離并定量分析，發(fā)現(xiàn)原兒茶酸、香草酸、香豆酸等對(duì)馬鈴薯PPO抑制效果不一致，混合物的抑制效果最佳[2]。另外發(fā)現(xiàn)，各種氨基酸對(duì)PPO也具有抑制效應(yīng)[15]。本試驗(yàn)對(duì)3種提取物中的蛋白質(zhì)和總黃酮含量進(jìn)行了測(cè)定，結(jié)果表明磷酸鹽提取物中的蛋白質(zhì)含量最高，而總黃酮含量也達(dá)到58.4 mg/g，而醇提取物中的總黃酮含量最高，達(dá)到71.4 mg/g（表2）。因此，磷酸鹽提取物對(duì)馬鈴薯PPO的抑制效果最佳，很可能是因?yàn)槠渫瑫r(shí)含有較高含量的蛋白質(zhì)和總黃酮。乙醇提取物中的蛋白質(zhì)含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于水提取物，而醇提取物對(duì)馬鈴薯PPO的抑制效果卻強(qiáng)于水提取物，表明苦蕎莖葉中對(duì)PPO產(chǎn)生抑制作用的主要有效成分是黃酮類物質(zhì)。動(dòng)物藥理試驗(yàn)表明，苦蕎葉提取物可提高紅細(xì)胞超氧化物歧化酶活性，對(duì)羥自由基和超氧陰離子均有較強(qiáng)的清除能力[10，16]。黃酮類化合物含有能提供活潑質(zhì)子的多酚結(jié)構(gòu)，并以C6—C3—C6結(jié)構(gòu)為基本母核[17]，因此，推測(cè)黃酮類物質(zhì)是通過原子的空間排列位阻或改變PPO酶蛋白的空間結(jié)構(gòu)，從而阻止底物與酶的結(jié)合，其中黃酮化合物中羥基的數(shù)目和空間排列是其抑制作用的決定因素，一般羥基數(shù)目越多，抑制效果越好，羥基鄰位排列比間位排列的抑制作用更佳[18]。

經(jīng)過對(duì)苦蕎莖葉提取物抑制馬鈴薯PPO作用的動(dòng)力學(xué)研究，推測(cè)其抑制機(jī)理與其抗氧化特性機(jī)理及蛋白質(zhì)、氨基酸與多酚、PPO的相互作用有關(guān)。參考Sukhonthara等的研究結(jié)果[2，12，15]，筆者認(rèn)為其可能的機(jī)制為：（1）苦蕎莖葉提取物對(duì)氧自由基的清除作用既阻斷了氧與PPO反應(yīng)的引發(fā)，同時(shí)，削弱了PPO的供氧作用，阻斷了氧對(duì)PPO的激活，從而抑制了褐變的強(qiáng)度；（2）黃酮類化合物中的還原性羥基中的孤對(duì)電子，可與PPO分子中的Cu2+發(fā)生絡(luò)合反應(yīng)，從而達(dá)到影響PPO酶活性的效果；（3）提取物中的蛋白質(zhì)、氨基酸可與褐變反應(yīng)的底物多酚發(fā)生反應(yīng)，形成有色物質(zhì)并與褐色相區(qū)別，從而阻斷了褐變反應(yīng)的發(fā)生，或者催化PPO氧化產(chǎn)物醌降解，從而減少褐變物質(zhì)的產(chǎn)生。

4 結(jié)論

苦蕎莖葉水提取物、醇提取物、磷酸鹽提取物對(duì)黑美人馬鈴薯PPO均具有顯著抑制效果，且均表現(xiàn)為可逆性抑制。在添加量為120 μL時(shí)，抑制率分別達(dá)到70.14%、73.38%、84.53%，表明磷酸鹽緩沖液提取物對(duì)黑美人馬鈴薯PPO的抑制效果最佳。

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